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质粒的抽提实验

实验三质粒的抽提

大肠杆菌的扩繁及质粒DNA的碱裂解法抽提

挑取筛选平板上的一个白色菌落,

接种到5ml LB液体培养基(含50 μg/ml Kana)中,

37℃振荡培养约12小时至对数生长后期(OD600=0.6-0.8)

向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500 μl的平衡液BL,12,000 rpm 离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。

取1.7 ml培养液倒入2 ml eppendorf管中,12000 rpm离心1分钟

弃上清,重复上一步骤

向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl溶液P1,剧烈振荡使菌体悬浮

向离心管中加入250 μl溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解

向离心管中加入350 μl溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时将出现白色

絮状沉淀。12,000 rpm 离心10 min

将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中),注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm离心60 sec,倒掉收集管中的废液,将吸

附柱CP3放入收集管中

向吸附柱CP3中加入600 μl漂洗液PW,12,000 rpm

离心60 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中

重复上一步骤

将吸附柱CP3放入收集管中, 12,000 rpm离心2 min

将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加30μl洗脱缓冲液EB,室温放置2 min,12,000 rpm 离心2 min将质粒溶液收集到离心管中

确定为阳性的重组质粒的菌液加甘油(终浓度15%)保存于

-70℃备用