牡丹叶斑病病原真菌鉴定及生物学特性研究
河南科技大学
硕士学位论文
牡丹叶斑病病原真菌鉴定及生物学特性研究
姓名：段亚冰
申请学位级别：硕士
专业：植物病理学
指导教师：康业斌
20091201
论文题目：牡丹叶斑病病原真菌鉴定及生物学特性研究
专业：植物病理学
研究生：段亚冰
指导教师：康业斌教授
摘要
随着我国牡丹种植面积的扩大、老园区种植年限的延长及对外交流频次的增加，发生在牡丹上的老病害为害日益严重，新病害种类不断增加，特别是真菌病害的为害已成为制约我国牡丹产业发展的重要因素之一。目前，我国关于牡丹病害的系统调查和病原鉴定工作研究的较少。本试验选择国家牡丹园、洛阳市国花园、白云山高山牡丹园等主要牡丹种植园、圃，对牡丹叶部真菌病害展开调查，根据病害症状和病原菌的形态特征，并结合分子生物学手段进行病原分类鉴定。
调查发现了牡丹叶部真菌病害10种，以黑斑病、叶霉病、红点病为害最为严重。其中牡丹黑斑病等7种病害的病原经形态学鉴定已经确定，分别是（Alternaria. su?ruticosae、A. su?ruticosicola、A. tenuissima）、芍药尾孢（Cercospora paeoniae）、牡丹枝孢（Cladosporium paeoniae Pass）、牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae Oudem）、牡丹白粉菌（Erysiphe paeoniae）、牡丹拟盘多毛孢（Pestalotiopsis paeoniae）、斑点叶点霉（Phyllosticta commonsii）。而牡丹红点病（菌株I）、瘤点病（菌株II）与叶斑病（菌株III）的病原仅靠形态学观察难以确定，需利用分子手段进一步研究。
对分离纯化的菌株I、菌株II、菌株III 的rDNA的ITS序列进行了PCR扩增，并对扩增产物进行了克隆和序列分析。结果表明，菌株I、菌株II 与GENBANK中编号为AY487094.1的Pilidium concavum ITS区段进行了比对，其同源性分别为100%和99.58%，表明菌株I 和菌株II 均为Pilidium concavum；菌株III 初定为双毛壳孢属真菌Discosia sp.。
对Pilidium concavum 生物学特性的研究结果表明，该菌菌丝生长的最适培养基为PDA，分生孢子产生的最适培养基为PYA。在最适培养基上培养，菌丝生长的最适温度为25℃，产孢的最适温度为30℃；在pH值6～11范围内该菌均能生长和产孢，菌丝生长的最适pH值为6，pH值为11时产孢最好，pH值为5时孢子萌发达到最大；光照对菌丝生长、产孢及孢子萌发无显著影响；在供试的碳源中，菌丝生长及产孢均以葡萄糖最好，氮源以酵母膏最好；RH在65%～100%孢子均能萌发，萌发率随湿度增大而升高，在饱和湿度时萌发率最高，达
I
到94.51%；孢子的致死温度为51℃ 10min。
本试验以形态学为基础，在分子水平上鉴定了牡丹叶斑病病原真菌，发现了Pilidium concavum、Discosia sp.两种国内新病原，探讨了P. concavum的生物学特性，对进一步揭示牡丹真菌病害及其防治具有重要意义。
关键词：牡丹，叶斑病，病原真菌，形态鉴定，分子鉴定，生物学特性
论文类型：应用基础研究
II
Subject: Study on the Identification and Biological Characteristics of Pathogenic fungi of Peony leaf spot Specialty: Phytopathology Name: Yabing Duan
Supervisor: Professor Yebin Kang
ABSTRACT
With the expansion of cultivated area and plant life of Peony in China and the increase in frequency of foreign exchange, new diseases continue to rise and the damage of old diseases, especially fungal diseases, has been a key facter in restricting the industrial development of Peony in China. Currently, the studies on systematic investigation of peony diseases and pathogen identification[0] is very little in our country. In order to investigate the peony leaf fungal diseases, this study selected the country Peony Garden, Luoyang City of Garden, Baiyun Mountain Alpine Peony Garden and other major peony plantations, nurseries to identify pathogens according to symptoms and morphology, combined with molecular biology characteristics.
Ten kinds of fungal diseases were found and black spot, leaf mold and red spot are the most serious diseases. Seven kinds of pathogens included black spot had been identified on morphology, and they were Alternaria su?ruticosae, A. su?ruticosicola, A. tenuissima, Cercospora paeoniae, Cladosporium paeoniae Pass, Botrytis paeoniae Oudem, Erysiphe paeoniae, Pestalotiopsis paeoniae and Phyllosticta commons. However, Peony red spot (strain 1), Peony tumor spot (strain 2) and Peony leaf spot (strain 3) were difficult to determine by their morphological character alone, so further study is needed at the molecular level.
PCR amplification products of ITS of rDNA of the three strains obtained were sequenced. Compared strain1 and strain 2 with the ITS sequnces of Pilidium concavum numbered AY487094.1 of GENBANK, the homologies were 100% and 99.58% seperately. The results showed that both strain 1 and strain 2 were Pilidium concavum, while strain 3 is Discosia sp..
Studies on the biological characteristics of Pilidium concavum showed that the optimum grown was PDA, the optimum sporulation was PYA. The optimum grown temperature was 25℃, the optimum temperature for sporulation was 30℃. The
III
optimum growth pH was 6, sporulation was a maximum of pH 11. Light had no significant effect on mycelial growth and sporulation. Glucose and yeast were the most suitable carbon and nitrogen sources for mycelial growth. Conidia germinated during RH 65%-100% and the germination rate increased with the increase of RH. when RH is saturated, spore reached its maximum germination rate 94.51%. The lethiferous
℃
temperature of conidia was 51 for l0 min.
In this study, based on morphology, pathogenic fungi of Peony leaf spot were further identified at the molecular level. The results indicate that Pilidium concavum and Discosia sp. are new pathogens on Peony in our country. Biological characteristics of P. concavum had a great significance on further revealing the prevention and treatment of fungal diseases of peony.
KEY WORDS:Peony, leaf spot diseases, pathogenic fungi, morphological
identification, molecular identification, biological characteristics Dissertation Type:Applied basic research
IV
缩略语词汇表
66缩略语词汇表Abbreviations
缩写词英文全名中文全名
PDA Potato dextrose agar 马铃薯葡萄糖琼脂培养基DNA Deoxynculeoside
acid 脱氧核糖核苷酸
ITS Internal transcribed spacer 内转录间隔区
GenBank GenBank 美国DNA序列数据库
Tris Tris(Hydroxymethyl)aminomethane 三羟甲基氨基甲烷
EDTA Ethylene
Diamine
Tetraacetic
Acid 乙二胺四乙酸
TE Tris & EDTA TE缓冲液
TAE Tris & Acetate & EDTA TAE电泳缓冲液
EB Ethidium
bromide 溴化乙锭
CTAB Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide 十六烷基三甲基溴化铵PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
dNTP Deoxy-ribonucleoside
triphosphate 三磷酸脱氧核糖核苷BLAST Basic Local Alignment Search Tool 局部相似性查询工具
OD Optical
Density 光密度
DDBJ DNA Data Bank of Japan 日本DNA数据库
EMBL European Molecular Biology Laboratory 欧洲DNA数据库
PDB Protein date bank 蛋白质数据库
NCBI National Center of Biotechnology Information 美国国立生物技术信息中心bp Base
pair 碱基对
PSA Potato sucrose agar 马铃薯蔗糖琼脂培养基Czapek Czapek’s
medium 查氏培养基
OMA Oatmeal
agar 燕麦片琼脂培养基
CMA Corn
agar 玉米粉琼脂培养基
PYA Potato yeast agar 马铃薯酵母膏琼脂培养基PCA Potato carrot agar 马铃薯胡萝卜琼脂培养基YA Yeast
agar 酵母膏琼脂培养基
WA Water
agar 琼脂培养基
RH Relative
humidity 相对湿度
CK Check 对照
第1章文献综述
第1章文献综述
牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）隶属于芍药科（Paeoniaceae）、芍药属（Paeonia L.）、牡丹组（Sect. Moutan DC.）[1]。别名洛阳王、百花王、鹿韭、木芍药、富贵花等，是多年生落叶小灌木，革质或肉质，花朵硕大、风姿华贵、色彩艳丽、仪态万方、品种繁多，深受中国人民喜爱，有“国色天香”、“花中之王”、“天都神花”之美称，居中国十大传统名花之首，也是世界上著名花卉之一，具有很高的观赏和药用价值[2-5]。洛阳牡丹栽培历史悠久，品种齐全，花大色艳[6]，经过多年来的大力发展，洛阳现已有牡丹品种700多个，3000余万株，种植面积近万亩，已建成的规模化的牡丹园30多个[7,8]，且观赏牡丹与商品牡丹并存，不仅遍布全国，还闻名世界，每年都有数万株的牡丹苗木、催花牡丹及鲜切花走出国门，远销美国、日本、澳大利亚、新西兰、阿根廷、欧盟等20多个国家和地区。
1.1 我国牡丹的地理分布及特点
1.1.1 野生牡丹地理分布及特点
我国是牡丹分布、起源、演化的中心，目前已经查明的野生种有9种、1亚种、2变种、1变型。纵观历史资料记载[2]，结合李睿等[9]对我国野生牡丹分布的调查，将我国野生牡丹划分为两大分布区域。
1.1.1.1 黄土高原——秦巴山地——川西北高原分布区
该区以秦岭为界，南北分别属于北亚热带和暖温带气候。北亚热带气候区植被为常绿阔叶、落叶常绿阔叶、落叶阔叶林地带；暖温带气候区植被为森林草原或落叶阔叶林地带。该区是牡丹组（Sect. Moutan DC.）革质花盘亚组（subsect. Vaginatae）的分布区，主要有矮牡丹（稷山牡丹Paeonia jishanensis）、紫斑牡丹（Paeonia rockii）、杨山牡丹（Paeonia ostii）、卵叶牡丹（Paeonia qiui）、四川牡丹（Paeonia decomposita）。其主要野生种的分布范围及特点如下：
1.矮牡丹（稷山牡丹Paeonia jishanensis）：落叶小灌木，高约60～80cm，茎皮带褐色，有纵纹；花通常单瓣，黄、红、紫或白色，花瓣基部无紫斑；当年生枝淡绿色带褐红晕，皮孔不明显；顶生小叶近圆形或宽椭圆形，3深裂至中部，裂片再浅裂；上表面无毛，下表面被丝毛，后渐脱落；心皮5，柱头暗紫红色。花期4月下旬至5月上旬[2,9-15]。
该种主要分布于山西西南部的稷山、永济和陕西西北部的华山、铜川、延安
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等地，生长于阴坡疏林下或沟谷两旁岩石缝中。
2.杨山牡丹（Paeonia ostii）：落叶灌木，高约1.5m，茎皮灰褐色，呈圆筒形，内卷，皮细肉厚，外部可见纵面剖开的裂缝，断面内白色，粉性足，有特殊浓郁的香气，特称“凤丹”，是著名的地道药材；雄蕊多数，花药黄色，花丝暗紫红色，花盘暗紫红色；心皮5，柱头暗紫红色。花期4月中、下旬[2,9,11,13,15]。
该种由秦岭山脉向西分布到甘肃东南部，向南分布到湖北西南部及湖南西北部，向东经河南东南部分布到安徽南部。
3.卵叶牡丹（Paeonia qiui）：落叶灌木，高达80cm，茎皮灰褐色，具纵纹。二回三出或一回三出复叶，小叶9枚，卵形或卵圆形，表面多为紫红色，背面浅绿色，先端钝尖，基部圆形，花单生枝顶，粉色或粉红色，花蕊极短，柱头扁平，翻卷成耳状，多紫红色，花药黄色，花丝粉色或粉红色，花盘暗紫红色，革质，全包心皮，心皮5，密被白色或浅黄色柔毛，种子卵圆形，黑色而有光泽，花期4月下旬至5月下旬，果期8月[2,3,9,11,13,15]。
该种分布区极为狭窄，至今仅见于湖北神农架山地（松柏和保康）和河南西峡，堵河源自然保护区民主、花坪、白河等地有分布。
4.紫斑牡丹（Paeonia rockii）：落叶灌木，茎直立，高0.5～1.5m。小枝圆柱形，微具条棱，基部具鳞片状鞘；叶通常为二回三出复叶；花大，单生枝端，苞片5，长椭圆形；萼片4～5，淡黄绿色，近圆形，花瓣约10枚，白色，卵形，内面基部具有深紫色斑块；花丝淡黄色，花盘黄白色；心皮5～8枚，柱头黄白色；雄蕊多数，黄色；花盘杯状，革质；包围心皮，心皮5～7，密被黄色短硬毛；瞢荚密被黄色短柔毛，顶端具喙；种子倒圆锥形，黑色具有光泽。花期5月，果期7月[2,3,9,11,13,15-17]。
该种分布区域比较广泛，主要分布于甘肃南部、陕西秦岭南坡、河南伏牛山以及湖北西部神农架等地，生于海拔1 100～2 800m的落叶林中。
5.四川牡丹（Paeonia decomposita）：落叶灌木，高0.5～1.6m，各部均无毛，茎皮灰黑色，片状剥落；顶部长尖黄绿色带有晕圈，腋芽短小，稍弯曲，有红晕；当年生枝紫红色，基部具残存芽鳞；叶多为三回或四回三出复叶，顶生小叶卵形或倒卵形，3裂达中部或近全裂，裂片再3浅裂；花单生枝顶，花瓣9～12枚，浅紫至粉红色，花柱短，柱头扁，反卷，幼果无毛，褐带绿色；花丝白色，花盘白色，心皮4，无毛。花期4月下旬至5月上旬[2,3,9,11,13,15]。
该种分布范围极为狭窄，仅见于四川西北部马尔康县、松岗、金川大渡河及岷江流域。
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第1章文献综述
1.1.1.2 青藏高原东部——云贵高原分布区
青藏高原东部为中亚热带气候向亚热带气候过渡地区，云贵高原为中亚热带西部半湿润气候，分别为山地寒温性针叶林地带和中亚热带常绿阔叶林地带。该区为牡丹组（Sect. Moutan DC.）肉质花盘亚组（subsect. Delavayanae）分布区，由北向南及西南分布着狭叶牡丹、紫牡丹、黄牡丹、大花黄牡丹。其主要野生种的分布范围及特点如下：
1.狭叶牡丹（Paeonia potanini）：亚灌木，高 1.0～1.5m，茎淡绿色，无毛，叶近对生，二回三出羽状复叶；花红色至紫红色，花外无大形总苞，苞片与萼片5～7枚；心皮通常2～3枚，无毛；花瓣9～12枚，花径5～6cm；雄蕊多数，花丝红色；柱头细而卷曲，花盘肉质；花期5月[2,9,11,13,15,18]。
该种分布于四川西部巴塘、雅江、乾宁、道孚、康定及云南昆明、丽江、嵩明东川一带，生长于河谷坡地、地埂边及林缘地带，呈片状分布。
2. 紫牡丹（Paeonia delavayi）：亚灌木，全体无毛，茎高约1.5m，当年生小枝暗紫红色，草质，小枝基部具数枚鳞片；二回三出复叶；苞片3～4，披针形，大小不等；萼片3～4，宽卵形，大小不等；花2～5朵，生于枝顶和叶腋，花瓣9～12枚，红至紫红色，花丝深紫色，花盘肉质，包裹心皮约1/3，顶端裂片三角形或钝圆；心皮2～5枚，无毛，柱头紫色；花期4～6月，果期6～9月[2,9,11,15,18]。
本种多见于云南西部至西北部（永宁、鹤庆、中甸、大理、剑川、丽江、宁蒗、香格里拉、德钦、贡山），亦分布于四川西南部及西藏东南部海拔在2 700 m～3 500m的山坡、草丛及杂木林中。
3.黄牡丹（Paeonia lutea）：落叶小灌木或亚灌木，茎高 1.0～1.5m，无毛，木质，灰色；嫩枝绿色，一年生以上枝条表现块状剥落；二回三出羽状复叶，互生，纸质，叶片羽状分裂，裂片披针形，先端锐尖至钝尖，基部下延，全缘或有齿，下面微带白粉；枝端着生花2～5朵，近顶部的2～3个叶腋内也常有花；苞片3～6，披针形；萼片3～4，宽卵形；花瓣9～12，黄色，有时边缘红色或基部有紫色斑块，倒卵形；雄蕊多数；花丝淡黄色；花盘肉质，包住心皮基部，顶端裂片三角状或钝圆；心皮通常3枚，锥形；蓇葖革质，顶端长渐尖，向下弯；种子数粒，黑色。花期4月下旬至5月中旬，9～10月果熟[9,11,15,18]。
该种主要分布于西南季风区内的石灰岩土地和玄武岩土地，包括云南中部、西北部及西南部一带，此外还有西藏东南部以及四川西南部，大多生长于石灰岩山地灌丛或疏林下。
4.大花黄牡丹（Paeonia Lud lowii）：落叶灌木，株型高大，最高可达
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3.5m，枝干丛生，全体无毛；茎皮灰色，片状脱落；二回三出羽状复叶，两面光滑，表面绿色至黄绿色，带有美丽的青铜色；当年生枝草质，长25～30cm，基部具数枚鳞片，黄绿色，偶有红晕；花3～4朵生枝顶或叶腋，花大，黄色；花瓣、花丝与花药均为黄色；苞片4～5，萼片3～5，花径10.5～12.7cm，花盘肉质，黄色，乳突状，心皮1，少数为2，光滑无毛，柱头黄色，蓇葖果圆柱形；种子大，暗褐色至黑色，不规则扁圆形；喜光，喜温暖，不耐瘠薄，畏炎热；西藏特有植物。花期5月至6月上旬，果熟期8月[2,9,11,15,18]。
本种原产中国西藏东南部林芝到米林长约100 km海拔为2 700～3 300m的雅鲁藏布江河谷及山坡林缘。
1.1.2 我国牡丹栽培品种分布及特点
中国牡丹栽培品种根据栽培地区和野生原种的不同[6,19-21]，可分为4个牡丹品种群[1,10,15,22]；即中原品种群、西北品种群、江南品种群和西南品种群，其主要分布区及特点如下：
1.中原牡丹品种群：本品种群植株高低不一，一般情况下，较其它三个品种群矮；花型种类最为齐全，花色多样，有白、粉、红、紫、墨紫、绿、淡黄、雪青等色和复色，色彩浓淡富于变化，在4个品种群中，花色最为丰富；品种多达500多个，在4个品种群中数量最多。主要野生原种是矮牡丹（P. jishanensis）、紫斑牡丹（P. rockii），近年，杨山牡丹（P.ostii）也参与了中原牡丹品种的形成。中原品种群栽培历史悠久，主要分布于黄河中、下游地区，分布以山东荷泽、河南洛阳和北京为中心，向东已在青岛、烟台，向西在甘肃兰州，向北在长城以南，向南在上海、杭州一线都能正常生长开花；经防寒越冬已在哈尔滨、大庆、牡丹江、尚志以及到青海西宁等地也已栽培；在国外已经引种栽植到日本、荷兰、英国、法国、德国、美国、澳大利亚、意大利、新加坡等国，可见该种群对环境的适应能力很强[15,23-26]。
2.西北牡丹品种群：该种群品种数量较多，约有100多个品种，开花时间较长；植物高大，年生长量较大，叶形变化较少，总叶柄长；花型演化程度较中原品种群低，台阁花品种数量较少；耐寒、耐旱、耐碱，生长旺盛，病虫害少，可在寒冷、干旱的广大西北地区种植。其主要野生原种是紫斑牡丹（P. rockii），也有矮牡丹（P. jishanensis）的血缘。栽培区在兰州、临夏、临洮等地，包括甘肃省渭河中、上游的天水、甘谷、武山、陇西及静宁；大夏河中、下游的夏河、临夏、和政；洮河下游的临洮、康乐以及兰州、榆中等地；陇东的平凉也有较多的栽培。此外西宁及其以东地区、西安及其以西地区和宁夏的固原地
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5区也有分布[15,23-26]。
3. 江南牡丹品种群：该种群植株高大，一年生枝长，土芽少，分枝性强，开花多，开花早，根系浅，耐湿热，在我国南方地区广泛栽植。江南牡丹品种群是由杨山牡丹（P .ostii ）与古时中原牡丹南移，相互间杂交并适应当地环境条件而形成的品种，是一个较为耐湿热的种群，其主要野生原种为杨山牡丹。栽培分布以铜陵、宁国、杭州、上海等地为中心，分布于安徽、江苏、浙江、江苏盐城、广东乐昌、江西南昌等地[15,23-28]。
4. 西南牡丹品种群：该种群植株高大，叶大，花梗长，花瓣基部有紫斑或红晕，枝叶粗壮而较稀琉；根系浅，生长势强；花型演化程度高，多台阁花品种；花径大，着花量较少，花期较长。主要栽培区以彭州和成都为中心，包括四川、云南大理和丽江、贵州贵阳、西藏拉萨等地[15,23-26]。
1.2 牡丹病害国内外研究现状
牡丹在栽培管理过程中，由于对土壤和苗木消毒不严、栽培方法不当、管理不善以及气候等原因，往往会造成病害严重发生。牡丹一旦发生病害，轻则影响其生长发育，减少来年开花数量，降低观赏效果，重则造成植株大量死亡，甚至会危及整个牡丹园、圃，带来严重的损失。改革开放以来，我国牡丹在国际市场上的需求量逐年增加，而进口国对牡丹病害的检疫要求越来越严格，不消灭病害危害，就达不到出口标准。因此，加强对牡丹病害的防治，对提高观赏价值、出口创汇等都十分重要。危害牡丹的病害较多，而且存在着区域性的特点，加之根部病害的隐蔽性较强，积累期较长，一经发现，很难遏制，因此必须引起高度重视。
近年来，通过对牡丹病害种类、为害情况及其防治的调查研究，提高了牡丹的综合防治水平。但还有一些发生较为严重的病害，还需采取有力措施，以免造成更大的经济损失。
综合各地调查资料，为害牡丹的病害约为32种（表1）。
表1 牡丹病害一览表
Tab.1 Peony diseases list
序号 名称
病原 为害部位 1 黑斑病[2,29,30] Alternaria.suffruticosae ，A.suffruticosicola ，
A. tenuissima.
叶片 2 炭疽病[2, 30,31] Colletotrichum sp.
茎、叶、花芽
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续表1 Continued 1
序号名称病原为害部位
3 褐斑病[2,30,31]芍药尾孢Cercospora paeoniae叶片
4 叶霉病[2,30,31]牡丹枝孢Cladosporium paeoniae Pass 叶片
5 灰霉病[2,31]牡丹葡萄孢菌Botrytis paeoniae Oudem 叶、茎、花
6 白粉病[30]牡丹白粉菌Erysiphe paeoniae Zheng&Chen 叶片
7 瘤点病[32]Tubercularia sp．叶、茎、鳞芽
8 轮纹斑病[30,31]牡丹拟盘多毛孢Pestalotiopsis paeoniae Serv. 叶片
9 黄斑病[30]斑点叶点霉Phyllosticta commonsii Ell.et Ev 叶片
10 柱隔孢叶斑病[30]Ramularia sp.叶片
11 锈病[30]Cronartium flaccidum（Alb.et Schw.）Wint. 叶片
12 斑点病[30]Mycosphaerella sp.叶片
13 枯萎病[2]恶疫霉菌Phytophthora cactorum Schrot 茎、叶、芽
14 茎腐病[2]核盘菌属真菌Sclerotinia sclerotiorum de Bary 茎、叶、花芽
15 白绢病[2]整齐小核菌Sclerotium rolfsii Succ 根颈
16 白纹羽病[30]褐座坚壳菌Rosellinia necatrix（R.Hart）Berl 根及根颈
17 紫纹羽病[2]桑卷担菌Helicobasidium mompa Tanaka 根及根颈
18 牡丹根腐病[2,33]腐皮镰刀菌Fusarium solani根系
19 牡丹立枯病[2]立枯丝核菌Rhizoctaonia solani Kuhn 幼苗
20 枝枯病[30]Cylindrosporium sp. 茎
21 叶斑病[30]Macrophoma sp. 叶片、茎
22 圆斑病[30]Robillarda sp. 叶片
23 牡丹环斑病[2]牡丹环斑病毒（PRV）叶片
24 牡丹病毒病[2]烟草脆裂病毒（TRV）叶片
25 牡丹曲叶病[2]牡丹曲叶病毒茎、叶
26 牡丹黄化病[2]牡丹黄化病毒（PYV）叶片
27 牡丹花叶病[2]牡丹花叶病毒（PMV）叶片
28 根结线虫病[2,34-36]北方根结线虫Meliodogyne hapla Chitwoo 根系
29 绿瓣病[30]类菌原体花瓣
30 叶尖枯病[30]氟害叶片
31 芽枯病[30]生理病害芽
32 僵蕾[30]生理病害花蕾
第1章文献综述
1.2.1 真菌病害
真菌病害是为害牡丹最严重的病害，近年来牡丹真菌病害的危害有逐年加重的趋势，尤其在牡丹生长后期最为严重，成为牡丹生产的最大限制因素，直接影响着牡丹的观赏和经济价值。国外对牡丹的研究仅限于对牡丹抗病育种、生物学习性的研究，而对牡丹病害的研究较少。王守正报道了18种真菌病害[30]，中国牡丹全书报道了12种[2]，于梅娥报道了17种[37]，大多是为害叶片的病害。为害牡丹最为严重的真菌病害是牡丹炭疽病和牡丹黑斑病，分别由牡丹炭疽菌（Colletotrichum sp.）和A. su ff ruticosae, A. su ff ruticosicola和A. tenuissima引起。喻璋[21]1987年首次报道了侵染牡丹的5种真菌病害，病原分别为：牡丹尾孢菌（Cercospora paeoniae Tehon et Dan.）、牡丹盘多毛孢菌（Pestalotiopsis paeoniae Serv.）、牡丹炭疽菌（Colletorichum sp.）、牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae Qudem.）、牡丹芽枝霉菌（Cladosporium paeoniae Pass.），康业斌[22]报道了牡丹上的一种新病害－瘤点病（Tubercularia sp.），王守正[20]还报道了为害牡丹的其它病原菌：牡丹白粉菌（Erysiphe paeoniae Zheng Chen）、锈菌（Cronartium flaccidum Wint）、恶疫霉菌（Phytophthora cactorum Schrot）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、桑卷担菌（Helicobasidium mompa Tanaka）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum de Bary）、柱隔孢（Ramularia sp.）、球腔菌（Mycosphaerella sp.）、大茎点霉（Macrophoma sp.）、三毛孢（Robillarda sp.）、叶点霉（Phyllosticta commonsii Ell.et Ev.）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）。
1.2.1.1牡丹黑斑病
症状发生较为普遍，初期在叶片上形成大小为1～3mm的圆形小病斑，灰黑色，中央颜色稍浅，后来逐渐扩大直径为5～20mm的圆形或不规则形病斑，黑褐色，上生有墨黑色霉状物，手摸病斑有粗糙感，有时病斑脱落，形成穿孔；严重时病斑连接成片，枯死，提前落叶[2,29,30]。
病原 A. su ff ruticosae, A. su?ruticosicola, A. tenuissima，均属半知菌亚门链格孢属。分生孢子梗暗褐色，不分枝，顶生分生孢子。分生孢子暗色，有纵横隔膜，倒棍棒状，常链状着生。
1.2.1.2 牡丹炭疽病
症状可危害茎、叶、芽和花，以幼嫩组织受害最重。初为长圆形红褐色小斑，略凹陷，中心灰白色，后期病斑产生橘黄色小点，严重时可穿孔。茎部受害产生不规则性浅红褐色溃疡斑，后病斑具有红褐色边缘，中央浅灰色，病茎扭
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曲；幼茎发病则迅速枯萎；芽和花受害后发生芽枯和畸形花[2,30,31]。
病原为一种炭疽病菌（Colletotrichum sp.），属半知菌亚门腔孢纲黑盘孢目炭疽菌属。分生孢子盘生长寄主角质层或表皮下，有明显的刚毛，分生孢子梗无色至褐色，分生孢子近椭圆形，无色，单胞。
发生规律病菌在病部、种子及病残体上越冬，成为翌年的初侵染来源，孢子借风雨和昆虫传播并侵染寄主，雨水多时重发。高湿多雨年份易于流行[38]。
1.2.1.3 牡丹褐斑病
症状感病叶片初出现大小不同的苍白色圆形病斑，中部逐渐变为黑褐色，正面散生十分细小的黑点，边缘黄褐色，相邻病斑愈合时形成不规则大病斑，严重时整个叶片布满病斑焦枯死亡[2,30,31,38]。
病原芍药尾孢（Cercospora paeoniae），属半知菌亚门丝孢纲丝孢目尾孢属真菌，分生孢子座生于叶正面，分生孢子梗从子座生出，褐色，2～15根丛生，多隔膜。分生孢子无色，细长型，尾状，多细胞，大小10.2～20.4μm×2.7～3.4μm。
发病规律病菌以菌丝体和分生孢子在病部或病残体上越冬，成为翌年的初侵染来源。分生孢子借风雨或昆虫传播。病害在大风多雨天气重发。
1.2.1.4 牡丹叶霉病
症状为害叶片、茎、叶柄、萼片、花瓣、果实及种子。叶片病斑初为绿色针头状的凹陷亮点，自叶背向正面突起，后来病斑逐渐变大。叶面黑褐色，叶背浅褐色。在潮湿条件下，叶片病斑正背面均产生墨绿色霉层，此为病菌分生孢子梗及分生孢子。严重时病斑中间枯焦，甚至全叶枯焦[2,30,31,38]。
病原牡丹枝孢（Cladosporium paeoniae Pass），属半知菌亚门丝孢纲丝孢目枝孢属；分生孢子梗分化明显，黑褐色，单生或簇生，分生孢子单生或成链状，黑褐色，卵形或纺锤形，单胞或多胞，大小为7.1～26μm×5.9～7.1μm。
发病规律病菌以菌丝在病残体上越冬。翌年春季菌丝生长产生分生孢子，借风雨、风雨或人为传播，直接侵入或自然伤口侵入。此病自春天花谢后至秋季均可发生。
1.2.1.5 牡丹灰霉病
症状叶、茎、花等部位均可受害，但主要危害叶片，易感染下部叶片。发病初期为近圆形或不规则形水渍状病斑，多发生于叶尖和叶缘；后期病斑多达1cm以上，病斑褐色至紫褐色，有时产生轮纹；湿度大，叶部正背面均产生灰色霉层。茎上病斑褐色，常常软腐，导致植株折倒或全株倒伏。花受害变褐腐烂，产生灰色霉层。病部有时产生黑色菌核[2,31,38]。
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第1章文献综述
病原牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae Oudem），属半知菌亚门丝孢纲丛梗孢目葡萄孢属，分生孢子梗745～897μm×13～19.5μm，分生孢子近圆形或椭圆形，无色，单胞，大小6.8～13.6μm×6.8～10.2μm。
发病规律病菌以菌核、菌丝体和分生孢子随病残体或在土壤中越冬。翌年菌核萌发产生分生孢子，孢子靠风雨传播，自伤口或衰老组织侵入。发病后产生大量分生孢子进行再侵染。高温多雨天气，发病加重。
1.2.1.6 牡丹白粉病
症状发病初期在叶片正面形成一层白色粉状斑，后期叶片两面和叶柄上形成污白色粉层，后期在粉层中散生许多小黑点，即为病菌的闭囊壳[30,39]。
病原牡丹白粉菌（Erysiphe paeoniae Zheng&Chen），属子囊菌亚门核菌纲白粉菌目白粉菌属；闭囊壳散生，黑褐色，球形或扁圆形，壳壁细胞多角形，壳壁上有附属丝，丝状，偶有分枝；子囊5～8个，卵形或椭圆形，有短柄，大小54.4～61.2μm×28.9～34.0μm，内含子囊孢子4～5个，卵圆形，大小17.0～23.8μm×10.2～13.6μm；分生孢子单生，长椭圆形，表面光滑，无色，大小25.5～27.2μm×10.2～11.9μm。
发生规律干燥少雨的年份，比多雨年份发病率高，施用氮肥过多时，叶片过于幼嫩，和遮荫时间过长，都会造成白粉病的大量发生。
1.2.1.7 牡丹瘤点病
症状在叶片、枝条、鳞芽上均可发生。叶片发病初期产生半圆形病斑，中央灰色，边缘深褐色，直径5～35mm，后期病斑产生初为桔红色后呈褐色至黑褐色的瘤状小点，即病菌的分生孢子座，下部叶片发生较为严重，导致叶片枯焦、提前落叶。枝条发病，初为灰褐色病斑，发病中后期病斑灰白色，组织松软，稍隆起，纵裂，后期产生黑褐色的瘤状小点，即病菌的分生孢子座，严重发病的枝条组织坏死，严重时整个植株枯死。鳞芽发病导致鳞芽萌发迟缓，或不萌发，严重时枯死，鳞片上也可以产生黑褐色瘤状小点[32]。
病原瘤座孢属的病菌（Tubercularia sp.），病原菌菌丝无色、有隔，宽35μm，老熟菌丝分支呈姜瓣状；后长成半球形瘤状的分生孢子座，子座较大，褐色至深褐色，自叶片表皮或树皮下顶出，大小为160～875μm×l00～600μm；分生孢子梗无色，细长，重复分枝，大小为32.5～50μm×2～3.3μm；分生孢子顶生，单胞，无色，成堆时呈粉红色，多数为肾形，有的椭圆形和近圆形，大小3.5～11.8μm×1.5～3.8μm。
1.2.1.8 牡丹轮纹斑病
症状病斑圆形或近圆形，灰褐色，较大，直径5～22mm，具有明显同心轮
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纹，病斑中央有呈轮状排列的小黑点，常破裂穿孔[30,31]。
病原牡丹拟盘多毛孢（Pestalotiopsis paeoniae Serv.），属半知菌亚门拟盘多毛孢属；分生孢子盘叶正面生，分生孢子梭形，具有5个细胞，两端细胞褐色，中央细胞深褐色，大小22.8～26μm×6.5～7.1μm，顶端细胞着生无色纤毛，2～5根。
1.2.1.9 牡丹黄斑病
症状病斑圆形或近圆形，黄褐色或黄白色，稍凹陷，后期在病斑上产生散生小黑点，病斑大小3～5mm[30]。
病原斑点叶点霉（Phyllosticta commonsii），属半知菌亚门叶点霉属；分生孢子器近球形，有一孔口，器壁褐色，膜质，大小65～85μm，分生孢子圆形或近椭圆形，无色，单胞，大小5～7μm×2～3μm。
1.2.1.10 牡丹锈病
症状叶片受害初无明显症状，后呈近圆形或不规则褐绿色病斑。背面有黄褐色颗粒状的夏孢子堆，表皮破裂后散出铁锈状黄褐色粉状物；受害后期在叶背灰褐色病斑上丛生深褐色的刺毛状冬孢子堆，严重时叶片提前枯死。在松属植物上引起枝干肿瘤[30]。
病原牡丹锈病病原为松芍柱锈菌[Cronartium flaccidum（Alb. Et Schw.）Wint]，属担子菌亚门、冬孢菌纲、锈菌目、柱锈菌属真菌。夏孢子椭圆形，无色或淡黄色，单胞，有刺。冬孢子椭圆形，黄色至淡黄色，单胞，无柄，相互排列成圆柱形冬孢子堆。
发病规律病菌为转主寄生菌，转主寄主为松属植物。春天湿度大时，在发病的松属植物病部产生性孢子和锈孢子。锈孢子借气流传播侵染叶片，叶片发病后在病斑上产生夏孢子，夏孢子经气流传播可引起再侵染；后期在病部产生冬孢子堆，冬孢子萌发产生担孢子又可侵染松树。温暖、多风雨天气，以及地势低洼、排水不良的田块发病较重。多在4～5月份发病。6～8月进入发病高峰期。1.2.1.11 牡丹根腐病
症状主要为害根部，主根、支根和须根均可发病，以老根为重。主根染病初在根皮上产生不规则黑斑，以后病斑不断扩展，大部分根变黑腐烂，导致植株萎蔫直至枯死；支根和须根染病，病根变黑腐烂，也能扩展到主根。由于根部被害，植株因失水萎蔫，病株地上部分生长衰弱，叶片变小发黄；发病严重时整个植株枯死[2,33]。
病原茄腐皮镰孢霉[Fusarium solani（Mart.）App.et Wr.]，属半知菌亚门、丝孢纲、瘤座孢目、瘤座孢科、镰孢属。菌丝白色絮状，有隔膜。产生大、小两
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种分生孢子；大型分生孢子月牙形或镰刀状，稍弯，顶端细胞短，具隔膜2～7个，多为3～5个，大小为26.17～66.93μm×5.13～7.28μm；小型分生孢子多为长椭圆形，单胞，聚生在分生孢子梗顶端呈假头状，大小16.42～51.71μm×3.16～5.6μm；厚垣孢子间生、单生或对生，球形，褐色，大小8.63～17.34μm×5.21～9.78μm。
发病规律病菌以菌核、厚垣孢子在病根、土壤或肥料中越冬，从伤口（虫伤、机械伤、线虫伤等）侵入。育苗移栽时机械伤口多，发病重；地下害虫危害严重的发病也重；施用未腐熟饼肥可诱导地下害虫重发，导致根部加重发病。1.2.1.12 牡丹白绢病
症状此病主要为害根颈部，发病初期根颈表面形成白色菌丝，皮部组织逐渐下陷，后来长出油菜籽状菌核，初为白色，后呈黄色，最后变成褐色，受害植株叶片变黄，逐渐凋萎甚至枯死。夏季高温多雨，土壤潮湿发病严重[2]。
病原整齐小核菌（Sclerotium rolfsii Succ.）
1.2.1.13 牡丹紫纹羽病
症状发病部位多在根颈部和根部，被害部位覆盖有棉絮状紫色菌丝，病斑初呈黄褐色，后变为黑色。患病后老根腐烂，不生新根，枝条细弱，叶子变小，严重时整个植株枯黄萎凋，枝干枯死[2]。
病原桑卷担菌（Helicobasidium mompa Tanaka）。
1.2.1.14 牡丹枯萎病
症状可侵染牡丹的茎、叶、芽等部位。茎部初为水渍状长形溃疡斑，后扩展为长达数厘米的黑斑。近地面幼茎受害，整个枝条变黑枯死。下部叶片病害发生较重，水渍状不规则形，初为暗绿色，后变黑褐色，病叶枯垂[2]。
病原恶疫霉[Phytophthora cactomm(Leb.et Cohn.) Schrot]，属鞭毛菌亚门、卵菌纲、霜霉目、疫霉属卵菌。孢子囊椭圆形，有乳突，萌发产生游动孢子。卵孢子球形，淡褐色。此外，在菌丝中部可产生厚垣孢子，其存活期很长。
发病规律病菌以卵孢子、厚垣孢子或菌丝体随病残体在土壤中越冬。条件适宜时，病田土壤中带菌量逐年增多，多雨高湿有利于发病。
1.2.2 病毒病
牡丹病毒病是牡丹生产上的主要制约因素。目前已经报道的牡丹病毒病有5种：牡丹黄化病毒病（Peony yellow virus；PYV）[2]、牡丹花叶病毒病（Peony mosaic virus；PMV）[2]、牡丹环斑病（Peony ring spot virus；PRSV）[40]、牡丹曲叶病毒病[2]、还有一种是由烟草脆裂病毒（Tobaccao tatele virus；TRV）引起
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的牡丹病毒病[41]。我国以黄化病毒病和花叶病毒病较为常见，田间症状为叶片褪绿变黄、斑驳、叶畸形和卷曲，有时形成大小不等的环斑或轮纹斑，有时也呈不规则形，染病植株矮小。目前国内外对牡丹病毒病还没有较好的防治措施，使生产受到严重威胁；靠蚜虫传播且极易汁液摩擦传染，多风多雨天气，造成植株摩擦传播的机会较大，这些都利于牡丹病毒病的严重发生。
综合治理发现病株，应及时清理；及早防治传毒蚜虫；清理周围杂草，减少传染源；不用病株做繁殖材料；选择种植抗病毒品种，室内栽培和地膜覆盖栽培等措施可以减少发病及推迟发病高峰期。
1.2.3 线虫病
费玉珍等[42]对牡丹、芍约根结线虫病害的症状进行了详细的观察研究，经形态学鉴定证明牡丹根结线虫为北方根结线虫（Meloidogyne hapla）、芍药根结线虫为南方根结线虫（Meloidogyne incognita）。吴玉柱等[36,43]报道根结线虫病在山东菏泽牡丹栽培区均有分布，并根据雌虫会阴花纹特征、酯酶同功酶谱和北卡罗来纳鉴别寄主试验鉴定为北方根结线虫（Meloidogyne halpla Chitwwod）。高智谋等[38]报道了牡丹根结线虫病病原为南方根结线虫（Meliodogyne incognita Chitwoo）和北方根结线虫（Meliodogyne hapla Chitwoo）；中国牡丹全书[2]报道了牡丹根结线虫病由北方根结线虫（Meliodogyne hapla Chitwoo）、花生根结线虫（Meloidogyne arenaria）、三环茎线虫（Ditylenchus triformis）、滑轫线虫（Caphelenchoides sp.）引起。主要危害牡丹须根，须根受害后产生许多绿豆大小、近圆形的根瘤。植株地上部生长衰弱，新生叶皱缩、变黄，最后逐渐枯黄，提前落叶，严重者整株死亡。
发生规律线虫一年发生几代，以卵和幼虫在病株根组织和土壤中越冬。幼虫多在10cm以下土层中活动。春季当土温升高后，卵孵化为幼虫，开始侵染新的须根；借土壤和灌溉水等传播。带病苗木也是远距离传播的重要途径。
综合治理[42]实行苗木检验；种植抗病品种；重病区实行轮作，或利用夏季高温以薄膜覆盖法闷杀线虫。化学防治可用二溴氯丙烷在种植前处理土壤；植株发病后，可用10%苯线灵颗粒剂60～75kg/hm或20%丙线灵颗粒剂30～45kg/hm沟施、穴施或撒施于根部土壤。
1.2.4 非侵染性病害
林晓民[44,45]等证实，牡丹叶尖枯病是由大气中的氟污染引起的一种非侵染性病害，通过对128个牡丹品种抗性测定表明，牡丹品种对大气氟污染的抗性存在
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差异，抗性指数的变化范围为20～100；抗性差异是由于叶片氟化物的耐受性不同，与空气中的含氟量无关。
僵蕾[30]是由于花蕾受低温、寒害等气候因素的影响不能正常展开，僵化，有时花蕾只裂开一道口子，吐出一少部分内部花瓣和花蕊，俗称“牡丹笑了”，失去观赏价值。
1.2.5 牡丹真菌病害的综合防治
在牡丹的整个栽培过程中，往往由于气候及耕作栽培不当等原因导致病害发生，病株长势变弱，花色衰退，丹皮产量低，品质差。因此，加强牡丹的病害防治工作是保证其健壮生长的重要措施，生产中主要采用以农业防治措施为基础，以化学防治为主的综合防治方法。
1.2.5.1 农业防治
1.加强栽培管理
选地势高、排水良好的地方栽培，栽培不易过密，保持良好的通风透气条件，以降低湿度创造不利于病菌发生发展的生境，可以减少发病；在病区实行3年以上的轮作，或将土壤深翻暴晒或霜冻后再种植；合理施肥，增施磷钾肥，培养健壮植株，提高牡丹的抗病力[38,46-50]。
2.彻底清除初侵染源
冬季彻底清除落叶，剪除病枝，集中销毁，降低翌年初侵染源；发病初期，发现病叶及时摘除烧毁，减少侵染源；生长季发病时，应及时摘除枯叶、枯芽及枯枝并销毁。
1.2.5.2 化学药剂防治
对于褐斑病，用50%代森锰锌500倍液或75%百菌清800倍液，每隔10～15d喷1次，连喷2～3次，要求药液在叶片正反两面喷洒均匀；在炭疽病的发病初期（5～6月）应及时喷洒70%炭疽福美500倍液或70%代森锰锌600倍液进行防治，每隔10～15d 喷1次，连喷2次；对于叶霉病，应在早春植株萌动前，喷3°～5° 波美石硫合剂或25%多菌灵可湿性粉剂600倍液1次，杀死越冬病菌；展叶后，每隔10～15d喷洒1次50%多菌灵可湿性粉剂1 000倍液、50%代森锰锌500倍液或97%敌锈钠200倍液，每隔7d 喷1次，连喷2～3次。在灰霉病发病期间可用80%代森锰锌500倍液、75%百菌清800～1 000倍液或1%波尔多液，每隔10～15d 喷洒1次，连喷2～3次；牡丹锈病在5月上旬发病初期喷施20%三唑酮1 000倍液、97%敌锈钠400倍液或3°～5° 波美石硫合剂等，每隔10～15d 喷1次，连喷2～3次。对于根部病害，用20%益舒宝（灭克
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磷）、15%铁灭克（涕灭威）或3%呋喃丹颗粒剂进行土壤消毒，每平方米用药1.2～5.6g。掺入适量细土拌匀后施入种植穴内或在植株周围均匀布设穴点，施入药土[38,46-50]。
1.2.6 目前生产中存在的问题
1.2.6.1 缺乏系统完整的研究资料
与牡丹的遗传育种和栽培相比，牡丹病害的研究显得比较滞后，国内外有关的报道与研究较少，缺乏完整系统的资料供参考，出口检疫方面也没有掌握相应的技术问题和关键控制点。
1.2.6.2 病害名称不统一
由牡丹枝孢菌（Cladosporium paeoniae Pass）侵染引起的牡丹叶斑病，喻璋[31]、王守正[30]命名为牡丹叶霉病，张宗岩[46]称为牡丹叶斑病，季延平[47]、刘慇[48]、牛迎福[49]、吴玉柱[50]则称为牡丹红斑病；而中国牡丹全书[2]则称为牡丹褐斑病或牡丹红斑病。
1.2.6.3 病原种名不确定
有资料报道[2]，牡丹灰霉病由牡丹葡萄孢（Botrytis paeoniae Oudem）、灰葡萄孢（B.cinerea Pers.ex Fr.）两种病原物引起；文献认为[2]牡丹炭疽病由炭疽菌（Colletotrichum sp.）引起，而喻璋[31]报道由牡丹盘圆孢菌（Gloeosporium sp.）引发；牡丹褐斑病[2]由芍药尾孢（Cercospora paeoniae Tehon et Dan）、黑座尾孢（C. variicolor Wint）两种病原物所致，但其病原实际是哪一种有待查明。此外，斑点病（Mycosphaerella sp.）、柱隔孢叶斑病（Ramularia sp.）、轮纹病（Alternaria sp.）、牡丹炭疽病（Colletotrichum sp.）等病原的种名目前没有确定。
1.2.6.4 新病害病因不明
牡丹春季从萌芽到开花期，一些植株幼芽生长势弱，泛黄或发红，最后整个芽枯死，目前其致病原因不明确。每年5～6月份，一些植株幼叶变黄，8月中旬以后整株叶片边缘会出现大量干枯内卷，严重时危及整个牡丹园圃，导致次年成花量少，花朵小，观赏价值低，目前病原也不甚明了[51]。
1.2.6.5 病害发生规律不详，缺乏有效的防治措施
牡丹根腐病、线虫病、病毒病等一些病害目前发生规律不详，在生产实际中缺乏有效的防治措施。
1.2.6.6牡丹病害生理研究尚不深入
牡丹发病后对其物质、能量以及防御酶等生理代谢影响的研究较少，这也是14