早期胚胎发育过程中印记基因的表达研究

目录

摘要..................................................................... I ABSTRACT............................................................. III 缩略词表................................................................ VII 1 前言. (1)

1.1 印记基因 (1)

1.1.1 基因印记的概念及研究意义 (1)

1.1.2 印记基因的发现 (2)

1.1.3 印记基因的特点及识别 (2)

1.1.4 印记基因研究模型 (3)

1.1.5 各个基因的位置、来源以及功能 (4)

1.1.6 基因印记与动物克隆技术 (4)

1.1.7 基因印记与疾病 (5)

1.2 早期胚胎单细胞的获取 (6)

1.2.1 小鼠受精 (6)

1.2.2 小鼠的超数排卵 (7)

1.2.3 Whitten效应 (7)

1.3 单细胞基因表达 (8)

1.3.1 单细胞基因表达鉴定的发展历程 (8)

1.3.2 单细胞提取的原理 (9)

1.3.3 细胞异质性 (10)

1.3.4 单细胞RNA-Seq 技术 (11)

2 材料与方法 (15)

2.1 实验动物品系 (15)

2.2 主要仪器 (15)

2.3 主要试剂 (17)

2.3.1 常规试剂 (17)

V

2.3.2 各类缓冲液和培养液的配制 (17)

2.4 引物设计及合成 (23)

2.5 胚胎转移针的制备过程 (25)

2.6 收集CD1小鼠胚胎并培养 (25)

2.7 单细胞cDNA提取的过程 (27)

2.8 磁珠纯化cDNA (31)

2.9 引物设计的步骤 (31)

2.10 实时荧光定量PCR的步骤 (31)

3 结果与分析 (35)

3.1 基因信息统计 (35)

3.2 实验样本量 (37)

3.3 胚胎的发育过程 (38)

3.4 单细胞的分离 (39)

3.5 单细胞cDNA提取后的验证 (40)

3.6 印记基因的验证 (42)

3.7 实时荧光定量分析 (43)

4 讨论 (47)

4.1 关于单细胞检测技术 (47)

4.2 关于小鼠超数排卵 (48)

4.3 关于检测结果 (48)

参考文献 (49)

致谢 (55)

VI

缩略词表

cDNA Complementary DNA 互补DNA

CDS Coding Sequence 编码区

SNP Single Nucleotide Polymorphisms 单核苷酸多态性PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应RT-PCR Reverse Transcription PCR 反转录PCR

RT-qPCR Real-Time Quantitative PCR 实时荧光定量PCR bp Base Pair 碱基对

dNTP Deoxyribonucleoside Triphosphate 脱氧核糖核苷-5'-三磷酸ICM Inner Cell Mass 内细胞团PMSG Pregnant Mare Serum Gonadotropin 孕马血清促性腺激素HCG Human Chorionic Gonadotrophin 人绒毛膜促性腺激素FSH Follicle-Stimulating Hormone 内源性促卵泡素LH Luteinizing Hormone 促黄体素

IC Imprinting Center 印记中心

DMR Differentially Methylated Region 差异甲基化区PWS Prader-Willi Syndrome 普-威综合征AS Angelman Syndrome 安格尔曼综合征BWS Beckwith-Widemann Syndrome 贝-威综合征SRS Silver-Russell Syndrome 西拉综合征Igf2 Insulin-like Growth Factor 2 胰岛素样生长因子2 PBS Phosphate Buffer Saline 磷酸缓冲盐溶液

HEPES

2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazine]

Ethanesulfonic Acid N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2

-乙烷磺酸

DEPC Diethyl Pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯

VII