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酪氨酸修饰电极同时测定

酪氨酸修饰电极同时测定
酪氨酸修饰电极同时测定

银掺杂聚L -酪氨酸修饰电极同时测定多巴胺二肾上腺素和抗坏血酸

孙登明* 田相星 马伟

(淮北师范大学化学与材料科学学院,淮北235000

)摘 要 用循环伏安法制备银掺杂聚L -酪氨酸修饰玻碳电极,研究了多巴胺二肾上腺素和抗坏血酸在其电极上的电化学行为,建立了同时测定多巴胺二肾上腺素和抗坏血酸的新方法三当3种组分共存时,在磷酸盐缓冲溶液(p H6.0)中,扫描速率为140m V /s ,多巴胺和肾上腺素在修饰电极上分别产生还原峰,峰电位分别为0.198和-0.205V ,多巴胺和肾上腺素氧化峰重叠,峰电位为0.313V (v s .A g /A g

C l );抗坏血酸产生一个氧化峰,峰电位0.108V (v s .A g /A g C l )三多巴胺和肾上腺素的ΔE p c =0.403V ,抗坏血酸的氧化峰与多巴胺和肾上腺素的ΔE p a =0.205V ,用还原峰和氧化峰可同时测定多巴胺二肾上腺素和抗坏血酸,3种组分同时测定的线性范围分别为5.00?10-6~1.00?10-4m o l /L ,8.00?10-6~1.0?10-4m o l /L 和3.00?10-5~1.00?

10-3m o l /L ;检出限分别为5.0?10-7,8.0?10-7和5.0?10-6m o l /L 三本方法用于人尿液中多巴胺二肾上腺素和抗坏血酸的同时测定,结果满意三

关键词 L -酪氨酸;多巴胺;肾上腺素;抗坏血酸;银掺杂;化学修饰电极 2010-04-29收稿;2010-07-10接受

本文系安徽省高校省级自然科学研究重点项目基金(N o .K J 2008A 122),安徽省含能材料重点实验室科学研究基金(N o .

K L E M 2009008)资助项目*E -m a i l

:1 引 言

多巴胺(D A )和肾上腺素(E P )是哺乳动物重要的神经传递物质,可以影响多种生理过程三D A 失调

和E P 代谢障碍会导致某些疾病的发生,

如精神分裂症二帕金森氏症二药物和毒品成瘾及艾滋病等[1~4

]三抗坏血酸(A A )是人体不可缺少而又不能在体内合成的一种营养物质,主要来源于蔬菜二水果等天然食物中;A A 又是重要的食品营养强化剂及抗氧化剂[5]

,

可用于抗坏血病的预防和辅助治疗三因此,研究D A ,E P 和A A 的测定方法具有重要意义三化学修饰电极特别是聚合物修饰电极由于活性基团的浓度

大,电化学响应信号强,能提高测定的灵敏度,且稳定性好,在分析化学中已被广泛应用,在D A ,E P 和

A A 的分别测定中,

已有许多报道[6~8]

三在聚合物修饰电极中掺杂金属或化合物可明显提高测定灵敏度二电子传质速率和选择性,但目前研究大多为单一组分的测定[9,10],多组分的测定报道很少[11,12

]三用金属掺杂聚合物修饰电极对D A ,E P 和A A 的同时测定还未见报道三

本研究采用C V 在玻碳电极表面聚合制备了银掺杂聚L -酪氨酸修饰电极(A g -

P L T /G C E /C M E )三由于银的掺杂,使测定D A ,E P 和A A 的选择性明显提高三在P B S (p H 6.0)中,扫描速率为140m V /s 时,在修饰电极上,D A 和E P 的ΔE p c =0.403V ,A A 的氧化峰与D A 和E P 的重叠氧化峰ΔE p a =

0.205V ,不需分离,可直接用于样品中D A ,E P 和A A 的同时测定三

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

B A S 100B /W 电化学分析系统(美国B A S 公司);p H S -3

C 型酸度计(上海康仪仪器有限公司);电化学实验用三电极系统:玻碳电极(G C E )或A g L T /G C E 为工作电极,A g /A g C l (饱和K C l )为参比电极,铂丝为对电极三1.0mm o l /L

D A (N e wJ e r s e y 公司),1.0mm o l /L

E P (S i g

m a 公司),0.01m o l /LA A 避光冷存,使用时逐级稀释至所需浓度;饱和酪氨酸溶液;磷酸盐缓冲溶液(P B S ):p

H 2.5~11.0,用0.1m o l /L

N a 3P O 4,N a 2H P O 4,N a H 2P O 4,H 3P O 4溶液配制,

在p H 计上校准三其它试剂均为分析纯或优级纯三实验用水为二次石英亚沸蒸馏水三

2.2 修饰电极的制备

将G C E (Ф3.0m m )在湿润的金相砂纸上磨光,然后用A l 2O 3(

0.05μm )悬乳液抛光成镜面,依次用H N O 3(1?1,V /V )超声波清洗(5m i n /次),再用水洗涤后,放入10m L 含5.0?10-4

m o l /LA g N O 3,

4.8?10-2

m o l /LH N O 3,饱和L -酪氨酸,0.15m o l /LK N O 3的聚合液中,

以G C E 为工作电极,A g /A g C l 电极为参比电极,铂丝为对电极,在2.4~-0.8V 电位范围内,以120m V /s 的扫描速率循环扫描8圈,

取出用亚沸水淋洗电极表面,晾干,即制得银掺杂聚L -酪氨酸修饰玻碳电极(A g -P L T /G C E /C M E )三2.3 实验方法

在10m L 容量瓶中,加入适量D A ,E P 和A A 标准溶液,用P B S (p

H6.0)稀释至刻度,倒入电解池中,以A g -

P L T /G C E /C M E 为工作电极,A g /A g C l 电极为参比电极,铂丝为对电极,静置5s ,然后以140m V /s 的扫描速率向正电位方向扫描三记录-0.6~0.8V 的C V 图,测量C V 图上的D A ,E P 的还原峰电流和

A A 的氧化峰电流及它们的峰电位三每次扫描结束后,

用水冲洗,滤纸吸干后,即可进行下一次测定三3 结果与讨论

3.1 银掺杂聚L -酪氨酸修饰电极的聚合循环伏安曲线图1为银和L -酪氨酸在最佳聚合条件下聚合过程的C V 图三从图1可见,在聚合第1圈,在0.50V 左右出现一个小的氧化峰三根据文献[13],这可能是由于沉积在电极表面的银溶出所形成的三在1.0V 左右,

出现一个较宽的酪氨酸氧化峰,并随扫描次数的增加,峰电位不变,峰电流增加,但增加的幅度减小三实验证明,聚合扫描次数<8圈时,随着扫描次数的增加,对D A ,E P 和A A 的响应电流增大,

这是由于聚合在电极表面的银和L -酪氨酸浓度增大,活性中心增加;聚合扫描次数>8圈时,响应电流基 图1 银和L -酪氨酸聚合过程的循环伏安曲线F i g .1 C y

c l i cv o l t a mm e t r i cc u r v e so fs i l v e ra n

d L -t y r o s i n

e a c i d i n t h e p o l y m e r i z a t i o n p r o c e s s v :120m V /s ;1-8i n d i c a t e t h e t o t a l n u m b e r o

f s w e e p s 本不变,这是由于电极表面聚合膜趋于完整,活性中心达到饱和三故本研究扫描圈数选用8圈三

3.2 D A ,E P 和A A 在不同电极上的C V 曲线

图2分别为5.0?10-5m o l /L D A (A )二2.5?10-5m o l /L E P (B )和1.0?10-4m o l /L A A (C )

在G C E 二A g /G C E /C M E 二P L T /G C E /C M E 和A g -P L T /G C E /C M E 上的C V 三由图2A 可见,D A 在

G C E 上有一个不明显氧化还原峰,E p a =323m V ,E p c

=277m V ,I p a =-1.12μA ,I p

c =1.01μA ;在A g /G C E /C M E 和P L T /G C E /C M E 上D A 的还原峰相

同,E p c =293m V ,I p c =4.78μA ,氧化峰相差较小,E p a 分别为353和355m V ,I p

a 分别为-4.86和-5.03μA ;在A g -

P L T /G C E /C M E 上,E p a =357m V 和E p c =278m V ,I p a =-10.5μA ,I p c =9.06μA ,峰电流明显增大三由图2B 可见,E P 在G C E 上有一个不明显氧化峰和两个还原峰,分别为E p a =380m V ,E p c 1=334m V 和E p c 2=-63.0m V ,I p

a =-0.65μ

A ,I p c 1=0.32μA ,I p c 2=0.13μA ;在P L T /G C E /C M E 和A g /G C E /C M E 上E P 的氧化峰电位和峰电流相同,峰电位分别为E p a =417m V ,E p c 1=327m V 和E p c 2=-61.0m V ,I p a =-15.48μA ,I p

c 1=10.09μA ,I p c 2=2.58μ

A ;在A g -P L T /G C E /C M E 上,E p a =436m V ,E p c 1=338m V 和E p c 2=-37.0m V ,I p a =-27.09μA ,I p c 1=16.89μA ,I p

c 2=2.97μA ,峰电流明显增大三由图2C 可见,A A 在G C E 上有一个不明显氧化峰,E p a =0.268V ,I p a =-6.57μ

A ,在P L T /G C E /C M E 二A g /G C E /C M E 和P L T -A g /G C E /C M E 上,峰电位E p a 分别为0.276,0.277和0.281V ,峰电流I p

a 分别为-19.96,-20.18和-38.32μA 三实验表明,

当银掺杂后,由于纳米银[13]

具有更高的催化活性,且银沉积量在扫描8圈时,与L -酪氨酸共聚后,对D A ,E P 和A A 的催化作用最强,

灵敏度最高三

分析化学

第38卷

第期孙登明等:银掺杂聚L-酪氨酸修饰电极同时测定多巴胺二肾上腺素和抗坏血酸

图2 D A(A)二E P(B)和A A(C)在不同电极上的C V 曲线

F i g.2 C y c l i c v o l t a mm e t r i c c u r v e s o f d o p a m i n e(D A)(A)二e p i n e p h r i n e(E P)(B)a n da s c o r b i c a c i d(A A)

(C)a t d i f f e r e n t e l e c t r o d e s

A.v:120m V/s,P B S(p H5.5);

B.v:100m V/s,P B S(p H4.0);

C.v:120m V/s,P B S(p H2.5),G C E(1),A g/

G C E/C M E(2),P L T/G C E/C M E(3)a n dA g-P L T/G C E/C M E(4).

3.3p H对D A,E P和A A测定的影响

图3为D A,E P和A A在不同p H值时的C V曲线三当D A二A A的扫描速率(v)为120m V/s,E P 的v为100m V/s时,随着p H值的增加,D A和E P氧化峰和还原峰及A A的氧化峰电位均负移,在p H2.5~11.0范围内,峰电位与p H值呈良好的线性关系,其线性回归方程分别为:E p a(V)=0.6830-0.06101p H(r=0.9930),E p c(V)=0.5158-0.05200p H(r=0.9954),斜率分别为61.0和52.0m V/ p H(D A);E p a(V)=0.6915-0.06185p H(r=0.9952),E p c2=0.1563-0.05454p H(r=0.9961),斜率分别为61.9和54.5m V/p H(E P);E p a(V)=0.3632-0.04000p H(r=0.9935),斜率为40.0m V/p H (A A)三说明D A和E P在该修饰电极上的氧化还原过程有质子参与,且为等电子等质子过程,A A在氧化过程中也有质子参与三D A,E P和A A分别在p H5.5二4.0和2.5时,峰电流较大,故单独测定时,分别选择p H5.5二4.0和2.5的P B S控制底液的酸度三当D A,E P和A A共存,p H<6时,E P和D A的还原峰不能很好地分离;当p H>6时,A A和E P二D A的重叠氧化峰不能很好地分离三考虑D A,E P和A A的灵敏度和分离效果,缓冲液选用p H6.0的P B S三

图3 D A(A),E P(B)和A A(C)在A g-P L T/G C E/C M E上随p H的变化的C V曲线

F i g.3 E f f e c t s o f p Ha tA g-P L T/

G C E/C M Eo n t h e c y c l i c v o l t a mm e t r i c r e s p o n s e o fD A(A),E P(B)a n d

A A(C)

p H(1-18):2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0,10.5,11.0.

3.4扫速对D A,E P和A A测定的影响

按实验方法,分别测定D A,E P和A A在不同的扫速下的C V曲线三结果表明,在20~600m V/s 范围内,随着扫速的增大,D A,E P和A A的响应电流增加三扫速在20~600m V/s范围内,D A,E P和

A A的氧化峰电流和D A,E P的还原峰电流与扫速的平方根均成正比,其线性回归方程分别为I p a=

7.517-66.77v1/2(r=0.9975),I p c=-11.04+80.86v1/2(r=0.9960)(D A);I p a=3.543-174.5v1/2(r=

0.9970),I p c=-20.15+181.0v1/2(r=0.9947)(E P);I p a=6.152-187.9v1/2(r=0.9932)(A A)三表明

D A,

E P和A A在电极表面的氧化和还原过程受扩散控制三扫描速率较小时,响应电流较小,扫描速率较大时,峰形变差三同时测定时,本实验扫描速率选用140m V/s三

3.5 C V 法分别和同时测定D A ,E P 和A A

利用C V 法对D A ,E P 和A A 进行分别测定三在选定的最佳条件下,D A ,E P 和A A 的校准曲线分别为:D A 在1.00?10-6~3.00?10-5m o l /L ?和3.00?10-5~5.00?10-4m o l /L ?浓度范围内与其峰电流呈线性关系,其I p a (A )=-0.5748?10-6-0.2664C D A (m o l /L ),r =0.9945?;I p a (A )=-7.606?10-6-0.05310C D A (m o l /L ),r =0.9974?,I p

c (A )=-0.7873?10-6+0.2184C D A (m o l /L ),r =0.9934?,I p c (A )=6.721?10-6+0.04635C D A (m o l /L ),r =0.9977?;E P 在8.00?10-7~1.00?10-5m o l /L ?和1.00?10-5~1.00?10-4m o l /L?浓度范围内与其峰电流呈线性关系,其I p

a (A )=-0.7695?10-6-1.481C E P (m o l /L ),r =0.9943?,I p

a (A )=-10.86?10-6-0.6493C E P (m o l /L ),r =0.9959?,I p c (A )=0.4111?10-6+1.048C E P (m o l /L ),r =0.9942?,I p c (A )=8.193?10-6+0.3486C E P (m o l /L ),r =0.9959?;A A 在3.00?10-6~5.00?10-4m o l /L 浓度范围内与其峰电流呈线性关系,其I p

a (A )=-5.347?10-6-0.3308C A A (m o l /L ),r =0.9977三检出限分别为5.0?10-7,1.0 图4 D A ,E P 和A A 共存时的C V 曲线F i g .4 C y l i c v o l t a mm o g

r a m s o f t h em i x t u r e o f D A ,E Pa n dA A

P B S (p

H6.0),v :140m V /s ?10-7和5.0?10-7m o l /L 三图4为5.0?10-5m o l /L D A ,E P 和1.0?

10-3m o l /LA A 共存时,在A g -P L T /G C E /C M E 上的C V 曲线三图5出现两个还原峰和两个氧化峰:E p c (E P )=-205m V ,E p c (D A )=198m V ,E p a (A A )=108m V ,E p a

(D A+E P )=313m V 三E P 与D A 的ΔE p c =403m V ,A A 的氧化峰和D A 及E P 的重叠氧化峰的ΔE p a =205m V 三峰电流明显增加,说明A g 掺杂后,增加了电子的传递速率,测定的灵敏度和选择性明显提高,不需分离可实现对D A ,E P 和A A 的同时测定三

3种组分共存时,在选定的最佳条件下,D A ,E P 和A A 浓度同时改变的校准曲线分别为:D A 在5.00?10-6~1.00

?10-4

m o l /L 浓度范围内,

其峰电流与浓度呈线性关系,其线性回归方程为I p

c (A )=4.675?10-6+0.1154C D A (m o l /L ),r =0.9924;E P 在8.00?10-6~1.00?10-4m o l /L 浓度范围内,其峰电流与浓度呈线性关系,其线性回归方程为I p

c (A )=2.268?10-6

+0.06194C E P (m o l /L ),r =0.9921;A A 在3.00?10-5~1.00?10-3

m o l /L 浓度范围内,

其峰电流与浓度呈线性关系,其线性回归方程为I p

c (A )=-0.4422?10-6-0.03069C A A (m o l /L ),r =0.9976三检出限分别为5.0?10-7,8.0?10-7和5.0?10-6m o l /L 三

3.6 精密度和稳定性

对5.0?10-5m o l /L D A ,E P 和5.0?10-4m o l /L A A 分别进行30次平行测定,其R S D 分别为4.5%二4.0%和4.1%三该电极在室温下放置30d ,对D A ,E P 和A A 的测定基本无影响,

说明此电极具有较高的精密度和较好的稳定性三

3.7 其它共存物质的干扰

在最佳测定条件下,在含有5.0?10-5m o l /LD A ,E P 和5.0?10-4

m o l /LA A 溶液中进行测定三结

果表明,K +,N a +,A l 3+,S r 2+,B a 2+,C a 2+,C o 2+,C d 2+,C r 3+,Z n 2+,M g 2+,C l -,P b 2+,F e 3+

,尿酸,氨基酸(1.0m g ,未做最高限);I -,C u 2+(0.2m g );M n 2+,V 5+(0.1m g

)不干扰3种组分的同时测定三表1 尿样中D A ,E P 和A A 的同时测定结果(n =6

)T a b l e1 A n a l y

t i c a lr e s u l t sf o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fD A a n dE Pa n dA Ai nu r i n e (n =6

)尿样

U r i n e 加入量A d d e d (10-5m o l /L )测量值

M e a s u r e dv a l u e (10-5m o l /L )

R S D

(%,n =5)回收率

R e c o v e r y (%)D A 2.01.963.498.0E P

2.02.04

3.7102

A A 20

19.4

3.9

97.03.8 尿样分析

取2.00m L 正常人尿样,定容至100m L 三取5.00m L 稀释样品,按实验方法对D A ,E P 和A A 进行同时测定,其R S D 分别为3.4%,

3.7%和3.9%,回收率为97.0%~

102%三结果见表1三

分析化学

第38卷

第期孙登明等:银掺杂聚L-酪氨酸修饰电极同时测定多巴胺二肾上腺素和抗坏血酸

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S i m u l t a n e o u sD e t e r m i n a t i o no fD o p a m i n e,E p i n e p h r i n e a n d

A s c o r b i cA c i do nS i l v e rD o p e dP o l y(L-T y r o s i n e)

M o d i f i e dE l e c t r o d e

S U N D e n g-M i n g*,T I A N X i a n g-X i n g,MA w e i

(S c h o o l o f C h e m i s t r y a n d M a t e r i a l sS c i e n c e,H u a i b e iN o r m a lU n i v e r s i t y,H u a i b e i235000)

A b s t r a c t T h e s i l v e r d o p e d p o l y(L-t y r o s i n e)m o d i f i e de l e c t r o d ew a s p r e p a r e db y c y c l i cv o l t a mm e t r i c m e t h o d.V o l t a mm e t r i c b e h a v i o r a n dd e t e r m i n a t i o n m e t h o df o rd o p a m i n e(D A),e p i n e p h r i n e(E P), a s c o r b i c a c i d(A A)w e r e s t u d i e do n t h em o d i f i e d e l e c t r o d e.I n p H6.0p h o s p h a t e b u f f e r s o l u t i o n,t h e m o d i f i e de l e c t r o d e g a v e t w o c a t h o d i c p e a k s a t0.198Va n d-0.205V(v s.A g/A g C l)f o rD Aa n dE P, t w oo x i d a t i o n p e a k s o v e r l a p s a t0.313V(v s.A g/A g C l)f o rD Aa n dE P,o n e o x i d a t i o n p e a ka t0.108 V(v s.A g/A g C l)f o rA A.T w o s e p a r a t e d c a t h o d i c p e a k sw e r e d i v i d e d0.403m Vf o rD Aa n dE P,t h e o x i d a t i o no fA Aa n d t h e o v e r l a p p e do x i d a t i o n p e a k s o f E Pa n dD A w a s d i v i d e d0.205m V.T h e l i n e a r r e s p o n s ew a s o b t a i n e d i n t h e r a n g e o f5.00?10-6-1.00?10-4m o l/Lf o rD A,8.00?10-6-1.00?10-4m o l/Lf o rE P a n d3.00?10-5-1.00?10-3m o l/L f o rA A.T h e d e t e c t i o n l i m i t sw e r e5.0?10-7 m o l/Lf o rD A,8.0?10-7m o l/L f o r E P a n d5.0?10-6m o l/L f o rA A,r e s p e c t i v e l y.T h em e t h o dw a s s u c c e s s f u l l y a p p l i e d t ot h es i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fD A,E Pa n d A Ai nh u m a nu r i n es a m p l e s w i t hs a t i s f a c t o r y r e s u l t s.

K e y w o r d s L-T y r o s i n e;D o p a m i n e;E p i n e p h r i n e;A s c o r b i ca c i d;S i l v e rd o p e d;C h e m i c a l m o d i f i e d e l e c t r o d e

(R e c e i v e d29A p r i l2010;a c c e p t e d10J u l y2010)

酪氨酸酶

酪氨酸酶 概念:酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一种含铜的氧化还原酶,它与生物体合成色素直接相关.(长的黑有很大的一部分原因在自己)在人体中,它与色素障碍性疾病及恶性黑色素肿瘤的发生与治疗有关 (酪氨酸酶的分布与动物的生理功能息息相关,不同动物的酪氨酸酶在体内分布的部位不同.多数昆虫在正常生理状态下,酪氨酸酶以酶原的形式存在,不同类型的酪氨酸酶存在于昆虫的特定部位,以完成特定的生理功能.美洲蜚蠊存在于血红细胞内,而麻蝇则仅存在于血浆中,并且在表皮中主要以活化形式的酪氨酸酶存在.昆虫酪氨酸酶除参与黑色素的形成外还是唯一参与角质硬化的酶.昆虫高度硬化的角质能阻断微生物和异物的入侵,并为柔软的元脊椎动物身体提供了保护.在节肢动物中,酪氨酸酶还参与其他两种重要的生理过程——防御反应和伤口愈合. 哺乳动物酪氨酸酶催化产生的黑色素被分泌进入到表皮和毛发的角质细胞中,使体表着色,从而起保护皮肤和眼睛、抵御紫外线的辐射和防止内部组织过热等作用.哺乳动物酪氨酸酶常见于黑素细胞中,黑素细胞是存在于皮肤,发囊和眼睛中并产生色素的高度特异性的细胞[1“].酪氨酸酶功能减退或缺失时,即会影响黑色素代谢,从而发生疾病如白癫疯和白化病.动物与人的常染色体隐性疾病也与酪氨酸酶的缺失或活性下降有关.)作用机制:酪氨酸酶主要参与两个反应过程:催化L.酪氨酸羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌,多巴醌经一系列反应后,形成黑色素,与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生有关,并与昆虫的蜕皮(蝉蜕可以入药)和(苹果)果蔬的褐化有很大关系 (黑色素生物合成过程可大体分为两个阶段,第一阶段是由酪氨酸酶催化酪氨酸被羟化反应形成L_3,4一二羟基丙氨酸(L_多巴)(单酚酶活性),并进步将L_多巴氧化生成多巴醌(二酚酶活性)。这两步反应都是由酪氨酸酶催化的,酪氨酸酶在这里显示了独特的双重催化功能.第二阶段从多巴醌(DOPAqui—non)为原料从两个不同途径分别生成真黑素和褪黑素的过程.真黑素生成,多巴醌经多聚化反应等一系列反应生成无色多巴色素,极不稳定的无色多巴色素被另一分子多巴醌氧化为多巴色素,多巴色素经异构、脱羧生成5,6一二羟基吲哚(DHI),5,6一二羟基吲哚(DHI)由酪氨酸酶催化氧化为真黑色素的前体吲哚一5,6一醌(IndQu);褪黑素生成,多巴醌(DOPAquinon)与半胱氨酸(Cys)反应生成产生5-Cys一多巴及5-Cys一多巴醌,然后成环、脱羧变成苯肼噻嗪的衍生物,最后形成褪黑素.在第二阶段,只有少数几步反应由酪氨酸酶、异构酶或金属离子催化,大部分反应都是自发的,因此酪氨酸酶是整个黑色素生成反应的限速酶,第一阶段的两步反应是限速步骤.) 活性中心:酪氨酸酶的活性中心是由两个含铜离子位点构成.在催化过程中,双核铜离子位点以3种形态存在,分别是氧化态、还原态和脱氧态.研究表明与酪氨酸酶结合的双核铜离子活性中心与在血蓝蛋白中发现的活性中心非常相似、

酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展

现代生物医学进展https://www.wendangku.net/doc/939883153.html, Progress in Modern Biomedicine Vol.10NO.16AUG.2010 酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展* 刘振凯1艾 菁2耿美玉1,2△ (1中国海洋大学医药学院山东青岛266003;2中国科学院上海药物研究所上海201203) 摘要:酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases,PTKs )在肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、侵袭等相关信号通路中起到了关键的调控作用,已经成为肿瘤靶向性治疗的重要靶点。本文对靶向酪氨酸激酶的小分子抑制剂的筛选和评价方法进行综述,以期促进酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物的研究。 关键词:酪氨酸激酶;抗肿瘤药物;小分子抑制剂;抑制剂筛选 中图分类号: R730.5,R915文献标识码:B 文章编号:1673-6273(2010)16-3134-04Advances in Research of Protein-tyrosine Kinases Inhibitors as Anticancer Drug* LIU Zhen-kai 1,AI Jing 2,GENG Mei-yu 1,2△ (1Marine drug and food Institute,Ocean university of China,Qingdao,266003,China;2Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences,Shanghai,201203,China ) ABSTRACT:Protein tyrosine kinases (PTKs)have long been recognized as promosing therapeutic targets involved in a variety of human diseases and in particular several types of cancer.They play important roles in regulating intracellular signal transduction path-ways closely associated with the invasion,metastasis and angiogenesis of many tumors.An effort towards the development of new and more effective PTK inhibitors represents an attractive therapeutic strategy for cancer therapy.In this paper,we review the screening and evaluation methods of small-molecule inhibitors of PTKs with a view to promote the study of PTKs. Key words:Protein-tyrosine kinases;Antitumordrugs;Small-molecule inhibitors;Inhibitors screening Chinese Library Classification (CLC ):R730.5R915Document code:B Article ID:1673-6273(2010)16-3134-04 *基金项目:国家杰出青年科学基金资助(No 30725046) 作者简介:刘振凯(1983-),男,硕士。研究方向:分子药理学。E-mail :lzkai111@https://www.wendangku.net/doc/939883153.html, △通讯作者:耿美玉(1963-),研究员、博士生导师。E-mail :mygeng@https://www.wendangku.net/doc/939883153.html, (收稿日期:2010-05-07接受日期:2010-06-01) 恶性肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病。目前,临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物,这类药物大多存在难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药等缺点[1]。近年来,随着生命科学研究的飞速发展,恶性肿瘤细胞内的信号转导、 细胞周期的调控、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明,给抗肿瘤药物的研发理念带来了巨大转变。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶/蛋白作为药物靶点,筛选发现选择性强、高效、低毒的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向[2]。 蛋白酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质,它们能催化ATP 分子上的γ-磷酸基转移到底物蛋白的酪氨酸残基上,使其发生磷酸化。酪氨酸激酶分为受体型和非受体型两种。受体酪氨酸激酶是一种单次跨膜蛋白,目前至少已有近六十种分属20个家族的受体酪氨酸激酶被识别。不同的受体酪氨酸激酶和配体结合后,受体自身发生二聚化或结构重排,并进一步使受体胞内区特异的酪氨酸残基发生自身磷酸化或交叉磷酸化,从而激活下游的信号转导通路[3]。它们在信号由胞外转导至胞内的过程中发挥重要的作用。而非受体酪氨酸激酶是一种胞浆蛋白,现已经确认的有约30种,分为10大家族。蛋白酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中占据了十分重要的地位, 调节细胞生长、分化、死亡等一系列生理生化过程。蛋白酪氨酸激酶功能失调则引发生物体内一系列疾病。大量资料表明,超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性,它们的异常激活或过度表达将导致细胞无限增殖,周期紊乱,最终导致肿瘤的发生发展[4]。 同时,酪氨酸激酶调控异常还与肿瘤的侵袭、 转移,肿瘤新生血管生成,肿瘤化疗抗性等密切相关。事实上,以酪氨酸激酶为靶点进行抗肿瘤药物的开发已成为国际研究的前沿。 1酪氨酸激酶抑制剂的开发策略 目前酪氨酸激酶抑制剂的开发策略主要分为胞外、胞浆和核内三个层面:细胞外策略主要是针对于受体型,配体与受体的生物拮抗剂以及特异性抗体,通过拮抗配体和受体的相互作用,抑制酪氨酸激酶的激活[5];胞浆内策略主要分为抑制激酶区的激酶活性和拮抗酪氨酸激酶与其下游信号分子的相互作用两个方面[6];核内策略主要是利用miRNA 降解或者干扰酪氨酸激酶的mRNA ,抑制激酶的蛋白表达而达到抑制激酶活性的目的[7,8]。其中研究最多的是抑制激酶区激酶活性的小分子抑制剂,而本文也主要是针对这部分抑制剂的研究方法进行探讨。酪氨酸激酶的自磷酸化过程和催化下游信号分子磷酸化的过程都涉及到ATP 上磷酸基团的转移,这一反应过程是酪氨酸 3134··

蛋白酪氨酸磷酸酶

蛋白酪氨酸磷酸酶 本文从网络收集而来,上传到平台为了帮到更多的人,如果您需要使用本文档,请点击下载按钮下载本文档(有偿下载),另外祝您生活愉快,工作顺利,万事如意! 1988年Tonks等首次在人的胎盘细胞中分离和纯化了第一个37kDa的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(ProteinTyrosinePhosphatase-1B,PTP-1B)。 PTP1B是一种胞内PTP,位于内质网,在人体的各种组织中都有表达;其与蛋白酪氨酸激酶(ProteinTyrosineKinases,PTK)共同维持着酪氨酸蛋白磷酸化的平衡,参与细胞的信号转导,调节细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等。 PTP1B属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族,专一水解芳香族磷酸,如磷酸化酪氨酸(phosphotyrosyl,pTyr)残基上磷酸根的酶,通过对胰岛素受体或其底物上的酪氨酸残基去磷酸化作用,对胰岛素信号转导进行负调节,组织细胞中PTP-1B过表达都会降低PTK的活性,使胰岛素受体无法与胰岛素结合,进而引起胰岛素抵抗,最终导致2型糖尿病。 PTP-1BDNA的启动子上有一个转录因子Y盒结合蛋白-1的结合位点,它的过度表达可使PTP-1B的表达水平增加。使用反义寡核苷酸技术减少其表达后,

PTP-1B的表达随之降低,呈正相关趋势。 PTP-1B在体内没有自身的特异性受体,而是在细胞信号传导过程中,与PTP家族中的其他成员以及蛋白酪氨酸激酶协同作用,调控蛋白底物中酪氨酸的磷酸化水平,进而对细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等功能进行调节。 1PTP-1B的生理功能 目前研究发现PTP-1B主要表现出以下几个方面的生理功能: (1)与胰岛素受体(insulinreceptor,IR)、胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate,IRS)等信号蛋白作用,使这些蛋白调节区的酪氨酸残基去磷酸化,进而阻断胰岛素信号级联反应的下传,在胰岛素信号中起着负调控作用。与II型糖尿病的发生具有密切的联系。 (2)在瘦素信号传导过程中,通过降低转录激活子-3(STAT-3)和Janus激酶-2(JAK-2)的磷酸化水平,在瘦素信号中起负调控作用。与肥胖的发生具有密切的联系。 (3)PTP-1B通过与生长因子等底物相互作用,参与细胞生长周期的调节,与肿瘤的发生具有一定的联系。 除此之外,研究还发现PTP-1B在催乳素信号传

酪氨酸酶活性抑制实验方案报告

酪氨酸酶活性抑制实验方案报告 1.1 材料: 酪氨酸酶(或用马铃薯制备)、L-酪氨酸、熊果苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 恒温仪、紫外分光光度计、离心机。 1.2 试剂配制 1)磷酸钠缓冲液(1/15 mol/L,pH=6.8) 精确称取1.000 g磷酸二氢钠,1.186 g磷酸氢二钠,加入少量去离子水溶解后,定容至500 mL,4℃冰箱保存备用。 2)L-酪氨酸溶液(7.5 mmol/L) 精确称取L_酪氨酸0.272 g,先加入数滴浓盐酸,加去离子水约50 mL,微热完全溶解后,用氢氧化钠溶液调pH至7左右,加去离子水定容至200mL。 3)受试液 精确称取受试样品0.1g,分别溶于20 mL去离子水,得到5 mg/mL的待测液,再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。 4)阳性对照(+CK) 精确称取0.1 g熊果苷粉末,溶于20mL的去离子水中,得到5 mg/mL的阳性对照母液,再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。

5) 酪氨酸酶液的制备 以新鲜完好的马铃薯制取酪氨酸酶液。具体操作为:将马铃薯洗净,于4℃预冷4h左右。去皮,切成约1.0 cm3丁状,于-20℃冷冻过夜。称重,按1: 1( W:V )的比例加入4℃ 预冷的磷酸钠缓冲液,用组织捣碎机制成匀浆,3层纱布过滤,滤液于4000 r/min离心10 min,上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液,4℃保存,2 h内用完。 1.3 检测方法 总反应体系为5mL。具体设计见表l。 在此体系中,受试液,包括阳性对照熊果苷的终浓度(mg/mL)梯度为 0.03l25、0.062 5、0.125,0.25、0.5。 实验时,向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性对照)、酶液,于30℃水浴10 min。然后加入底物L-酪氨酸,立即开始计时。测定反应20 min时475 nm波长下的吸光值。测定时,以相应的阴性对照为参比,用下列公式计算受试液(包括阳性对照)对酪氨酸酶的抑制率,并依据浓度一酶抑制率曲线估计半数抑制浓度(IC50)的近似值。 抑制率=[(A-B)/A]×l00% 其中,“A”为标准对照的吸光值,“B”为受试液(或阳性对照)的吸光值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。 表1 5mL试验体系设计

蛋白酪氨酸激酶简介

蛋白酪氨酸激酶简介 癌症极大威胁人类健康,抗肿瘤研究是当今生命科学中极富挑战性且意义重大的领域。目前,临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物,这类抗癌药具有难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药等缺点。近年来,随着生命科学研究的飞速进展,恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶作为药物筛选靶点,发现选择性作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。 蛋白酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质,可分为受体型和非受体型两种,它们能催化ATP上的磷酸基转移到许多重要蛋白质的酪氨酸残基上,使其发生磷酸化。蛋白酪氨酸激酶在细胞内的信号转导通路中占据了十分重要的地位,调节着细胞体内生长、分化、死亡等一系列生理化过程。 蛋白酪氨酸激酶功能的失调则会引发生物体内的一系列疾病。已有的资料表明,超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性,它们的异常表达将导致细胞增殖调节发生紊乱,进而导致肿瘤发生。此外,酪氨酸基酶的异常表达还与肿瘤的侵袭和转移,肿瘤新生血管的生成,肿瘤的化疗抗性密切相关。因此,以酪氨酸激酶为靶点进行药物研发成为国际上抗肿瘤药物研究的热点,为此投入的研究经费也是其它任何一个非传统的肿瘤靶点所无法匹敌的。 目前为止,已有十多种蛋白酪氨酸激酶抑制剂和抗体进入I-Ⅱ期临床试验阶段,个别的已经上市,并取得了令人鼓舞的治疗结果。基中,Genentech公司和罗氏药厂联合研究和生产的HerceptinTM(Trastuzumab)是一种抗酪氨酸激酶受体HER2/neu的人源化的单克隆抗体。1998年,美国食品的药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)正式批准Herceptin用于治疗某些HER2阳性的转移性乳腺癌。2001年5月,N ovartis公司研发的针对酪氨酸激酶Bcr-Abl的抑制剂GleevecTM (imatinib mesylate)由于对治疗慢性髓样白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)具有非常好的疗效,尚未完成Ⅲ期临床就被FDA批准提前上市,用于治疗费城染色体呈阳性(Philadelphia chromosome – positive, Ph+)的慢性髓样白血病患者,引起了巨大的轰动。GleevecTM是第一个在了解癌症的病因后鸽是设计开发,并取得了显著成效和的肿瘤治疗药物,它的研发成功可以说是癌症治疗的一个里程碑。这一重大成就被美国《科学》杂志列入2001年度十大科技新闻。纽约《时代》杂志将其作为杂志的封面,称GleevecTM 开创了药物研发的新时代。2002年2月,美国FDA又批准GleevecTM 用于胃肠基质瘤(gastrointestinal stromal tumors, GLST)的治疗。2002年7月,AstraZeneca公司研发的IressaTM (ZD1839又被美国FDA批准用于治疗经过标准含铂类方案和紫杉萜化疗后仍然继续恶化的终未期非小细胞肺癌患者,这也是第一种用于实体瘤治疗的针对特定靶点挑战分子酪氨酸激酶抑制剂。Herceptin,Gleevec以及Iressa的上市进一步证明了以特定靶点尤其是以酪氨酸激酶为靶点进行抗肿瘤药物的研发是21世纪最有可能获得突破性进展的抗肿瘤药物领域,具有十分广阔的前景。

酪氨酸硝基化导致细胞功能损伤的病理生理机制及防治措施

酪氨酸硝基化导致细胞功能损伤的病理生理机制及防治措施东南大学附属中大医院麻醉科吴琼景亮南京 210009 在全身炎症反应和感染性休克等病理条件下,炎性介质在激活NOS产生过量NO的同时还通过其他细胞途径增加O2-的产生。由于NO 与O2-反应的速度是正常状态下超氧化物歧化酶与O2-反应速度的3倍,使得NO首先捕捉O2-以极快的反应速度生成多种活性氧(O2-、HO-、H2O2、 ONOO-等)和活性氮(NO-、NO2-、N2O3等),这些产物除了造成氧化损伤外,还可与蛋白质酪氨酸残基或游离酪氨酸发生硝化反应,生成稳定的代谢产物3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)。由于正常人体血浆酪氨酸浓度大约为100 mol/L,这就为体内酪氨酸的硝基化提供了可能性。酪氨酸硝基化后使体内多种有重要功能的酶/蛋白功能受损或活性下降,损伤线粒体、DNA,抑制酪氨酸磷酸化,诱导细胞的凋亡和死亡。本文就酪氨酸硝基化的产生原因、对组织细胞功能的损伤及防治措施作一简略介绍。 一、酪氨酸硝基化的产生来源 正常生理条件下,组织细胞中活性氧(ROS)/活性氮(RNS)的生成与清除的平衡取决各种抗氧化物质和酶的浓度。但多种病理状态下这种生物平衡被打破,体内RNS/ROS生成增加,抗氧化物质活性下降。RNS/ROS的大量产生可以直接损伤蛋白质、核酸和脂质等生物大分子,而ROS与RNS相互反应可以产生更强的毒性效应,即酪氨酸的硝基化。一般认为导致酪氨酸硝基化有如下几个来源: 1、过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-) 依赖的途径:O2-与NO在体内迅速反应形成ONOO-,ONOO-及其质子化形成的共轭酸ONOOH具有很强的氧化和硝基化作用,可以通过金属离子或金属蛋白(如Cu/Zn-SOD)的催化作用下与Fe3+活性中心反应形成中间产物(oxo-Fe4+)和NO2,NO2与酪氨酸的芳香环结合生成3-NT或者与酪氨酸直接反应,第一步生成酪氨酰自由基(TYR.)和NO2,NO2与TYR.基团结合形成终产物——3-NT。体外实验也证实,ONOO-确实可以使组织蛋白质发生硝基化反应,经ONOO-处理的细胞中,硝基化蛋白质的含量明显增高。 2、非ONOO-依赖的途径,其中包括:①过氧化物酶(Heme Peroxidase)依赖途径:在体内,过氧化物酶(包括髓过氧化物酶,辣根过氧化物酶,嗜酸粒细胞过氧化物酶等)能催化H2O2 和Cl-反应生成HOCl, NO2-可被HOCl氧化生成NO2Cl和NO2使酪氨酸发生硝基化反应;还能使亚硝酸盐和酪氨酸同时被氧化,分别生成NO2-和酪氨酰自由基(Tyr。),后两者继续反应生成3-NT[1]。②铜/锌-过氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)催化途径:尽管不同的SOD有明显

酪氨酸酶抑制剂的研究进展

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/939883153.html, 酪氨酸酶抑制剂的研究进展 作者:张启勤 来源:《科技资讯》2015年第18期 摘要:酪氨酸酶在黑色素的生物合成过程中起着关键性的作用,是黑色素合成的限速 酶,该酶决定了哺乳动物皮肤、头发的颜色。部分色素沉着性疾病,如皮肤病,如黄褐斑、雀斑等,是由于过量水平的黑色素在表皮沉积而形成。因此,可以选择应用酪氨酸酶抑制剂,通过抑制酪氨酸酶的活性,阻断黑色素的合成反应链,减少其在皮肤内的生成,从而达到祛斑增白的效果。近年来,由于其在化妆品领域的广泛应用,使得不断有更新更有效的酪氨酸酶抑制剂得到研究并开发。 关键词:酪氨酸酶抑制剂植物来源人工合成 中图分类号:Q356.1 文献标识码:A 文章编号:1672-3791(2015)06(c)-0200-02 酪氨酸酶(Tyrosinase),又称多酚氧化酶,是一种含铜金属酶,广泛存在于细菌、真菌、裸子植物、被子植物、哺乳动物等生物中,并存在于生物界系统发育阶段的各个水平。一般认为,羽毛,毛发,眼睛,昆虫表皮,种子等呈现出黑色、褐色、浅黄色等色素,都是酪氨酸酶作用的结果。酪氨酸酶在不同的生物中具有各异但却都很重要的功能。酪氨酸酶兼有单加氧酶和氧化酶双重功能,是生物体内参与黑色素(melanin)合成的关键酶。酪氨酸酶催化L-酪氨酸最终形成黑色素是一个非常复杂的过程。黑色素的合成途径一般被分为两个阶段:远端步骤和近端步骤。近端步骤包括单酚和/或邻-二酚的酶氧化,由含铜酪氨酸酶催化形成邻醌;远端步骤包括化学反应和酶反应,最终合成黑色素。 酪氨酸酶抑制剂作为黑色素祛除剂可以在皮肤美白化妆品具有重要作用,因此,可以通过酪氨酸酶的活性抑制实验来确定这些美白剂。 酪氨酸酶抑制剂的来源非常广泛,不仅有天然产物,而且有很多是人工合成化合物。如表1和表2所列,这些化合物在抑制酪氨酸酶单酚酶酶活的同时也抑制了二酚酶的酶活。 1 植物来源的酪氨酸酶抑制剂 众多的具有生物活性、副作用小的化合物来源于植物。如表1所示,很多植物源的天然产物对酪氨酸酶活性具有抑制作用,并且这些化合物的抑制能力及其抑制类型不尽相同。 1.1 高等植物来源的酪氨酸酶抑制剂 多酚类化合物,如单宁酸,广泛的存在于自然界中,与花的颜色有关。一些存在于植物中的树皮、根和叶子的多酚类化合物结构复杂,另一些存在于新鲜水果、蔬菜和茶叶中多酚类化合物结构却相对简单。酪氨酸酶强抑制剂黄酮类化合物,如4’,5,7-三羟基黄酮、槲皮素、

酪氨酸酶抑制率测定方法

1. 4念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制 1. 4. 1念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活力的影响 提取物对酪氨酸酶的抑制参照Masuda和Kubo的方 法[ 6, 7] , 并略作修改。待测样品用DMSO 进行浓度 梯度稀释, 浓度分别为1、05、025、0125 mg / mL; 换算成反应体系中的终浓度分别为333、1665、8325、4 3 g /mL。反应在96孔细胞板上 进行, 每组8孔, 分别是: A. 不含样品, 但含酪氨酸 酶的阴性对照, 3孔重复; B. 不含样品及酪氨酸酶的 空白对照, 1孔; C. 包含样品及酪氨酸酶, 3孔重复, D. 含样品但不含酪氨酸酶的空白对照, 1 孔。A 孔 中加入190 L pH 68、0 1 mo l/L 磷酸缓冲液, 10 L 1380 U /mL酪氨酸酶; B 孔中加入200 L 相 同的磷酸缓冲液; C 孔中加入180 L磷酸缓冲液, 10 L 1380 U /mL酪氨酸酶, 10 L样品; D 孔中加 入190 L磷酸缓冲液, 10 L样品。然后将细胞板 在30条件下放置5 m in, 再在每孔中加入100 L 2 5 mmo l/L L-酪氨酸( 见表1 )。在30反应 10m in后, 立即置于Tecan Sunrise 酶标仪中测量在475 nm下的吸光值。提取物对酪氨酸酶活性的抑 制按公式计算: 抑制率=( A - B ) - ( C- D)*100% A – B

参照文献方法〔3〕在数支干燥的试管中 各加入1.oml0.03%左旋多巴溶液,再加上维 生素E一日环糊精溶液,(加入量按表所列体积) 最后的磷酸钠缓冲液加至5.Oml,25℃恒温10 min后,加入0.4ml酶提取液,立即计时并迅速置于恒温槽内,待反应1min,用BaCRman DV一70型分光原度计在475nm处测定吸收度,以缓冲液为参比,然后根据多巴色素的消光系数“=3700求出Vi,把无维生素E一日环糊精溶液存在时速度定为100%,求出不同浓度维生 素E一日环糊精存在时酶的相对活性以及对酶的抑制率 抑制率二V。空白一V抑制V。空白x100%

新型酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂的合成、生物活性及分子动态模拟研究

新型酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂的合成、生物活性及分子动态模 拟研究 目的:蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2是新的抗肿瘤药物研究靶点。为寻找新的具有较强抗肿瘤活性的SHP2抑制剂,本课题以文献报道的SHP2抑制剂GS493,SHP836等为先导化合物,设计、合成了苯磺酸和吡嗪胺两类新的衍生物;测试了苯磺酸类衍生物对SHP2蛋白活性中 心的抑制作用;在细胞水平测试了所有化合物对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231和非小细胞肺癌NCI-H1975的增殖抑制活性;选择活性较好的化合物If、IIe进行计算机辅助的分子动力学研究,以探讨它们与SHP2作用的具体模式及对SHP2的选择性。方法:1.目标化合物的设计与合成:(1)保留GS493的苯基腙吡唑啉酮以及磺酸基团,用内脂环或酰胺代替1位苯环的硝基,3位苯环的硝基替换为氟、甲氧基等基团,设计了12个目标化合物 Ia-Il。其合成方法为:对硝基苯甲酸经酰氯化,再与胺反应形成酰胺,然后再将其硝基还原,重氮化,还原,得到N-取代-4-肼基苯甲酰胺中间体;对氨基苯磺酸经过重氮化,与取代苯甲酰乙酸乙酯耦合得到4-{2-[1-乙氧基-3-(4-取代)-1,3-二氧代丙-2-基]肼基}苯磺酸中间体,其再与N-取代-4-肼基苯甲酰胺中间体反应得到目标产物Ia-Il。(2)保留 SHP836,SHP099的吡嗪胺结构,3位引入新的芳环或芳杂环替代二氯 苯环,6位引入大位阻的取代哌嗪基团,设计了12个目标化合物 IIa-IIl。其合成方法为:以2-氨基-3-溴-6-

酪氨酸酶活性抑制实验方法

酪氨酸酶活性抑制实验方法 一、试剂:酪氨酸酶、酪氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、阳性对照(熊果苷粉末)、样品、去离子水 二、试剂配制: 1、磷酸盐缓冲溶液(PH=6.8):先分别配制0.2M的磷酸二氢钠和0.2M的磷酸氢二钠。 0.2M磷酸二氢钠:称取 71.6g Na2HPO4-12H2O,溶于 1000ml 去离子水; 0.2M磷酸氢二钠:称取 31.2g NaH2PO4-2H2O,溶于1000ml 去离子水; 取51ML磷酸二氢钠+49ML磷酸氢二钠即得0.2M、PH=6.8的磷酸缓冲液。 2、L-酪氨酸溶液:称取L-酪氨酸25.6 g,用磷酸缓冲液定容于50mL容量瓶 中,即得L-酪氨酸溶液。 3、酪氨酸酶溶液:将马铃薯洗净,于4℃预冷4h左右。去皮,切成约1.0 cm3丁状,于-20℃冷冻过夜。称重,按1:1(W:V )的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液,用组织捣碎机制成匀浆,3层纱布过滤,滤液于4000 r/min离心10min,上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液,4℃保存,2h内用完。 4、受试液的配制:将原先所配5mg/ml的溶液用甲醇稀释到1mg/ml.。 5、阳性对照:取熊果苷粉末0.01g,溶于10ml的甲醇溶液,即得1mg/ml的 对照品溶液。 三、实验方法: 依下表所示向试管中依次加入磷酸盐缓冲溶液、样品溶液、酪氨酸溶液,于35℃水浴10分钟。然后加入酪氨酸酶液,混匀,再在35 ℃下孵育30min,迅速转移至比色皿中,在475nm处测定吸光值。

受试组用空白对照组1调零,阴性对照组用空白对照组2调零,阳性对照组用空白对照组3调零。 受试组吸光值为A1,阴性对照组吸光值为A2,阳性对照组吸光值为A3。 抑制率=1-[(A1-A2)/(A3-A2)]×100%=(A3-A1)/(A3-A2)×100% 注:受试液组共四种样品

蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP_1的中药抑制剂筛选

第46卷 第6期吉林大学学报(理学版) Vol .46 No .6 2008年11月JOURNAL OF J I L I N UN I V ERSI TY (SC I E NCE E D I TI O N ) Nov 2008 蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP 21的中药抑制剂筛选 李婉南1 ,李 莹1 ,庄 妍1 ,李 贺1 ,陈颖丽2 ,赵志壮 1,3 ,付学奇 1 (1.吉林大学生命科学学院,长春130012;2.吉林省中医药科学院,长春130021; 3.美国俄克拉荷马大学健康科学中心,俄克拉荷马城73104,美国) 摘要:用含有蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP 21催化结构域(ΔSHP 21)的质粒转化大肠杆菌,得到 ΔSHP 21的高效表达,经分离纯化后,以ΔSHP 21为靶标,通过体外酶反应动力学实验,对157种中药水提液的抑制效果进行研究,筛选出两种对ΔSHP 21具有显著抑制作用的中药:山茱萸和蒲公英,并对其I C 50及抑制类型做了进一步研究.为建立蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂的筛选方法和中药在治疗免疫疾病和糖尿病上的开发和应用提供了理论依据.关键词:包含SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶1(SHP 21);中药;抑制剂;筛选中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:167125489(2008)0621211206 Screen i n g Traditi onal Chi n ese M edi ci n es for I nhi bitors of Prote i n Tyrosi n e Phosphat ase SHP 21 L IW an 2nan 1 ,L I Ying 1 ,ZHUANG Yan 1 ,L I He 1 ,CHEN Ying 2li 2 ,ZHAO Zhi 2zhuang 1,3 ,F U Xue 2qi 1 (1.College of L ife Sciences,J ilin U niversity,Changchun 130012,China; 2.A cade m y of Traditional Chinese M edicine and Herbs of J ilin P rovince,Changchun 130021,China; 3.Health Sciences Center ,O klaho m a U niversity,O klaho m a C ity 73104,USA ) Ab s trac t:W ith pT7as a vect or,ΔSHP 21,a recombinant p r otein containing the catalytic domain of p r otein tyr osine phos phatase SHP 21,was highly exp ressed in E .coli cells .The enzy me was further purified t o near homogeneity .W ith the purified recombinant enzy me as a target,aqueous extracts of 157traditi onal Chinese herb medicines were analyzed f or their abilities t o inhibit SHP 21.T wo most potent inhibit ors,na mely,cornel and dandeli on,were identified,and their I C 50values and inhibit ory types were further analyzed .This study thus established a good syste m t o screen inhibit ors of SHP 21and de monstrated the potential of traditi onal Chinese medicines in treat m ent of i m munol ogical diseases and diabetes . Key wo rd s:SH22containing tyr osine phos phatase 1(SHP 21);traditi onal Chinese herb;inhibit or;screening 收稿日期:2008201215. 作者简介:李婉南(1975~),女,汉族,博士,讲师,从事蛋白质酪氨酸结构与功能的研究,E 2mail:wyshshk@https://www.wendangku.net/doc/939883153.html,.联系人:付学奇(1960~),男,汉族,博士,教授,博士生导师,从事细胞信号传导与药物筛选的研究,E 2mail:fxq@jlu .edu .cn . 基金项目:吉林省科技发展计划项目基金(批准号:20060563;200705394;20080434). 蛋白质酪氨酸磷酸酶(Pr otein Tyr osine Phos phatase,PTPs )与蛋白质酪氨酸激酶(Pr otein Tyr osine Kinases,PTKs )协同作用,控制着蛋白质酪氨酸的磷酸化过程,调节细胞生长发育,并在细胞信号传导过程中发挥重要作用 [1] ,许多生理和病理现象都与此相关 [2] .研究表明,一些疾病如某些癌症、糖尿 病、白血病、免疫缺陷病、努南氏综合症等正是由于PTPs 的基因突变或异常表达导致的[3,4] ,因此 PTPs 已经成为继PTKs 之后又一个热门的研究领域.SHP 21(SH22Containing Tyr osine Phos phatase 1),又称为HCP,SHPTP1或PTP1C,是含有SH2结构域的具有高度保守序列的蛋白质酪氨酸磷酸酶的亚家

蛋白酪氨酸激酶

蛋白酪氨酸激酶(PTK)是多种肿瘤最常见的生长因子受体,抑制其活性可破坏肿瘤细胞的信号传导,抑制肿瘤细胞增殖和新生血管形成,而对正常细胞影响较小。常见的受体型包括表皮生长因子受体(EGFR)家族、胰岛素受体(IGFR)家族、血小板衍化生长因子受体(PDGFR)家族、VEGFR家族、纤维细胞生长因子受体(。FGFR)家族等。非受体型包括SRC、ABL、JAK、ACK、CSK、FAK、FES、FRK、TEC、SYK家族等。以PTK为靶点的单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是近年抗肿瘤药研究的热点。2005年之前,美国FDA批准以PTK为靶点的单克隆抗体曲妥珠单抗(1998年)、贝伐单抗(2004年)和西妥昔珠单抗(2004年)和小分子酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(2001年)、吉非替尼(2003年)、埃罗替尼(2004年)等靶向药物应用于临床。2005年后TKI制剂不断上市,且多靶点药已成为新的研究方向。 Neratinib 伯舒替尼(Bosutinib,惠氏公司)是强效Src和Abl激酶双重抑制剂,既能抑制多种人肿瘤细胞中Src蛋白的自主磷酸化,也能抑制Src和Ab底物的磷酸化过程,具有高效的抗增殖活性,可抑制CMI。细胞的增殖和存活,对伊马替尼、达沙替尼和尼罗替尼等已产生耐药的CML,或ALL患者也取得了较好的疗效。目前,正在进行CML的Ⅲ期临床研究。 Motesanib(安进公司)能选择性地作用于VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR和c-kit受体,可致内皮细胞程序性死亡增加和血管面积减少,抑制肿瘤血管生成并诱导肿瘤消退。目前,本品NSCLC的Ⅲ期临床研究正在进行中;其GIST、甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌等适应证的研究也处于Ⅱ期临床研究阶段。 凡德他尼(Vandetanib,阿斯利康公司)是口服小分子EGFR、VEGFR、RET多靶点酪氨酸激酶抑制剂。Ⅱ期临床显示,单用或与多西他赛联合用药,其在NSCLC患者的二线/三线治疗中均有效。 Vatalanib(拜耳/诺华)是经高通量筛选出的VEGF、PDGF、c-kit多靶点小分子TKl,对VEGFR-2作用最强。与FOLFOX方案联合治疗转移性结直肠癌的2个Ⅲ期研究正在进行中。目前,发现体内乳酸脱氢酶水平较高的患者疾病PFS显著提高。 BIBtr 1120(勃林格殷格翰公司)是一种新的口服抗血管生成药,抑制VEGF、PDGF、FGF等的作用,目前分别开展了治疗晚期卵巢癌和NSCLC的Ⅲ期临床研究。

酪氨酸酶的提取及其催化活性研究

酪氨酸特性及其影响因素 摘要:酶是由生物细胞合成的、对特定底物起高效催化作用的蛋白质,是生物催化剂。生 物体内所有的化学反应几乎都是在酶的催化作用下进行的。只要有生命活动的地方就有酶的作用,生命不能离开酶的存在。在酶的催化下,机体内物质的新陈代谢有条不紊地进行着;同时又在许多因素的影响下,酶对代谢发挥着巧妙的调节作用。生物体的许多疾病与酶的异常密切相关;许多药物也可通过对酶的作用来达到治疗的目的。随着酶学研究的深入,必将对人类社会产生深远影响和做出巨大贡献。 Summary: The enzyme is high efficiency catalyst on a specific substrate protein synthesis by biological cells is the biological catalyst. Chemical reactions in all organisms is almost in the under the catalysis of enzyme. As long as there is life there is the function of enzyme the enzyme in the presence of life can not leave. In the enzyme catalytic machine body material the new supersedes the old. With everything in good order and well arranged; and at the same time, the influence of many factors under the regulation of enzyme plays cleverly on metabolism. Many diseases and enzyme of organisms are closely related; many drugs can also be based on the role of the enzyme to achieve the purpose of treatment. With the in-depth study of bound enzyme have a far-reaching impact on human society and make great contributions to. 关键词:酶催化活性影响因素 正文 引言:酶是具有催化作用的蛋白质。其活性仅决定于它的蛋白质结构。酶与一般非生物催化剂相比,具有以下几个特点: 1、酶的主要成分是蛋白质。它具有表现活性和专一性所必需的空间结构,以提供反应中心。由于蛋白质遇高温、强酸、强碱、重金属盐或紫外线等容易变性而失活,所以酶促反应都是在比较温和的条件下进行的。 2、酶促反应所需的活化能较低。如使1mol 蔗糖水解所需活化能高达1.34MJ,用H+离子作催化剂时活化能降至87.9 KJ,若用蔗糖酶催化时只需39.4 KJ。 3、酶的催化效率非常高。酶的催化效率通常比非催化反应高108 ~1020倍,比一般非生物催化剂高107~1013倍。 4、酶具有高度的专一性。酶对所作用的底物有严格的选择性,每一种酶只能对某一类物质甚至只对某一种物质起催化作用,这是一般非生物陈化剂所无法比拟的。 影响酶作用的因素有酶的浓度、底物浓度、pH值、温度和抑制剂等。在酶浓度恒定的情况下,增加底物的浓度,可以提高酶促反应的初速度。当底物浓度增至某一限度后,反应初速度就不再随底物的浓度而变化,而是逐渐趋近某一极限值,这个极限值称为最大速度(V max)。 酪氨酸的提取及其催化活性研究

蛋白磷酸酶抑制剂复合物I (100×)使用说明书

使 用 说 明 书 ◆蛋白磷酸酶抑制剂复合物I (100×) ◆目录号1913 ◆使用手册 ◆实验室使用,仅用于体外

蛋白磷酸酶抑制剂复合物I (100×) 目录号:1913 目录编号包装单位 191301 1 ml 191302 1 ml× 5 适用范围: 抑制蛋白丝/苏氨酸磷酸酶、蛋白酪氨酸磷酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶 产品储存: -20℃保存,一年有效。

产品介绍: 组织/细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶,以各种方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化,导致不同于正常生理状态的差异。因此,裂解后的Western blotting,免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质、和蛋白激酶活性测定等实验常规要加入外源性蛋白磷酸酶抑制剂,抑制磷酸化蛋白的去磷酸化,维持蛋白质的磷酸化状态。 本公司研制的蛋白磷酸酶抑制剂复合物以国际上主流配方改进而成,主要成份为5种独立的蛋白磷酸酶抑制剂(钒酸钠、氟化钠、钼酸钠、酒石酸钠、咪唑),每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白磷酸酶活性。该复合物优化的组成使其可以强烈抑制几乎所有重要的蛋白磷酸酶活性,包括蛋白丝/苏氨酸磷酸酶、蛋白酪氨酸磷酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶以及ATP酶等。该复合物为100倍浓缩溶液,可直接加入任何组织类型和细胞的裂解产物中,均能有效抑制磷酸化蛋白质的去磷酸化,从而维护蛋白质的磷酸化状态。适用于Western blot和免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质、蛋白激酶活性测定等。 操作步骤: 临用前室温溶解磷酸酶抑制剂复合物I (100×),混匀,按照1:100比例加入到组织细胞裂解物中。 提示: ?避免反复冻融,第一次使用后,可按照每次使用量分装冻存。 临用前加入,终浓度为1×,蛋白磷酸酶含量特别丰富的组织,可以用2-3×。 完

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