离子交换柱层析分离核苷酸

离子交换柱层析分离核苷酸

摘要

本实验技术以酵母RNA为材料，将RNA用碱水解成单核苷酸，再用离子交换柱层析进行分离，最后采用紫外吸收法进行鉴定。同时通过测定各单核苷酸的含量，可以计算出酵母RNA的碱基组成。

目录

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一、实验原理

(一) RNA的碱水解

实验室制备单一般用化学水解法（酸、碱水解）和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶和嘌呤碱基；用碱水解可得到2’一核苷酸和3’一核苷酸的混合物；用5’一磷酸二酯酶或3’一磷酸二酯酶水解则分别可得到5’一核苷酸或3’一核苷酸。

RNA用碱水解，经过2’、3’一环核苷酸中间物，而后水解生成2’一核苷酸和3’一核苷酸。如下图所示。

碱水解一般采用0.3M的KOH，37℃保温18~20小时就能水解完全（也可以用1M KOH，80℃水解60min或0.1M KOH 100℃水解20min）。水解毕，用2M HClO4中和并逐滴调节至pH=2左右，生成的KClO4沉淀，离心去除之。上清液即为各单核苷酸的混合液。然后根据所选离子交换剂的类型，将上清液调至适当的，作样品液备用。一般用阳离子交换剂，pH调至1.5左右，用阴离子交换剂，pH调至8 ~ 9(逐滴)。此处用KOH是为了便于除去钾离子以降低样品溶液中的离子强度。

(二) 单核苷酸的层析分离

离子交换层析是根据各种物质带电状态（或极性）的差别来进行分离的。电荷不同的物质对离子交换剂有不同的亲和力，因此，要成功地分离某种混合物，必须根据其所含物质的解离性质，带电状态选择适当类型的离子交换剂，并控制吸附和洗脱条件（主要是洗脱液的离子强度和），使混合物中各组分按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。

在离子交换层析中，分配系数或平衡常数（Kd）是一个重要的参数：

Kd = Cs / Cm

式中：Cs是某物质在固定相（交换剂）上的摩尔浓度，Cm是该物质在流动相中的摩尔浓度。可以看出，与交换剂的亲和力越大，Cs越大，Kd值也越大。各种物质Kd值差异的大小决定了分离的效果。差异越大，分离效果越好。影响Kd 值的因素很多，如被分离物带电荷多少，空间结构因素，离子交换剂的非极性亲和力大小，温度高低等。实验中必须反复摸索条件，才能得到最佳分离效果。

核苷酸分子中各基团的解离常数（pK）和等电点p I 值见表1。

表 1 四种核苷酸的解离常数（pK）和等电点pI值

*注：pI = (pKa1 pKa3) / 2

由表1可见，含氮环亚氨基的解离常数（pK ）值相差较大，它在离子交换分离四种核苷酸中将起决定作用。

用离子交换树脂分离核苷酸，可通过调节样品溶液的pH值使它们的可解离，带上正电荷或负电荷。同时减少样品溶液中除核苷酸外的其它离子的强度。这样，当样品液加入到层析柱时，核苷酸就可以与离子交换树脂相结合。洗脱时，通过改变pH值或增加洗脱液中竞争性离子的强度，使被吸附的核苷酸的相应电荷降低，与树脂的亲和力降低，结果使核苷酸得到分离。

混合核苷酸可以用阳离子或阴离子交换树脂进行分离。采用阳离子交换时，控制样品液pH值在1.5，此时UMP带负电，而AMP、CMP、GMP带正电，可被阳离子树脂吸附。然后通过逐渐升高pH值，将各核甘酸洗脱下来，次序是

UMP-GMP-CMP-AMP。AMP与CMP洗脱位置的互换，是由于聚苯乙烯树脂母体对嘌呤碱基的非极性吸附力大于对嘧啶碱基的吸附力造成的。

本实验采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季铵碱型粉末阴离子树脂（201×8）分离四种核苷酸。首先使RNA碱水解液中的其它离子强度降至0.02以下，然后调pH值至6以上，使样品核苷酸都带上负电荷，它们都能与阴离子交换树脂结合。结合能力的强弱，与核苷酸的pI 值有关，pI 越大，与阴离子交换树脂的结合力越弱，洗脱时越易交换下来。由表1可见，当用含竞争性离子的洗脱液进行洗脱时，洗脱下来的次序应该是CMP、AMP、GMP和UMP。由于本实验所用的树脂的不溶性基质是非极性的，它与嘌呤碱基的非极性亲和力大于与嘧啶碱基的非极性亲和力。所以，实际洗脱下来的次序为：CMP、AMP、UMP和GMP。对于同一种核甘酸的不同异构体而言，它们之间的差别仅在于磷酸基位于核糖的不同位置上，2’—磷酸基较3’—磷酸基距离碱基更近，因而它的负电性对碱基正电荷的电中和影响较大，其pK 值也较大。例如2’-胞苷酸的pK1=4.4,3’-胞苷酸的pK1 = 4.3 ，因此2’一核苷酸更易被洗脱下来。

应注意的是，样品不易过浓，洗脱的流速不宜过快，洗脱液的pH值要严格控制。否则将使吸附不完全，洗脱峰平坦而使各核苷酸分离不清。

(三) 核苷酸的鉴定

由于核苷酸中都含有嘌呤与嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键（—C=C—C=C—），它能够强烈地吸收250~280毫微米波段的紫外光，而且有特征的紫外吸收比值。因此，通过测定各洗脱峰溶液在220~300毫微米波长范围内的紫外吸收值，作出紫外吸收光谱图，与下图所示的标准吸收光谱进行比较，并根据其吸光度比值

（250nm/260nm,280nm/260nm, 290nm/260nm）以及最大吸收峰与下页“表2”所列标准值比较后，即可判断各组分为何种核苷酸。

根据各组分在其最大吸收波长（lmax）处总的吸光度（总Amax ）以及相应的摩尔消光系数（E260 nm），可以计算出RNA中四种核苷酸的微摩尔数和碱基摩尔数百分组成。

四种核苷酸在pH = 2 ~ 4时的紫外吸收光谱曲线

四种核苷酸在pH = 2 ~ 4时的紫外吸收光谱曲线,溶液的pH值对核苷酸的紫外吸收光度值影响较大，故测定时需要调至一定的pH值。

二、试剂与器材

(一) 试剂

1. 酵母RNA

2. 强碱型阴离子交换树脂201×8，聚苯乙烯一二乙烯苯一三甲胺季铵碱型，全交换量大于3毫摩尔/克干树脂，粉末型100~200目

3. 1M甲酸：21.4ml 88%甲酸定容至500ml

4. 1M甲酸钠：34.15g纯甲酸钠（注意结晶水问题）用蒸餾水溶解，定容至500ml

5. 0.3 M KOH：1.68g KOH用蒸餾水溶解定容至100ml

6. 2 M过氯酸HClO4：17ml 过氯酸( 70~72 % )定容至100ml

7. 2 M NaOH (50ml)，0.5 M NaOH (100ml)

8. 1M HCl（100ml）

9. 1% AgNO3溶液

(二) 器材

1. 层析柱

2. 梯度洗脱器，电磁搅拌器

3. 恒流泵

4. 自动部分收集器

5. 酸度计

6. 紫外分光光度计

7. 旋涡混合器

8. 核酸蛋白检测仪

9. 台式离心机

三、操作步骤

(一) RNA的碱水解

称取20mg酵母RNA，置于刻度离心试管中，加2ml新配制的0.3 M KOH，用细玻璃棒搅拌溶解，于37℃水浴中保温水解20小时。然后用2M HClO4（过氯酸）调水解液pH至2以下（要少量多次，只需几滴即可）。由于核苷酸在过酸的条件下易脱嘌呤，所以滴加HClO4时需用旋涡混合器迅速搅拌，防止局部过酸，再以4000转/分的转速离心15分钟，置冰浴中10分钟，以沉淀完全。将清液倒入另一刻度试管中，用2 M NaOH逐滴将清液pH值调至8～9，作上样样品液备用。样品液上柱前，取0.1ml稀释到500倍，测定其在260nm波长处的光吸收值，用以最后计算层析的回收率。

(二)离子交换树脂的预处理

取201×8粉末型强碱型阴离子交换树脂8克（湿），先用蒸馏水浸泡2小时，浮选除去细小颗粒，同时用减压法除去树脂中存留的气泡，然后用四倍树脂量的0.5M NaOH溶液浸泡1小时，除去树脂中的碱溶性杂质。用去离子水洗至近中性后，再用四倍量1M HCl浸泡半小时，以除去树脂中酸溶性杂质。接着用蒸馏水洗至中性（可以上柱洗），此时阴离子交换树脂为氯型。

(三)离子交换层析柱的装柱方法

离子交换层析柱可使用内径约1cm、长10 cm的层析柱，柱下端有烧结上的垂熔滤板，柱上端使用橡皮塞，塞子中间打一小孔。紧紧插入一根细聚乙烯管，层析柱夹在铁架台上，调成垂直，柱下端细胶管用螺旋夹夹紧，向柱内加入蒸馏水至2/3柱高，再用滴管将经过预处理的离子交换树脂加入柱内，使树脂自由沉降至柱底，放松螺旋夹，使蒸馏水缓慢流出，再继续加入树脂，使树脂最后沉降的高度约为6~7cm。注意在装柱和以后使用层析柱的过程中，切勿干柱，树脂不能分层，树脂面以上要保持一定高度的液面（不能太高，约1cm），以防气泡进入树脂内部，影响分离效果。

(四)的转型处理

树脂的转型处理就是使树脂带上洗脱时所需要的离子。本实验需要将阴离子交换树脂由氯型转变为甲酸型，先用200ml 1M 甲酸钠洗柱，用1%AgNO3检查柱流出液，直至不出现白色AgCl沉淀为止。然后改用约200ml 0.2M甲酸继续洗柱，测定流出液的A260≤ 0.020为止。最后用蒸馏水洗柱，直至流出液的pH值接近中性（或与蒸馏水的pH相同）。

(五) 加入样品并淋洗除去不被树脂吸附的组分

加样就是将RNA碱水解产物转移到离子交换层析柱内，使其被离子交换树脂吸附。先将柱内液体用滴管轻轻吸去，使液面下降到刚接近树脂表面。旋紧下端螺旋夹，用滴管准确移取1.0 ml RNA碱水解样品液，沿柱壁小心加到树脂表面，然后松开下端螺旋夹，使样品液面下降至树脂表面，接着用滴管加入少量蒸馏水，当水面降至树脂表面时，再用约200ml 蒸馏水洗柱，将不被阴离子交换树脂吸附的嘌呤及嘧啶碱基，核苷等杂质洗下来。检查流出液在260nm波长处的吸光度，直至低于0.020为止。关恒流泵，旋紧柱下端螺旋夹。

(六) 梯度洗脱

在梯度洗脱器的混合瓶内加入300ml蒸馏水，贮液瓶中加入300ml 0.20M甲酸—0.20M甲酸钠混合液（注意：梯度洗脱器底部的连通管要事先充满蒸馏水，赶尽气泡）。洗脱器出口与恒流泵入口用细塑料管相连，打开两瓶之间的连通伐和出口伐，打开电磁搅拌器，松开柱下端螺旋夹，开启恒流泵，控制流速为5ml / 管/ 10分，开启部份收集器，分管收集流出液。以蒸馏水为对照，测定各管在260nm波长下的A260值，，给各管编号，并标出最高峰的收集管。

(七) 核苷酸的鉴定

分别测定最高峰管内液体在230nm ~ 300nm之间，每相差5nm间隔的光吸收值。其中包括有250、260、280，290nm 各点（注意：液体均要保留，切勿倒掉。测量时用石英杯）。由于在小于250nm时，甲酸（HCOOH ）具有很强的光吸收值，因此测定时所用参比对照液近似为：

第一个峰用0.05M甲酸—0.05M 甲酸钠

第二个峰用0.10M甲酸—0.10M甲酸钠

第三个峰用0.15M甲酸—0.15M甲酸钠

第四，五两峰用0.20M甲酸—0.20M甲酸钠

也可以根据最高峰所在位置，计算甲酸、甲酸钠的浓度选择参比液。

(八) 测定各种核苷酸的含量和总回收率

分别合并（包括最高峰管在内）各组份洗脱峰管内的洗脱液，用量筒测出溶液总体积，然后测定其A260值，参比对照液同上。根据层析柱上样液的A260值以及层析后所得到的各组份A260值之和，可以计算出离子交换柱层析的回收率。（注：RNA 的摩尔消光系数E260nm为7.7 ~ 7.8×103，水解后增值40 % )。

(九)的再生

使用过的离子交换树脂经过再生处理后，可重复使用。可以在柱内处理，也可以将树脂取出后处理。取出树脂的方法是用橡皮球由层析柱的下端向柱内吹气，用烧杯收集流出的树脂。树脂再生的方法与未使用的新树脂预处理方法相同。也可以直接用1M NaCl溶液浸泡或洗涤，最后用蒸馏水洗至流出液的pH值接近中性。

四、结果处理

1. 作出阴离子交换树脂柱层析分离核苷酸的洗脱曲线，以层析流出液管数（或体积）为横座标，以相应的A260值为纵座标，作出洗脱曲线图。

2. 作出各单核苷酸的紫外吸收光谱图，根据各组份溶液在230~300nm波长范围内的吸光度值，以波长（nm）为横座标，吸光度值为纵座标，作出它们的吸收光谱图。由图上求出每个单核苷酸组分的最大吸收峰的波长值lmax ，同时，计算出各个组份在不同波长的吸光度值比值（250/260，280/260，290/260），将它们与各核苷酸的标准值（见表2，取pH=2和pH=7两组值的平均值为标准值）列表比较，从而鉴定出各组份为何种核苷酸。

3. 根据各组份溶液的合并体积（V），平均吸光度值（A260），再查出该核苷酸的摩尔消光系数（E260），从而可以计算出每个核苷酸的微摩尔数（m）。

因为：

则：

由此，可以计算出各核苷酸的相对摩尔百分含量以及嘌呤与嘧啶的相对摩尔数比值。然后讨论RNA中嘌呤与嘧啶的摩尔数比值关系。

4. 根据层析上样液A260值，以及层析后所得到的各组份A260值之和，计算出离子交换柱层析的回收率。

五、技术文档

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六、技术视频

离子交换柱层析原理

离子交换层析介质的应用 离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。 子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。 1.离子交换层析的基本原理： 离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。 离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。 由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。 2.离子交换层析介质： 离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。 阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可

离子交换层析分离纯化蔗糖酶

实验报告 课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：__________________ 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 一、实验目的和要求： 1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验内容和原理： 1、离子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC ） 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。 离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。 基质————电荷基团————反离子 专业： 姓名： 学号： 日期： 地点： 装 订 线 溶液中的离子或离子化合物

阳离子交换剂基质—+ 《==可逆交换==》+ 阴离子交换剂基质+ —《==可逆交换==》— 由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测(定性检测） 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。 本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用 3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。 三、实验材料与试剂：

膜分离技术

水的深度处理工艺综述 人类对膜的认识是从自然界中存在的膜开始的，到现在，各种人工合成膜已成为了我们生活中不可或缺的一部分。其种类繁多，作用也千差万别，但他们具有一个共同的特点-选择透过性。 水的膜技术的应用开始于20世纪60年代，最早使用反渗透膜进行海水淡化。其后膜技术得到了迅速发展，并被众多领域应用。自用于反渗透脱盐后，又开发出纳滤、超滤和微滤技术，这些不同的膜都有其独特的性能，可满足不同的处理要求。 1定义 膜从广义上可以定义为两相之间的一个具有选择透过性的薄层屏障。 膜分离是指在某种推动力作用下，利用膜的选择透过性能，达到分类混合物（如溶液）中离子、分子以及某些微粒的过程。与传统过滤器的最大不同是，膜可以在离子或分子范围内进行分离，并且该过程是一种物理过程，不需发生相变化和添加助剂。在某种推动力的作用下，利用某种隔膜特定的透过性能，使溶质或溶剂分离的方法，称为膜分离。 膜分离是用天然或人工合成膜，以外界能量或化学位差作推动力，对双组份或多组分溶质和溶剂进行分离、分级、提纯和富集的方法。膜分离可以用于液相和气相分离，可以用于水溶液体系、非水溶液体系、水溶胶体系以及含有其他微粒的水溶液体系等。 分离溶质时一般叫渗析，分离溶剂时一般叫渗透。 2分类与特点 膜可以是固态的，也可以是液体甚至是气态的。膜可以是均相的或非均相的，对称的或非对称的，可以是带电的或中性的，而带电膜又可以是带正电或带负电的，或二者兼而有之。膜可以是具有渗透性的，也可以是具有半渗透性的，但不能是完全不透过性的。目前使用的分离膜绝大多数是固相膜。由于膜材料的种类非常丰富，制备条件也多种多样，一般来说膜的分类有以下几种： （1）按分离机理：反应膜、离子交换膜、渗透膜等； （2）按膜的形态：均质膜和非对称膜；

离子交换层析柱的装填及处理

离子交换层析柱的装填及处理 一、原理： 有些高分子物质含有一些可以分离的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如：R-SO3H＋M+ R-S3M＋H+ 或R-NH3OH＋CL－— R-NH3CL＋OH －这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。 二、目的与要求： 本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。 三、仪器与装置： 玻璃层析柱：长19cm，内径1、2cm，3# 砂芯。H L-2型恒流泵。H D-4型电脑核酸蛋白检测仪。B S-100A自动部份收集器。 250ml烧杯。 1ml吸管。 水浴锅。 72型（或721型）分光光度计。

四、试剂与药品： 树脂：Zerolit225型阳离子交换树脂。 洗脱液：0、45N，PH5、3柠檬酸缓冲液，取285g柠檬酸 （C6O7H8?H2O）；186g97℅NaOH；105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。 样品液：0、005M ASP和LYs的0、02N HCL混合溶液。 显色剂：显色剂列出两种可任选一种。 显色剂（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。 10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0、85 ml TiCL3（15%）显色剂（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。 0、1M KCN:0、1628g KCN溶于水中稀释至250ml A、将1、25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）浓度的溶液。B 、将2、5ml 0、01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。此溶剂用时， A、B两溶液在前一天合并，配好的溶液仅能在1-2天内使用，过时失效须重配。 五、方法与步骤： 1、树脂的处理： 关于市售新树脂的处理见 7、，本实验采用处理好的树脂。 2、装柱：将层析柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约1cm高的柠檬酸缓冲液。

离子交换层析柱的装填及处理

一、原理： 有些高分子物质含有一些可以分离的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如： R-SO3H＋M+ ————R-S3M＋H+ 或R-NH3OH＋CL－—————R-NH3CL＋OH－ 这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。 二、目的与要求： 本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。 三、仪器与装置： 玻璃层析柱：长19cm，内径1.2cm，3# 砂芯。 HL-2型恒流泵。 HD-4型电脑核酸蛋白检测仪。 BS-100A自动部份收集器。 250ml烧杯。 1ml吸管。 水浴锅。 72型（或721型）分光光度计。 四、试剂与药品： 树脂：Zerolit225型阳离子交换树脂。 洗脱液：0.45N，PH5.3柠檬酸缓冲液，取285g柠檬酸（C6O7H8?H2O）；186g 97℅NaOH；105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。 样品液：0.005M ASP和LYs的0.02N HCL混合溶液。 显色剂：显色剂列出两种可任选一种。 显色剂（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。 10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0.85 ml TiCL3（15%） 显色剂（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。 0.1M KCN:0.1628g KCN溶于水中稀释至250ml A、将1.25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）浓度的溶液。 B、将2.5ml 0.01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。此溶剂用时，A、B两溶液在前一天合并，配好的溶液仅能在1-2天内使用，过时失效须重配。 五、方法与步骤： 1、树脂的处理： 关于市售新树脂的处理见7、，本实验采用处理好的树脂。 2、装柱：将层析柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约1cm高的柠檬酸缓冲液。将经处理已成钠型的树脂置于烧杯中，加进1倍体积的柠檬酸缓冲液，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满。倒时不要太快，以免产生泡沫。待树脂在柱底逐渐沉积至约1cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液直至柱体装到8cm高度为止。 在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬浮液的温度要相对恒定（特别是

阴阳离子交换树脂的保存和预处理

阳离子交换树脂 树脂的贮存： 离子交换树脂肪内含有一定量的水份，在运输及贮存过程中应尽量保持这部分水。如贮存过程中树脂脱了水，应先用浓食盐水（-10%）浸泡，再逐渐稀释，不直接放于水中，以免树脂急剧膨胀而破碎。 在长期贮存中，强型树脂应转变成盐型，弱型树脂可转变成相应的氢型或游离碱型也可转为盐型，然后浸泡在洁净的水中。树脂在贮存或运输过程中，应保持在5-40°C的温度环境中，避免过冷或过热，影响质量。若冬季没有保温设备时，可将树脂贮存在食盐水中，食盐水的温度可根据气温而定。 新树脂的预处理： 新树脂常含有溶剂、未参加聚合反应的物质和少量低聚合物，还可能吸铁、铝、铜等重金属离子。当树脂与水、酸、碱或其他溶液相接触时，上述可溶性杂质就会转入溶液中，在使用初期污染出水水质。所以，新树脂在投运前要进行预处理。 阳树脂预处理步骤如下： 首先使用饱和食盐水，取其量约等于被处理树脂体积的两倍，将树脂置于食盐溶液中浸泡18-20小时，然后放尽食盐水，用清水漂洗净，使排出水不带黄色;其次再用2%-4%NaOH溶液，其量与上相同，在其中浸泡2-4小时（或作小流量清洗），放尽碱液后，冲洗树脂直至排出水接近中性为止。最后用5%HCL溶液，其量亦与上述相同，浸泡4-8小时，放尽酸液，用清水漂流至中性待用。 阴离子交换树脂 树脂的贮存： 离子交换树脂肪内含有一定量的水份，在运输及贮存过程中应尽量保持这部分水。如贮存过程中树脂脱了水，应先用浓食盐水（-10%）浸泡，再逐渐稀释，不得直接放于水中，以免树脂急剧膨胀而破碎。 在长期贮存中，强型树脂应转变成盐型，弱型树脂可转变成相应的氢型或游离碱型也可转为盐型，然后浸泡在洁净的水中。树脂在贮存或运输过程中，应保持在5-40°C的温度环境中，避免过冷或过热，影响质量。若冬季没有保温设备时，可将树脂贮存在食盐水中，食盐水的温度可根据气温而定。 新树脂的预处理： 新树脂常含有溶剂、未参加聚合反应的物质和少量低聚合物，还可能吸着铁、铝、铜等重金属离子。当树脂与水、酸、碱或其他溶液 相接触时，上述可溶性杂质就会转入溶液中，在使用初期污染出水水质。所以，新树脂在投运前要进行预处理。 阴树脂的预处理 其预处理方法中的第一步与阳树脂预处理方法中的第一步相同；而后用5%HCL浸泡4-8 小时，然后放尽酸液，用水清洗至中性；而后用2%-4%NaOH溶液浸泡4-8小时后，放尽碱液，用清水洗至中性待用。 离子交换树脂是一类具有离子交换功能的高分子材料。在溶液中它能将本身的离子与溶液中的同号离子进行交换。按交换基团性质的不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两类。常用的离子交换设备装填的树脂大都是201ｘ7强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂及001ｘ7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。如果在水质要求特别高的场合则使用抛光树脂。 树脂保存方法

离子交换层析技术

离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 （一）原理 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。 溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为球蛋白，球蛋白和球蛋白。 在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。 交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl一的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl一浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。 （二）常用离子交换剂的种类与特性 1.离子交换纤维素离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1－1所示。 表1-1 离子交换剂的类型与特点

阴阳离子交换树脂分离技术

阴阳离子交换树脂分离技术 在化学除盐系统中由于设备缺陷或树脂存放时误装等原因，容易造成床内阴、阳树脂混合，使除盐系统再生不合格或制水水质变差。本文利用阴、阳树脂的比重差，采用浮选法将混合过后的阴、阳树脂进行分离，从而恢复除盐系统出水品质，同时避免了更换树脂造成的浪费。 标签：阴树脂；阳树脂；氯化钠；搅拌；分离 1 現状 汽水二车间化水专业一级除盐设备F系列发现阴床出水电导率、pH、碱度均高，阴床再生后正洗、循环时间较长，且设备周期制水量明显下降，由原来的24小时降为19小时。 2 原因排查 通过对F系列制水系统出水水质、系统流程的梳理，并且对阴床树脂进行取样分析鉴别，发现阴床内部树脂里确实含有部分阳树脂。 分析阴床内阳树脂的混入途径，结合反洗过程的工艺流程，进行查找。因反洗罐只有一台，当阴阳床树脂交替输入反洗罐时，存在树脂存留现象，这样就会造成阳树脂混入阴床。确认是在阴阳床大反洗过程中交替输入反洗罐时发生了树脂混杂。 3 解决措施 ①将F系列阳床反洗系统进行改造。将F系列阳床反洗系统与老系统阳反洗系统进行改造，解决共用一台反洗罐的问题，杜绝了阳树脂再次混入阴床内的途径； ②将阴床内混入的阳树脂进行分离。对阴、阳树脂的性质加以研究，确定实施方案。 4 一级除盐系统阴阳树脂的分离方案 4.1 阴阳树脂的物理特性 阴阳树脂均呈球状颗粒，阴树脂粒度在0.45～0.9mm，阳树脂粒度在0.63～1.25mm，阴树脂密度在湿态状态下的颗粒密度为1.05～1.11g/mL，阳树脂密度在湿态状态下的颗粒密度为1.24～1.28g/mL（如表1）。 从表1可以看出阴阳树脂的颗粒粒径范围有交叉不能采用筛分法。

分离技术

1.简述分离技术的分类及其分离原理？ （一）机械分离对象是由两相或两相以上所组成的混合物，其目的是简单地将各相加以分离，过程中间不涉及传质过程。 名称分离因子分离原理举例 沉降重力密度差水处理 离心离心力密度差油精制、牛乳脱脂 旋风分离惯性流动力密度差喷雾干燥 过滤过滤介质粒子大小除菌、喷雾干燥/果汁澄清、 颗粒分离 压榨机械力压力下液体流动油脂生产 （二）传质分离是指在分离过程中，有物质传递过程的发生，传质分离的原料，可以是均相体系，也可以是非均相体系。分为两大类：平衡分离过程和速率控制分离过程1平衡分离过程为借助分离媒介（如热能、溶剂、吸附剂等）使均相混合物系统变为两相系统，再以混合物中各组分在处于相平衡的两相中不等同的分配为依据而实现分离。2速率控制分离过程是指借助某种推动力，如浓度差、压力差、温度差、电位差等的作用，某些情况下在选择性透过膜的配合下，利用各组分扩散速度的差异而实现混合物的分离操作。分为膜分离和场分离（三）其他物理场辅助分离技术1.超声波萃取 2.微波辅助萃取 3.超声微波协同萃取 2食品为什么要分离？1获得需要的产品①农作物中非食用物质与食用物质的分离。②多层次、多样化产品的需求。2食品安全性的要求①农药残留。②工业“三废”进入食物链危害人体健康。③天然食品在生长过程中次生代谢产生多种微量的有毒成分。 3食品分离过程的特点:分离对象种类多，性质复杂。产品质量与分离过程密切相关。产品要求食用安全。分离对象在分离过程中易腐败。 4食品分离技术的选择原则：先要确定分离的目的，了解待分离混合物中各组分的物理，化学，生物学方面的性质，并要充分关注分离的目标成分。对目标成分，要了解目标成分的性质，它的相对分子质量，化学结构，理化性质，电荷性，热敏性以及生物活性等基础性资料对确定分离方法的选择起决定性作用。 5食品分离技术的考虑因素:产品纯度，回收率（主要）产品价格目标产物的特性混合物中的分子性质经济因素安全与环保 6食品分离技术在食品工业中的地位与作用 1. 是重要的食品工艺过程之一2. 提高农作物综合利用程度，生产高附加值的产品。3.改进食品的营养与风味。4. 符合卫生，安全要求。5. 改变生产面貌。 膜分离技术 1按膜的性质分：⒈天然膜⒉合成膜.按膜的结构分：⒈多孔膜⒉致密膜 3.液膜.按膜的作用机理分：1.吸附性膜2.扩散性膜 3.离子交换膜4.选择渗透膜5.非选择性膜 2膜分离技术的原理:膜分离概念：用天然的或人工合成的膜，以外加压力或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分离，分级，提纯或富集的方法，统称膜分离法。 3膜分离技术特点:在常温下进行,不发生相变化,能耗低,在密闭容器中进行,不用添加化学试剂、添加剂,选择性好,使用范围广,操作简便，易自动化操作 4膜分离的特点1.不发生相变，能耗低。2.一般在常温下操作不需加热，适应于热敏性物质 3.应用范围广。4.以压力为推动力，装置简单、体积小、操作容易、

离子交换层析

实验二离子交换层析纯化兔血清IgG 【原理】 DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基- 乙基- 葡萄糖凝胶A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH 将Cl - 型转变为OH - 型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ 球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85 ～7.5 ），其余均属酸性蛋白。pH7.2 ～7.4 的环境中。酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG 。 【试剂与器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2.0.5mol/L HCl 和NaOH 3.0.1mol/L pH7.4 PBS 4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)

5.0.02 ％NaN 3 6.PEG 7. 无水乙醇 8. 紫外分光光度计 9.1cm×20cm 玻璃层析柱 10. 自动部分收集器 【操作步骤】 1 ．DEAE-Sephadex A-50 预处理称DEAE-Sephadex A-50 （下称A-50 ）5g ，悬于500ml 蒸馏水内，1h 后倾去上层细粒。按每克A-50 加0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于0.5mol/L NaOH 液中，搅匀，静置30min ，装入布氏漏斗（垫有 2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性；再以0.5mol/L HCl 同上操作过程处理，最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将A-50 浸泡于0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。

2 ．装柱 （ 1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 （2 ）将0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50 。待A-50 凝胶沉降2 ～3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min ，同时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。 （ 3 ）关闭出水口，待A-50 凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。 3 ．平衡启开出水口螺旋夹，控制流速 4 滴/min ，使约2 倍床体积的洗脱液流出。并以pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH 值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。 4 ．加样及洗脱启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（0.5ml 血清，体积应小于床体积的2% ，蛋白浓度以＜100mg 为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面

第五章 离子交换分离法

第五章离子交换分离法 本章的教学目的与要求：了解离子交换分离法的原理及应用 授课主要内容：1）离子交换树脂的作用、性能和分类；2）离子交换的基本理论；3）离子交换分离操作方法；4）柱上离子交换分离法；5）离子交换分离实例；6）离子交换层析法 重点、难点及对学生的要求： 掌握离子交换分离法的原理及分离条件的选择 主要外语词汇：ion change resin; cation resin; anion resin 辅助教学情况：多媒体课件 复习思考题习题：1）离子交换树脂的作用、性能和分类；2）子交换树脂的分类；3）离子交换树脂选择；4）如何利用离子交换树脂进行去离子水的制备、试样中总盐量的测定、干扰组分的分离、痕量组分的富集。5）什么是树脂的交联度？如何表示？参考教材：《工业分析》机械工业出版社、重庆大学出版社，1997年，第一版 《分离及复杂物质分析》邵令娴编，化学工业出版社，1984年，第一版 课时安排：4学时 离子交换分离是目前最重要和应用最广泛的分离方法之一，不但能用于分离性质相近的无机离子，而且可以用来分离多种有机化合物，可用于分析分离，也可用于制备。 离子交换分离是应用极广的，如净化水，分离和提取物质，离子交换色谱等。 1850年，Thompson及Way最早发现和研究了离子交换现象，研究了土壤中Ca、Mg与水中K+、NH4+的交换现象。 1903年Harms合成了硼铝酸盐作为离子交换剂，Gans把天然及合成硅酸盐用于软化水及糖的净化，以后出现了磺化煤阳离子交换剂。 1933年Adams首先用人工合成酚醛类的阴阳离子交换树脂 1945年合成了聚乙烯树脂。 离子交换的理论研究在这时打下了基础。 离子交换分离的特点： 1、分离效率高（能用于带相反电荷离子分离，又能用于带相同电荷及性质相近离子的分离） 2、应用范围广（既可用于分离，又可用于富集，还可用高纯物制备及蛋白质、核酸、酶等生物活性物的纯化。无机、有机及高纯物的制备） 3、树脂可反复使用（具有再生能力） 4、操作烦，周期长，耗费洗脱液的量多（所以仅用于解决分析中较困难的分离问题） 第一节概论 离子交换剂： 1. 离子交换剂的类型 有有机、无机两种： 1）．无机离子交换剂 有磺化煤、活性炭，水合氧化物，氧化锆，Al2O3，氧化锡，氧化锑，高价金属盐、磷酸锆、钨酸锆、磷酸钛等 杂多酸盐、磷钼酸盐对Cs 选择性 亚铁氰化物：主要用于碱金属 铝硅酸盐。 这些都是现在正在发展的无机离子交换剂，以后还要介绍。最主要还是高分子聚合物的离子交换树脂。 无机离子交换剂的缺点：1、交换能力低；2、化学稳定性差；3、机械稳定性差 有机离子交换剂的特点：1、网状结构；2、难溶（水、酸、碱、有机溶剂）；3、稳（热、机械、化学）；

离子交换分离树脂

离子交换树脂概述 离子交换树脂有多种类型，其分类方法也没有统一的规定，主要 有：按树脂骨架的主要成分可分为聚苯乙烯型树脂、聚丙烯酸型树脂、环氧氯丙烷型多乙烯多胺型树脂、酚一醛型树脂等；按聚合的化学反应分为共聚型树脂和缩聚型树脂；按骨架的物理结构常分为凝胶型树脂即微孔树脂、大网格树脂即大孔树脂，有的还有均孔树脂；按活性基团分为阳郭交换树脂和阴离子交换树脂等等。其中常见是是按活性基团及骨架的物理结构的方法分类，因活性基团的种类决定了树脂的主要性质和类别；而骨架的物理结构在树脂的交换使用中影响较大。 按不同活性基团的种类进行分烃，主要的是阳离子和阴离子交换树指，其次也还有一些其他种类的树脂。 1、阳离子交换树脂 阳离子交换树脂的活性基团能解离出阳离子，而其作为交换的离子可与溶液中的其他阳离子发生交换。阳离子交换剂，相当于高分子的多元酸。因活性基团的电离程度强弱不同又有强酸性和弱酸性阳离子交换树脂的区别。 强酸性阳离子交换树脂 磺酸基团和次甲基磺酸基团都是强酸性基团，它们容易在溶液中离解出氢离子，故呈强酸性，且离解后的负电基团，能吸附结合溶液中的其他阳离子而发生交换反应。这类树脂对酸、碱和各种溶剂都比较稳定，离子交换不受溶液PH值变化的影响，适用面广泛。常用强酸进行再生处理，但强酸性树脂与氢离子的结合力较弱故再生成氢型树脂时比较困难且耗酸量较大。强绝不能性树脂主要用于水处理和制药工业中。 弱酸性阳离子交换树脂 带有羧酸基、氧乙酸基团的交换树脂，是常见的弱酸性阳离子交换树脂。这种树脂的离解性即酸性较弱，在低PH下难以离解和进行离子交换，只在碱性、中性或微酸性溶液中发生交换反应。其交换容量大，容易再生成氢型，但其交换能力弱，速度慢；化学和热稳定性差。这类树脂亦是用酸进行再生，在制药工业中使用较多。 2、阴离子交换树脂 阴离子交换树脂的活性基团能解离出阴离子，而其作为交换离子可与溶液中的其他阴离子发生交换。阴离子交换剂，相当于高分子的多元碱。依活性基团电离程度的不同，阴离子交换树脂也有碱性强弱之分。 强碱性阴离子交换树脂强碱性阴离子交换树脂的活性基主要是季胺基团，能在水中离解出氢氧根离子而呈强碱性。这种树脂的正电基团能与溶液中的阴离子吸附结合，从而产生阴离子交换作用与强酸性离子交换树脂相似，其交换反应不受溶液PH值变化的影响。商品多以氯型出售，因其稳定性和而热性相对较好。它用强碱进行再考。强碱性阴离子交换树脂主要用于制备无盐水，可除去硅酸根、碳酸根等弱酸根。 弱碱性阴离子交换树脂 这类树脂含苞欲放有弱碱性基团，如伯胺其、促胺基或叔胺基。它们在水中能离解出氢氧根而呈弱碱性，具阴离子交换作用但它在多数情况下是吸附溶液中的整个其他酸分子，只能在中性或酸性条件下工作，较容易再生成羟型，可能NaCO3、NH4OH进行再生，且耗子碱量较少。 树脂的基本类型除上述四种外，在实际使用中，常常需要转变为其他离子形式。例如强酸性阳离子树脂，直接使用中会离解出氢离了，引起溶液PH值下降，从而腐蚀设备和影响某些反应的进行。可使其与NaCL作用，转变为钠型树脂再使用工作时钠型树脂离解出钠离子并

离子交换柱交换层析法分离氨基酸知识讲解

离子交换柱交换层析法分离氨基酸

离子交换柱层析法分离氨基酸 一、实验原理 离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力（静电引力）而达到分离目的的分离技术。离子交换层析的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定pH和离子强度的电解质溶液。 树脂（惰性支持物）上结合了阳离子或阴离子后，可与阴离子或阳离子结合，改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离。由于不同的氨基酸在不同的pH值和离子强度溶液中的所带电荷各不相同，故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。从而可以在洗脱过程中按先后次序洗出，达到分离的目的。带电荷量少，与交换剂亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量大，与交换剂亲和力大的后被洗脱下来。 本次实验采用的是Amberlite IR-120阳离子交换树脂作为离子交换剂，分离的样品为Asp和Lys两种氨基酸的混合液。在一定的pH下，Asp和Lys的带电情况不同，与磺酸集团的亲和力不同，因此被洗脱下来的次序不一样。将各收集管分别用茚三酮显色后，测定吸光度，从而得到洗脱曲线。 二、实验器材 实验仪器：层析柱、恒流泵、试管*30、吸管、移液枪、烧杯、紫外分光光度计实验试剂：Amberlite IR-120阳离子交换树脂、柠檬酸缓冲液（pH5.3）、 0.5%茚三酮、0.1%CuSO4、氨基酸样品（0.005mol/L的Asp和Lys，用 0.02mol/L的HCl配制） 三、实验操作记录 1、树脂的处理

干树脂经蒸馏水膨胀，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L HCl及2mol/L NaOH依次浸洗，每次浸2h，并分别用蒸馏水洗至中性。再用1mol/L NaOH浸半小时（转型），用蒸馏水洗至中性。 2、装柱前的准备 选择直径1cm，长度15~20cm的层析柱，观察柱底端滤膜是否完好，分别用流水和蒸馏水冲洗干净。 将层析柱垂直装在铁架台上，柱进水口和出水口装上橡皮管，关闭柱底端出口，在柱内注入少许（约1cm高）的洗脱液，打开出水口，排净管内空气后关闭出水口。 3、装柱 向盛有已处理好的树脂的烧杯中加适量洗脱液，用玻棒轻轻将树脂搅成悬浮状，然后沿柱内壁小心地加至适当高度。倒入速度不要太快，以免产生泡沫和气泡。 待树脂在柱底部有明显沉积（约1cm高）后，缓慢打开出口（或用滴管吸出柱内上层过多的洗脱液），继续加入树脂直至树脂沉积达5cm高。装柱要求连续，均匀，无文格、无气泡，表面平整，液面不得低于树脂表面，否则要重新装柱。 4、平衡 层析柱装好后，接上已调好流速的恒流泵，用洗脱液以0.4mL/min的流速进行平衡，直到流出液的pH与洗脱液pH相同（约需2~3倍柱床体积）。5、加样

离子交换层析实验原理及步骤

离子交换层析实验原理及步骤 离子交换层析实验方法 阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。 1. 剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。 下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法 2. 膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml～8ml柱床体积。 表1－4 分离的血清与所需DEAE—纤维素量及其他条件的大致关系 血清样品量（ml） DEAE需用量（g） 选层析柱规格（cm） 选脱液量（ml） 1~2 2 1×25 100~150 5 5 2×12 200~300 10 10 2×20 300~400 20 20 2×37

400~800 称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。 3. 平衡 将DEAE—纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。 4. 装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为10∶1～20∶1，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。 装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE－纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。 5. 上样 要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4℃）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。 样品的加量与DEAE—纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的—球蛋白50mg～100mg，用干重约4g DEAE－纤维素装柱分离，可获得理想结果。

离子交换层析分离氨基酸

离子交换层析分离氨基酸 [目的] 1．熟悉离子交换层析技术的基本原理和方法 2．熟悉离子交换层析分离氨基酸的基本原理和操作 [原理] 氨基酸是两性电解质，不同的氨基酸有其特定的等电点，在溶液pH小于其pI值时带正电，大于其pI时带负电。故在一定的pH条件下，各种氨基酸的带电情况不同，与离子交换剂上的交换基团的亲和力亦不同。因而得到分离。本实验选用Dowex 50作为离子交换剂，它是含磺酸基团的强酸型阳离子交换剂，分离的样品为Asp、Gly、His三种氨基酸的混合液，这三种氨基酸分别属于酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸，它们在pH4.2的缓冲液中分别带负电荷和不同量的正电荷，与Dowex 50的磺酸基团之间的亲和力不同，因此被洗脱下来的顺序亦不同，可以将三种不同的氨基酸分离开来，将各收集管分别用茚三酮显色鉴定。 [操作] 1．装柱前准备：用流水冲洗层析柱、然后用蒸馏水冲洗，柱流水口装上橡皮管放入2-3ml蒸馏水，按压橡皮管内气泡，抬高流出管防止蒸馏水排空。 2．装柱：将处理好的Dowex 50悬液小心倒入层析柱内，待Dowex 50自然下沉至柱下部时，打开下端放出液体，再慢慢加入悬液至Dowex 50沉积面离层析柱上缘约3cm 时停止。装柱时注意防止液面低于交换树脂平面以及气泡的产生。 3．平衡：用pH4.2的柠檬酸钠缓冲液反复加在柱床上面，平衡10分钟，最后接通蠕动泵，调节流速1ml/min。 4．加样：柱内缓冲液的液面与树脂平面相平，但勿使树脂露出液面，马上用滴管加7滴样品在树脂平面上（注意不能使树脂平面破坏），然后加少量缓冲液使样品进入柱内，反复两次，当样品完全进入树脂床后，接通蠕动泵，用PH4.2的柠檬酸钠缓冲液洗脱，分步收集器收集。 5.收集与检测：取12支试管编号，每管加入茚三酮显色液20滴，依次收集洗脱液每管2m1，混匀，置沸水浴15分钟取出，观色，用自来水冷却后在波长570mm处比色、当收集至第二洗脱峰刚出现时，(茚三酮显色)即换用0.1N NaOH溶液洗脱直至第三洗脱峰出现后，停止洗脱。 6．树脂的再生：用o.1N NaOH溶液洗脱层析柱l0分钟。 7．回收树脂，拔去橡皮接收管用洗耳球对着玻璃流出口将树脂吹入装树脂的小瓶内加入0.1N NaOH浸泡。 8．洗脱曲线的绘制：以吸光度为纵座标，洗脱体积为横座标绘制曲线。 [器材] 1. 722型分光光度计 2．层析柱(0.8×18cm) 3．试管 [试剂] 1．0.1N NaOH 2．氨基酸混合液：Gly、Asp、His各10mg溶于30m1 0.06M pH4.2柠檬酸钠缓冲液中。 3．0.06M pH4.2柠檬酸钠缓冲液：取柠檬酸三钠98.0g溶于蒸馏水中，再加入42ml 12N HCl和6m1 80％苯酚(现用可不加苯酚)最终加蒸馏水至5000m1，用pH计调节溶

生化实验报告离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶

实验报告 一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析 一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法 二、实验内容和原理 1、离子交换层析 由于蔗糖酶的偏酸性,所以在7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测 蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。（100℃显色） 三、实验材料和主要仪器 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂 ⑴ ⑵ 20 7.3 缓冲液 ⑶ 20 （1 ）7.3缓冲液 ⑷ 0.2乙酸缓冲液，4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液 ⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器 （1）高速冷冻离心机 （2）层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）

（3）? （1套/组） （4）部分收集器及收集试管（4管）（1台/组） （5）－20℃冰箱（保存样品用） （6）微量移液枪 200、1000 （7）1.5离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用） （8）7离心管（留样品Ⅳ用） （9）恒温水浴（50℃、100℃） （10）试管、移液管、试管架等 四、实验方法和步骤 1、仪器连接 （1）接通各仪器电源，将泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。注意B为含溶液。 （2）点击电脑桌面上软件图标，打开软件。选择，点击，进入操作界面。点击 （3）在操作界面的工具栏，点击。出现窗口，调节为 1，确定。 2、装柱与平衡 （1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。 （2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（)相连，下端接头与样品阀（ )相连。 （3）平衡一个柱体积（约2020） 3、加样 停止加入20 7.3 缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，程序暂停。旋开柱上方接头，用胶头滴管缓慢将5蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。程序继续，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，程序暂停，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加缓冲液至一定高度。 4、洗脱（梯度洗脱法） （1）加样后，先用进行洗脱，洗去未被凝胶吸附的杂蛋白（20左右）； （2）待层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定，在程序主界面的工具栏→ → → ，在两个框内均填入100，点击，最后点击一次，开始梯度洗脱。每2接一管，当上升至8 时，开始测定各管的蔗糖酶活力； （3）将蔗糖酶活力高的若干管酶液（2-3管）合并，测量总体积V4（样品Ⅳ），样品用7离心管－20℃保存。 5、蔗糖酶活力检测