二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测定(1)

二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测定

实验室地点：3411

实验时间安排

9.20（第5周星期二）

8:30—10:00 第3组

10:00—11:30 第4组

9.21（第5周星期三）

14:30—16:00 第5组

16:00—17:30 第6组

9.22（第5周星期四）

8:30—10:00 第7组

9.23（第5周星期五）

14:30—16:00 第1组

16:00—17:30 第2组

实验指导

一、实验目的

1．掌握二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测量方法；

2．学会辩别荧光物质的分子荧光峰和拉曼散射峰；

3．熟悉岛津RF-5301（日立F-4500）荧光分光光度计的定性扫描方法及定性测量软件数据处理操作。

二、实验原理

任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱。由于斯托克斯位移，荧光发射波长总是大于激发波长。

在一定光源强度下，若保持激发波长ex λ不变，扫描得到的荧光强度与发射波长em λ的关系曲线，称为荧光发射光谱，它表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度；反之，保持em λ不变，扫描得到的荧光强度与ex λ的关系曲线，则

称为荧光激发光谱，它可以反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长值，所以，可用它来鉴别各种荧光物质。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关。

同一荧光物质的分子荧光发射光谱曲线的波长范围（和最大发射波长）不因它的激发波长值的改变而位移，由于这一荧光特性，如果固定荧光发射波长（λem），然后改变激发波长（λex），并以荧光强度F对激发光波长λex绘图即获得激发光谱曲线，从中能确定最大激发波长（λex）。反之，固定激发波长值，测定不同发射波长时的荧光强度，即得荧光发射光谱曲线和最大荧光发射波长值。

三、仪器和试剂

1、仪器荧光分光光度计（岛津RF-5301，日立F-4500）。它的主要技术指标如下：测量波长范围：220-900 nm，（200-900 nm）、光源：脉冲氙灯、测量模式：激发光谱，发射光谱，波长同步光谱，测量方式：定性、定量、三维扫描、荧光动力学

四面通石英比色皿一个（10mm x 10mm）、25 mL具塞比色管、移液管、吸耳球、洗瓶、吸水纸

2、试剂

(1) 二氯荧光素标准溶液

a 储备标准液(25mg/mL): 称取0.0125g 二氯荧光素（A.R），用0.01mol·L－1 NaOH溶液溶解后移入500mL容量瓶中并用0.10 mol·L－1 NaOH稀释至刻度。

b 工作标准液(0.10 mg/mL):取上述储备溶液10.00mL于一500mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度摇匀，配制成0.50mg/mL溶液。再移取0.50mg/mL溶液10.00mL于一50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度摇匀。

（2）1.0mol·L－1 NaOH

四、实验步骤

1．取25mL具塞比色管，加入上述二氯荧光素工作标准溶液5.00mL，然后加入1.0mol·L－1NaOH 1.0mL，用蒸馏水稀释到刻度摇匀。

2．打开计算机、打印机和荧光光度计主机，预热5分钟。

3．对荧光光度计进行仪器初始化。

4．依次在激发波长值分别为340nm /350nm /360nm，波长扫描范围为200-750nm，激发和发射波长狭缝宽度分别为5nm，响应时间为10nm，扫描速度为1200时扫描二氯荧光素的各发射光谱图，并且通过叠加的三份谱图分析和确定二氯荧光素的荧光发射峰。再确定最大发射波长值。同时查看其拉曼波长、瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。

5. 同理，固定最大发射波长扫描激发光谱图。从图中确定二氯荧光素的荧光激发峰。再确定最大激发波长值。

数据及处理

分别根据各自峰的特点，确定二氯荧光素最大激发波长、最大发射波长及指出拉曼峰、瑞利峰、双倍频峰。

显微镜荧光波长详解

人肉眼对光源波长的颜色感觉红色770-622 nm 橙色622~597 nm 黄色597~577 nm 绿色577~492 nm 蓝靛色492～455nm 紫色455～350nm

?常见显微镜滤光片的波长 在激发波长在Ex范围内才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景光的波长只有大于DM才能被观察到。 红色滤光片G-2A Ex 510-560 DM 575 BA 590 绿色滤光片B-2A Ex 450-490 DM 505 BA 520 蓝色滤光片UV-2A Ex 330-380 DM 400 BA 420 ?其它荧光染料介绍 【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2,?Cy3,?Cy5)】 Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。

Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。 【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】 存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】 耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。 注：由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。另外，多标记中对探针色彩区分程度的要求。例如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的区别明显。如果对灵敏度有更高的要求，则Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。 西美杰备有全面的二抗现货产品并能提供最完整的二抗产品线。主要二抗品牌为全球最大的二抗和底物生产厂商KPL以及前沿抗体生产商ProteinTech。针对荧光标记二抗，有FITC、TRITC、Rhodamine、PE、Cy3/5、AMCA、Dylight等多种荧光标记二抗；按照检测物种分，有抗人、大鼠、小鼠、猪、驴、绵羊、山羊、小鸡、马、兔、仓鼠、狗、牛，以及多种细菌类二抗；另外，还有IgG、IgA、IgM以及IgG(Fc)、IgG(ab’)2等不同类型抗体。 The role of filters in epi-fluorescence microscopy 在激发波长在Ex范围内才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景

荧光分光光度法测定荧光素钠的含量

荧光分光光度法测定荧光素钠的含量 一、实验目的 1.学习荧光分光光度法测定荧光素钠的分析原理。 2.掌握荧光分光光度计的操作技术和测定荧光素钠的方法。 二、实验原理 荧光分析法，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。 常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。 在稀溶液中，荧光强度I F 与物质的浓度c 有以下的关系： 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。 三、仪器及试剂 1．仪器 960荧光分光光度计； LC-UV 紫外检测器； 微量进样器 2．试剂 ① 二氯荧光素（分析纯）； ② 荧光素钠 四、操作步骤 1.标准溶液配制 准确称取0.05g 二氯荧光素标样，配制成2500ml 溶液，则此溶液浓度为0.05μm/mL ，分别移取此溶液2.0ml 、4.0ml 、6.0ml 、8.0ml ，于25ml 容量瓶中，bc I I F εφ0303.2=Kc I F =

并用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后，待测定各标准溶液的荧光强度。 2.荧光强度测定 (1)荧光光度计操作 开启220V稳压电源至220V； 打开主机电源开关。 检查氙灯电是否开启。 (2)二氯荧光素发光谱的绘制，参数设置如下： ①设定纵坐标 ②设定灵敏度； ③设定扫描速度； ④发射波长EMISSION Wavelength 250.0 nm； ⑤激发波长范围200-350 nm； ⑥将某一浓度的二氯荧光素标液置于试样池中； ⑦扫描得到激发光谱。 (3)标准溶液及样品的测定，参数设置如下： ①设定纵坐标 ②设定灵敏度； ③设定扫描速度； ④设定激发波长EXCITION Wavelength 496.0nm(从激发光谱曲线中)得到； ⑤发射波长范围EMISSION Wavelength 518nm； ⑥将1号标准溶液放入试样池中； ⑦扫描得到荧光光谱。 仪器开始扫描，得到1号标准溶液的荧光强度。其余4各标准溶液和样品液只要重复上述⑥⑦操作，就可以分别得到它们的荧光光谱。按各标液的荧光强度做出I-C工作曲线。 五、数据记录及计算 1.列表

显微镜荧光波长详解

?人肉眼对光源波长的颜色感觉 红色770-622 nm 橙色622~597 nm 黄色597~577 nm 绿色577~492 nm 蓝靛色492～455nm 紫色455～350nm ?常见显微镜滤光片的波长 在激发波长在Ex围才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景光的波长只有大于DM才能被观察到。 红色滤光片G-2A Ex 510-560 DM 575 BA 590 绿色滤光片B-2A Ex 450-490 DM 505 BA 520 蓝色滤光片UV-2A Ex 330-380 DM 400 BA 420

其它荧光染料介绍 【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】 Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。 Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。 【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】 存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。 【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】 耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA 可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量

各类荧光素的发射激发波长

Ｐｒｏｂｅ　Ｅｘ（ｎｍ）　Ｅｍ（ｎｍ）　ＭＷ　Ｎｏｔｅｓ　 Ｒｅａｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｐｒｏｂｅｓ　 Ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ　３２５　３８６　３３１　Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ　 Ａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ　３５０　４４５　３３０　Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ　 Ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ　３６０　４１０　３１７　Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ　 Ｃａｓｃａｄｅ　Ｂｌｕｅ　３７５；４００　４２３　５９６　Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ　 Ｌｕｃｉｆｅｒ　ｙｅｌｌｏｗ　４２５　５２８ ＮＢＤ　４６６　５３９　２９４　ＮＢＤ－Ｘ　 Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　（ＰＥ）　４８０；５６５　５７８　２４０　ｋ ＰＥ－Ｃｙ５　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　４８０；５６５；６５０　６７０ ａｋａ　Ｃｙｃｈｒｏｍｅ，　Ｒ６７０，　Ｔｒｉ－Ｃｏｌｏｒ，　Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｒｅｄ　ＰＥ－Ｃｙ７　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　４８０；５６５；７４３　７６７ ＡＰＣ－Ｃｙ７　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　６５０；７５５　７６７ ＰｈａｒＲｅｄ　 Ｒｅｄ　６１３　４８０；５６５　６１３ ＰＥ－Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ　 Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　４９５　５１９　３８９　ＦＩＴＣ；　ｐＨ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　 ＦｌｕｏｒＸ　４９４　５２０ ５８７　（ＡＰ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）　 ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ　５０３　５１２ ＴＲＩＴＣ　５４７　５７２　４４４　ＴＲＩＴＣ　 Ｘ－Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　５７０　５７６　５４８　ＸＲＩＴＣ　 Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ　Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ　５７０　５９０ ＰｅｒＣＰ　４９０　６７５ Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ　ｃｈｌｏｒｐｈｙｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ

主要荧光素一览表

（1）荧光素类 Fluorescein 标准荧光素（Reference standard）之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。 Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。 与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。 主要应用于聚焦激光扫描微阵列（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flow cytometry）。 FITC 异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，5-FITC较6-FITC更经常使用。 FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=）。与蛋白的结合力也强。 FITC具有荧光素衍生物的普遍特性。在水中易变坏，不能长久保存。 FITC-Oligo 广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序；FITC也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。 FAM 羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。 Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。 与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。 FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。 5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP（PE公司），也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。

常见荧光素

常见荧光素： （1）异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 （2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。 （3）四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。（4）镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。 （5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。 （6）多甲藻叶绿素蛋白（peridinin chlorophyll protein，PerCP）：PerCP 是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为 35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。 （7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）：可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA

常用染料的激发与发射(20201127111621)

常用荧光染料的激发和发射波长

备注：发射波长的颜色及频率

荧光染料的使用 吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。EB:染色DNA和RNA 荧光素双醋酸酯(FDA): FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧 光产生。5mgFDA溶于1ml丙酮中，避光4C下贮存，使用时取贮存液加入L甘露醇中. 使用时,使最终浓度为％荧光染料HO33342和若丹明123:活细胞双荧光染色观察细胞核和线粒体。一般的生物染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透性，染料才能进入细胞内。但有些活体染料能进入活细胞，并对细胞不产生毒性作用。荧光染料HO33342和若丹明123都是活体染料。Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，若丹明123能与线粒体进行特异的结合。采用两种荧光染料的混合染液可对一个活细胞的核和线粒体同时染色。 荧光组化实验中应注意的几个问题：1.每种荧光染料，均有自己的最适PH值，此 时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的PH值的缓冲液中进行。2. 一放荧光染色在20C以下时荧光比较稳定，温度升高

常出现温度猝灭。3．在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。4．一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。

荧光显微镜的原理和荧光显微镜结构特点

荧光显微镜的原理和荧光显微镜结构特点 发布时间:2011-06-14 荧光显微镜的原理和荧光显微镜结构特点 荧光显微镜的原理是什么？ 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光365nm或紫蓝光420nm)作为激发光，激发检测标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，通过物镜和目镜系统的放大以观察标本的荧光图像的光学显微镜，是医学检验中的重要仪器之一。 在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。 萤光显微镜原理： (1) 光源幅射出各种波长的光(以紫外至红外)。 (2) 激励滤光源：透过能使标本产生萤光的特定波长的光，同时阻挡对激发萤光无用的光。 (3) 荧光标本：一般用萤光色素染色。 (4) 阻挡滤光镜：阻挡掉没有被标本吸收的激发光有选择地透射萤光，在萤光中也有部分波长被选择透过。以紫外线为光源，使被照射的物体发出荧光的显微镜。

荧光显微镜介绍及使用

荧光显微镜 一.荧光显微镜(Fluorescence microscope) ： 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。 在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。

荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，不是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： 1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上； 2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人眼。 荧光显微镜也是光学显微镜的一种，主要的区别是二者的激发波长不同。由此决定了荧光显微镜与普通光学显微镜结构和使用方法上的不同。 荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的

光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。 二．工作原理 光源 多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15m i n。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。 超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。 新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一

二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测定(1)

二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测定 实验室地点：3411 实验时间安排 9.20（第5周星期二） 8:30—10:00 第3组 10:00—11:30 第4组 9.21（第5周星期三） 14:30—16:00 第5组 16:00—17:30 第6组 9.22（第5周星期四） 8:30—10:00 第7组 9.23（第5周星期五） 14:30—16:00 第1组 16:00—17:30 第2组 实验指导 一、实验目的 1．掌握二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测量方法； 2．学会辩别荧光物质的分子荧光峰和拉曼散射峰； 3．熟悉岛津RF-5301（日立F-4500）荧光分光光度计的定性扫描方法及定性测量软件数据处理操作。 二、实验原理 任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱。由于斯托克斯位移，荧光发射波长总是大于激发波长。 在一定光源强度下，若保持激发波长ex λ不变，扫描得到的荧光强度与发射波长em λ的关系曲线，称为荧光发射光谱，它表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度；反之，保持em λ不变，扫描得到的荧光强度与ex λ的关系曲线，则

称为荧光激发光谱，它可以反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长值，所以，可用它来鉴别各种荧光物质。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关。 同一荧光物质的分子荧光发射光谱曲线的波长范围（和最大发射波长）不因它的激发波长值的改变而位移，由于这一荧光特性，如果固定荧光发射波长（λem），然后改变激发波长（λex），并以荧光强度F对激发光波长λex绘图即获得激发光谱曲线，从中能确定最大激发波长（λex）。反之，固定激发波长值，测定不同发射波长时的荧光强度，即得荧光发射光谱曲线和最大荧光发射波长值。 三、仪器和试剂 1、仪器荧光分光光度计（岛津RF-5301，日立F-4500）。它的主要技术指标如下：测量波长范围：220-900 nm，（200-900 nm）、光源：脉冲氙灯、测量模式：激发光谱，发射光谱，波长同步光谱，测量方式：定性、定量、三维扫描、荧光动力学 四面通石英比色皿一个（10mm x 10mm）、25 mL具塞比色管、移液管、吸耳球、洗瓶、吸水纸 2、试剂 (1) 二氯荧光素标准溶液 a 储备标准液(25mg/mL): 称取0.0125g 二氯荧光素（A.R），用0.01mol·L－1 NaOH溶液溶解后移入500mL容量瓶中并用0.10 mol·L－1 NaOH稀释至刻度。 b 工作标准液(0.10 mg/mL):取上述储备溶液10.00mL于一500mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度摇匀，配制成0.50mg/mL溶液。再移取0.50mg/mL溶液10.00mL于一50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度摇匀。 （2）1.0mol·L－1 NaOH

主要荧光素一览表教学内容

主要荧光素一览表

（1）荧光素类 Fluorescein 标准荧光素（Reference standard）之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。 Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。 与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。 主要应用于聚焦激光扫描微阵列（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flow cytometry）。 FITC 异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，5-FITC较6-FITC更经常使用。 FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=9.0）。与蛋白的结合力也强。 FITC具有荧光素衍生物的普遍特性。在水中易变坏，不能长久保存。 FITC-Oligo 广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序；FITC也经常被用于蛋白电泳 检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。 FAM 羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。 Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。 与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。 FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。

探针荧光素颜色

荧光标记二抗的选择-FITC/Rhodamine/Texas Red/Cy/PE/AMCA 点击次数：2701 发布时间：2010-5-5 荧光标记二抗的选择-FITC/Rhodamine/Texas Red/Cy/PE/AMCA 一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP)，荧光基团(FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine)和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术)中通常使用荧光标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/A vidin检测系统。其中荧光素是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多，目前常用于荧光标记二抗有以下几种： 【异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)荧光标记二抗】 FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC 在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记几个FITC分子，IgM通常用小分子的荧光素标记，如FITC、Cy3/5、Texas Red 等。FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。然而FITC的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。 【四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC)，Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)荧光标记二抗】 这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长(550, 570, 596nm)和最大发射波长(570, 590, 620nm)。尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用，使用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记的实验时，RRX 尤其有用，可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发光为488nm，598nm和647nm，分别是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激发波长。因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发, 在流式细胞仪中用FITC作双标，另一种用藻红蛋白(PE)耦联基团要比罗丹明好。TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。 【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】 Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。 Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。 【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】