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酶切位点所加保护碱基

酶切位点所加保护碱基
酶切位点所加保护碱基

寡核苷酸近末端位点的酶切

(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。

单位的寡实验方法:用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A

260

核苷酸。取1 μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20°C条件下分别

, 反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl

2

5 mM DTT及适量的NaCl或KCl(视酶的具体要求而定)。20%的PAGE(7 M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。

本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。

克隆PCR产物的方法之一,是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点,经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明,大多数限制酶对裸露

的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基,才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。

下表列举了15种限制酶,分别比较了各种限制酶在其酶切位点旁边分别加0、1、2、3个保护碱基后的切断情况。表中的:(-)为不能切断;(±)为

不能完全切断;(+)为能完全切断。

结果显示,基本上所有限制酶,在其酶切位点旁边加上3个以上的保护碱基后,可以对其酶切位点进行有效切断。

Linearized vectors were incubated with the indicated enzymes (10 units/μg) for 60 minutes at the recommended incubation temperat NEBuffer for each enzyme. Following ligation and transformation, cleavage efficiencies were determined by dividing the number of tra from the digestion reaction by the number obtained from religation of the linearized DNA (typically 100-500 colonies) and subtracting "Base Pairs from End" refers to the number of double-stranded base pairs between the recognition site and the terminus of the fragment; does not include the single-stranded overhang from the initial cut. Since it has not been demonstrated whether these single-stranded contribute to cleavage efficiency, 4 bases should be added to the indicated numbers when designing PCR primers. Average efficiencies w to the nearest whole number; experimental variation was typically within 10%. The numbers in parentheses refer to the number of indep for each enzyme tested (from Moreira, R. and Noren, C. (1995), Biotechniques, 19, 56-59).

Note: As a general rule, enzymes not listed below require 6 bases pairs on either side of their recognition site to cleave efficiently.

| A | B | E | H | K | M | N | P | S | X |

酶切位点保护碱基表

酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶 酶切反应 来源:easylabs 发布时间:2009-11-08 查看次数:12704 本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列,如AccI,A flIII,AscI,AvaI,BamHI,BglII,BssHII,BstEII,BstXI,ClaI,Eco RI,HaeIII,HindIII,KpnI,MluI,NcoI,NdeI,NheI,NotI,NsiI,Pa cI,PmeI,PstI,PvuI,SacI,SacII,SalI,ScaI,SmaI,SpeI,SphI,StuI,XbaI,XhoI,XmaI, 为什么要添加保护碱基? 在分子克隆实验中,有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点,用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开,因此在设计PCR引物时,人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列,即保护碱基,用来提高将来酶切时的活性。 其次,在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时,相临的两个酶切位点往往不能同时使用,因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 该如何添加保护碱基? 添加保护碱基时,最关心的应该是保护碱基的数目,而不是种类。什么样的酶切位点,添加几个保护碱基,是有数据可以参考的。 添加什么保护碱基,如果严格点,是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小,GC%较低,添加时多加G或C,反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。 单实验方法:用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A 260 位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20°C 条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), , 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl(视酶的具体要求而定)。 10 mM MgCl 2 20%的PAGE(7M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切

酶切位点保护碱基

酶寡核苷酸序列 切割率% 2 hr20 hr Not I TT GCGGCCGC AA ATTT GCGGCCGC TTTA AAATAT GCGGCCGC TATAAA ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA 10 10 25 25 10 10 90 >90 Nsi I TGC ATGCAT GCA CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT 10 >90 >90 >90 Pac I TTAATTAA G TTAATTAA C CC TTAATTAA GG 0 25 >90 Pme I GTTTAAAC G GTTTAAAC C GG GTTTAAAC CC AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG 75 25 50 >90 Pst I G CTGCAG C TGCA CTGCAG TGCA AA CTGCAG AACCAATGCATTGG AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT 10 >90 >90 10 >90 >90 Pvu I C CGATCG G AT CGATCG AT TCG CGATCG CGA 10 25 10 Sac I C GAGCTC G1010 Sac II G CCGCGG C TCC CCGCGG GGA 50 >90 Sal I GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCG G ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCG GAA 10 10 50 75 Sca I G AGTACT C AAA AGTACT TTT 10 75 25 75

限制性内切酶保护碱基表

PCR设计引物时酶切位点的保护碱基表

ApaI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5'GGGCC^C 3' BamHI(类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' G^GATCC 3' BglII (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' A^GATCT 3' EcoRI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' G^AATTC 3' HindIII (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' A^AGCTT 3' KpnI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' GGTAC^C 3' NcoI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' C^CATGG 3' NdeI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' CA^TATG 3' NheI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' G^CTAGC 3' NotI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' GC^GGCCGC 3' SacI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' GAGCT^C 3' SalI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' G^TCGAC 3' SphI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' GCATG^C 3'

各种酶切位点的保护碱基引物设计必看

各种酶切位点的保护碱基 酶不同,所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下,在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的,我们一般都随便加3个碱基做保护。 寡核苷酸近末端位点的酶切 (Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。 实验方法:用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH , 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl(视酶的具体要求而定)。20%的PAGE(7 M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。

2.双酶切的问题 参看目录,选择共同的buffer。其实,双酶切选哪种buffer是实验的结果,takara公司从1979年开始生产限制酶以来,做了大量的基础实验,也积累了很多经验,目录中所推荐的双酶切buffer 完全是依据具体实验结果得到的。 有共同buffer的,通常按照常规的酶切体系,在37℃进行同步酶切。但BamH I在37℃下有时表现出star活性,常用30℃单切。 两个酶切位点相邻或没有共同buffer的,通常单切,即先做一种酶切,乙醇沉淀,再做另一种酶切。 3.酶切底物DNA,切不开 1)底物DNA上没有相应的限制酶识别位点,或酶切位点被甲基化。 2)PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误,致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质,会影响酶切,据报道,通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。 3)酶切条件的确认,包括反应温度和反应体系等。同样的DNA,同样量,用不同的限制酶切情况可能不同,由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA,不同的反应体系,酶切效果也可能不同,由于一些空间因素或不可测因素造成的。 4)公司出售的限制酶都是液体状态,都是根据最佳反应体系配制了浓度,不可以再用buffer稀释,因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系,酶浓度越稀,相对活性越低,并且越不稳定,有时便会出现底物DNA不能被切断的现象。 不同公司的酶和buffer不要交叉使用,否则可能会影响酶切效果。 5)酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶,或将质粒DNA转入甲基化酶欠损的宿主菌中,重新制备DNA,也可以使用PCR的方法对DNA进行扩增,再做酶切。常用的有XbaI容易受甲基化影响,通常选用GM33做宿主菌转化。 6)底物不纯,含有限制酶阻害物质,影响酶切作用,需要重新纯化DNA。一般做乙醇沉淀纯化即可。如果质粒中含盐或酚等,都会影响酶切效果。

各种酶切位点的保护碱基引物设计必看

各种酶切位点的保护碱基引物设计必看 Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】

各种酶切位点的保护碱基酶不同,所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下,在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的,我们一般都随便加3个碱基做保护。 寡核苷酸近末端位点的酶切 (Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。 实验方法:用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH , 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl(视酶的具体要求而定)。20%的PAGE(7 M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。

2.双酶切的问题 参看目录,选择共同的buffer。其实,双酶切选哪种buffer是实验的结果,takara公司从1979年开始生产限制酶以来,做了大量的基础实验,也积累了很多经验,目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。 有共同buffer的,通常按照常规的酶切体系,在37℃进行同步酶切。但BamH I在37℃下有时表现出star活性,常用30℃单切。 两个酶切位点相邻或没有共同 buffer的,通常单切,即先做一种酶切,乙醇沉淀,再做另一种酶切。 3.酶切底物DNA,切不开 1)底物DNA上没有相应的限制酶识别位点,或酶切位点被甲基化。 2)PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误,致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质,会影响酶切,据报道,通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。3)酶切条件的确认,包括反应温度和反应体系等。同样的DNA,同样量,用不同的限制酶切情况可能不同,由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA,不同的反应体系,酶切效果也可能不同,由于一些空间因素或不可测因素造成的。

酶切位点的保护碱基原则

1 bp 2 bp 3 bp 4 bp 5 bp AciI- + + ++ +++ AgeI+++ +++ +++ +++ +++ AgeI-HF?++ +++ +++ +++ +++ AluI- +++ +++ +++ +++ ApaI+++ +++ +++ +++ +++ AscI+++ +++ +++ +++ +++ AvrII++ ++ +++ +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end 1 bp 2 bp 3 bp 4 bp 5 bp BamHI+ ++ +++ +++ +++ BamHI-HF?+ + +++ +++ +++ BglII++ +++ +++ +++ +++ BmtI+++ +++ +++ +++ +++ BmtI-HF?+++ +++ +++ +++ +++ BsaI+++ +++ +++ +++ +++ BsaI-HF?+++ +++ +++ +++ +++ BsiWI++ +++ +++ +++ +++ BsmBI+++ +++ +++ +++ +++ BsrGI+++ +++ +++ +++ +++ BssHII+ +++ +++ +++ +++

1 bp 2 bp 3 bp 4 bp 5 bp ClaI- - + +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end 1 bp 2 bp 3 bp 4 bp 5 bp DdeI+++ +++ +++ +++ +++ DpnI- ++ ++ nt nt DraIII+++ +++ +++ +++ +++ DraIII-HF?+++ +++ +++ +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end 1 bp 2 bp 3 bp 4 bp 5 bp EagI++ +++ +++ +++ +++ EagI-HF?+ +++ +++ +++ +++ EcoRI+ + ++ ++ +++ EcoRI-HF?+ + ++ +++ +++ EcoRV++ ++ ++ ++ +++ EcoRV-HF?+ ++ ++ ++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end 1 bp 2 bp 3 bp 4 bp 5 bp FseI+ ++ +++ +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end 1 bp 2 3 4 5 bp

酶切位点保护碱基

本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列,如AccI,AflIII,AscI,AvaI,BamHI,BglII,BssHII,BstEII,BstXI,ClaI,EcoRI,HaeIII,HindIII,KpnI,MluI,NcoI,NdeI,NheI,NotI,NsiI,PacI,PmeI,PstI,PvuI,SacI,SacII,SalI,ScaI,SmaI,SpeI,SphI,StuI,XbaI,XhoI,XmaI, 为什么要添加保护碱基? 在分子克隆实验中,有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点,用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开,因此在设计PCR引物时,人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列,即保护碱基,用来提高将来酶切时的活性。 其次,在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时,相临的两个酶切位点往往不能同时使用,因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 该如何添加保护碱基? 添加保护碱基时,最关心的应该是保护碱基的数目,而不是种类。什么样的酶切位点,添加几个保护碱基,是有数据可以参考的。 添加什么保护碱基,如果严格点,是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小,GC%较低,添加时多加G或C,反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。 实验方法:用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A26单位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在2 0 0°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl(视酶的具体要求而定)。20%的PAGE(7M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。

酶切位点保护碱基

Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) To test the varying requirements restriction endonucleases have for the number of bases flanking their recognition sequences, a series of short, double-stranded oligonucleotides that contain the restriction endonuclease recognition sites (shown in red) were digested. This information may be helpful when choosing the order of addition of two restriction endonucleases for a double digest (a particular concern when cleaving sites close together in a polylinker), or when selecting enzymes most likely to cleave at the end of a DNA fragment. The experiment was performed as follows: 0.1 A260 unit of oligonucleotide was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase and -[32P] ATP. 1 μg of 5′[32P]-labeled oligonucleotide was incubated at 20°C with 20 units of restriction endonuclease in a buffer containing 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT and NaCl or KCl depending on the salt requirement of each particular restriction endonuclease. Aliquots were taken at 2 hours and 20 hours and analyzed by 20% PAGE (7 M urea). Percent cleavage was determined by visual estimate of autoradiographs. As a control, self-ligated oligonucleotides were cleaved efficiently. Decreased cleavage efficiency for some of the longer palindromic oligonucleotides may be caused by the formation of hairpin loops.

【免费下载】NEB保护碱基 各种酶切位点保护碱基

PCR 设计引物时酶切位点的保护切割率%酶 寡核苷酸序列 2 hr 20 hr Acc I G GTCGAC C CG GTCGAC CG CCG GTCGAC CGG 0 0 00 0 0Afl III C ACATGT G CC ACATGT GG CCC ACATGT GGG 0 >90 >900 >90 >90Asc I GGCGCGCC A GGCGCGCC T TT GGCGCGCC AA >90 >90 >90>90 >90 >90Ava I C CCCGGG G CC CCCGGG GG TCC CCCGGG GGA 50 >90 >90>90 >90 >90BamH I C GGATCC G CG GGATCC CG CGC GGATCC GCG 10 >90 >9025 >90 >90Bgl II C AGATCT G GA AGATCT TC GGA AGATCT TCC 0 75 250 >90 >90BssH II G GCGCGC C AG GCGCGC CT TTG GCGCGC CAA 0 0 500 0 >90BstE II G GGT(A/T)ACC C 010BstX I AACTGCAGAA CCAATGCATTGG AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT 0 25 250 50 >90Cla I C ATCGAT G G ATCGAT C CC ATCGAT GG CCC ATCGAT GGG 0 0 >90 500 0 >90 50EcoR I G GAATTC C CG GAATTC CG >90 >90 >90 >90 、管路敷设技术通过管线敷设技术,不仅可以解决吊顶层配置不规范问题,而且可保障各类管路习题到位。在管路敷设过程中,要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标高等,要求技术交底。管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式,为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题,合理利用管线敷设技术。线缆敷设原则:在分线盒处,当不同电压回路交叉时,应采用金属隔板进行隔开处理;同一线槽内,强电回路须同时切断习题电源,线缆敷设完毕,要进行检查和检测处理。、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备,在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验;通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系,根据生产工艺高中资料试卷要求,对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验;对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作;对于继电保护进行整核对定值,审核与校对图纸,编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案,编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案;对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。对于调试过程中高中资料试卷技术问题,作为调试人员,需要在事前掌握图纸资料、设备制造厂家出具高中资料试卷试验报告与相关技术资料,并且了解现场设备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况,然后根据规范与规程规定,制定设备调试高中资料试卷方案。、电气设备调试高中资料试卷技术电力保护装置调试技术,电力保护高中资料试卷配置技术是指机组在进行继电保护高中资料试卷总体配置时,需要在最大限度内来确保机组高中资料试卷安全,并且尽可能地缩小故障高中资料试卷破坏范围,或者对某些异常高中资料试卷工况进行自动处理,尤其要避免错误高中资料试卷保护装置动作,并且拒绝动作,来避免不必要高中资料试卷突然停机。因此,电力高中资料试卷保护装置调试技术,要求电力保护装置做到准确灵活。对于差动保护装置高中资料试卷调试技术是指发电机一变压器组在发生内部故障时,需要进行外部电源高中资料试卷切除从而采用高中资料试卷主要保护装置。

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