动物细胞融合技术

动物细胞融合技术

一、实验目的：1. 通过PEG介导的鸡血细胞融合实验, 对体细胞融合有一个清

楚的概念

2. 并初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术

二、实验原理：利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起, 使两细胞的胞质沟通, 从而造成相互接触的细胞之间发生融合。

利用PEG介导细胞融合, 其融合效果受以下几种因素的影响：

1. PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG 的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。

2. PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。

3. PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。

4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细胞, 一般采用的温度为38~40℃。

经PEG处理后，在显微镜下，可观察到未融合的单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细胞。细胞的融合率指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞的核的总数与此视野内所有细胞的细胞核总数之比。可用如下公式表示：

在实验中统计融合率时, 要进行多个视野计数，然后再加以平均，以使计算更为准确。

三、实验材料：

**材料： 鸡血

***试剂：

1. Alsever液制备

葡萄糖(Glucose) 2.05g

枸椽酸钠 0.8g

氯化钠(NaCl) 0.42g

重蒸水至 100ml

2. 0.85%生理盐水液

3. GKN液

氯化钠 8g

氯化钾(KCl) 0.4g

Na

2HPO

4

?2H

2

O 1.77g

NaH

2PO

4

?H

2

O 0.69g

葡萄糖 2g

酚红(phenolred) 0.01g

溶于1000ml重蒸水中。

4. 50% PEG液 (现用现配)

根据实验需要，称取适量PEG(Mr.4000)放入刻度离心管内，在酒精灯上将其加热熔化，待冷却至50℃，加入等体积的已预热至50℃的GKN液并充分混匀。***仪器：普通离心机、普通光学显微镜、量筒, 滴管, 刻度离心管, 载、盖片

四、实验方法和步骤

1、将Alsever液与活鸡翼下鸡血混成4:1悬液 （抗凝效果最佳），4度冰箱保存。

2、取上述悬液加入生理盐水混匀，1200r/min离心5分钟，弃上清，上述离心速率重复离心两次(5min, 10min) ，以达到去除细胞表面粘附物质的目的。

3、加入适量GKN液，配成细胞悬液，取悬液以血球计数法计数，再用GKN液将

红细胞的浓度稀释，达到107/ml.留取一部分作对照组实验观察。

4、实验组逐滴加入 约2-3倍的37度温热的50%的PEG液混匀，37度条件下温热处理1分钟、5分钟、10分钟三个时间段。

5、制片：将融合后的细胞悬液分别涂片，对照组和实验组每组涂2张，1张加盖玻片后，在相关显微镜下直接进行观察；1张迅速干燥，甲醇固定5分钟，Giemsa 染液进行染色10分钟、水洗、干燥。镜检，观察融合细胞。

6、计算出融合率

五、实验报告

绘图表示血融合细胞的形态，并计算出细胞融合率。

六、思考题

1. 细胞融合方法主要有哪几类？各有何优缺点？

2. 本实验中所用的PEG融合方法能否用于植物细胞？为什么？