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单抗下游生产工艺手册

单抗下游生产工艺手册
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单克隆抗体制备的基本原理

单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体(antibody)是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体,仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而,常规血清抗体又称多克隆抗体(polyclonal antibody),简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质,加之不同批次的抗体制剂质量差异很大,使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此,制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生,这一目标得以实现。 1975年,Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术,他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合,形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死,又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系,即杂交瘤细胞系,它所产生的抗体是针

对同一抗原决定簇的高度同质的抗体,即所谓单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),简称单抗。 与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次**,而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用,促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒(Georges Ko1er)和英国科学家米尔斯坦(Cesar Milstein)两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 (一)杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,为杂交瘤技术提供了必要理论基础,同时,骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日,Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of

单克隆抗体药物

浅谈单克隆抗体药物 摘要:单克隆抗体药物是生物医药领域中最耀眼的明珠。该类药物具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点,代表了药品治疗领域的最新发展方向,在肿瘤、自身免疫性疾病的治疗手段不断升级过程中,单抗药物扮演着不可替代的角色,已经成为全球靶向治疗药物的主流。在刚刚兴起的细胞免疫治疗中,单抗药物同样是位列第一的品类,单抗产业是目前乃至未来医药行业中极具投资价值的细分行业。本文从单克隆抗体简介,常见的单克隆抗体药物、国内外单克隆抗体药物的研发现状,及对单抗药物的展望几个方面做一简介。 关键词:单克隆抗体单抗药物研发现状 1单克隆抗体 抗体是由B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的,每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体,简称单抗。这些抗体具有相同的结构和特性。抗体与特异性表达的肿瘤细胞表面蛋白质结合,从而阻碍蛋白质的表达,起到抗肿瘤作用。抗体还可使B淋巴细胞产生免疫反应,诱导癌细胞凋亡。早期单抗为鼠源性单抗,易被人体免疫系统识别,应用受到限制。后来采用基因工程的方法生产人源或人鼠嵌合型单抗,广泛应用于临床。 2常见的单克隆抗体药物 2.1利妥昔单抗(Rituximab)-美罗华-CD20单抗 第一个被美国食品药物管理局(FDA)批准用于临床治疗的单抗,是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体,能特异性地与CD20结合,导致B淋巴细胞溶解的免疫反应,抑制其增殖,诱导成熟B淋巴细胞凋亡和提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。90%以上的B淋巴细胞淋巴瘤细胞均有CD20表达,不表达于非定向干细胞或浆细胞。本药可使耐药淋巴瘤细胞对VP-16、顺铂重新敏感,用于CD20表达的复发或化疗耐药的惰性B淋巴细胞淋巴瘤,有效率46%。利妥昔单抗+CHOP 方案为治疗弥漫大B淋巴细胞淋巴瘤标准方案,可使全完缓冲(CR)率、生存时间明显延长[2-3]。 2.2曲妥珠单抗-赫赛汀-HER-2单抗 为重组DNA人源化的抗p185蛋白(癌基因)单克隆抗体-IgG抗体。进入人体后能选择性地与由细胞核内表皮生长因子2基因调控的p185糖蛋白结合。本

单克隆抗体制备方法(全)

单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交瘤细胞既可产生抗体,又可无性繁殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备: 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱(-70℃)、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机(水平转子,4000r/min)、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括:100ml、50ml、25ml细胞培养瓶,10ml、1ml刻度吸管,试管,滴管(弯头、直头),平皿,烧杯,500ml、250ml、100ml盐水瓶,青霉素小瓶,10ml、5ml、1ml注射器等,96孔、24孔细胞培养板,融合管(50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管),眼科剪刀,眼科镊,血细胞计数板,可调微量加样器(~50ul,~200ul,~1000ul),弯头针头,200目筛网,小鼠固定装置等。此外,一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠,较温顺,离窝的活动范围小,体弱,食量及排污较小,一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 (1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原,再加佐剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8~1ml,0.2ml/点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射)(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同一,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价) ↓2~3周 加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv(静脉内注射) ↓3天后取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。

单克隆抗体的制备

单克隆抗体的制备 摘要:单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。下面主要讲述制备单抗的实验过程。 关键词:抗体,单克隆,肿瘤,细胞融合,淋巴细胞 现代生物技术制药工业始于1971年,现已创造出35个重要治疗药物,全球大约有2500多家公司,主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。 1.国外现代生物技术产业发展的现状 自1971年Cetus公司成立至今,现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程,创造出35个重要的治疗药物,目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良,糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中,传统生物技术(包括近代生物技术)已为人类提供了许多重要药品,在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用;现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现,使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时,应用现代生物技术DNA重组,细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平,为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产,构建了高产新菌株,创造新工艺,提高生产能力,降低生产成本,促进生产发展。

单克隆抗体制药

生物制药现状与发展前景 班级:09生科学号:0906080018 姓名:李俊摘要:生物药物原料以天然的生物材料为主,包括微生物、人体、动物、植物、海洋生物等。随着生物技术的发展,有目的人工制得的生物原料成为当前生物制药原料的主要来源。如用免疫法制得的动物原料、改变基因结构制得的微生物或其它细胞原料等。生物药物的特点是药理活性高、毒副作用小,营养价值高。生物药物主要有蛋白质、核酸、糖类、脂类等。这些物质的组成单元为氨基酸、核苷酸、单糖、脂肪酸等,对人体不仅无害而且还是重要的营养物质。 关键字:生物技术制药、发展、蛋白质工程、药物 生物技术制药(biopharming):利用生物活体来生产药物的方法。有时特指利用转基因动植物活体作为生物反应器生产药物。就是利用基因工程技术、细胞工程技术、微生物工程技术、酶工程技术、蛋白质工程技术、分子生物学技术等来研究和开发药物,用来诊断、治疗和预防疾病的发生。 生物药物的阵营很庞大,发展也很快。目前全世界的医药品已有一半是生物合成的,特别是合成分子结构复杂的药物时,它不仅比化学合成法简便,而且有更高的经济效益。半个世纪以来微生物转化在药物研制中一系列突破性的应用给医药工业创造了巨大的医疗价值和经济效益。微生物制药工业生产的特点是利用某种微生物以“纯种状态”,也就是不仅“种子”要优而且只能是一种,如其它菌种进来即为杂菌。对固定产品来说,一定按工艺有它最合适的“饭”—培养基,来供它生长。培养基的成分不能随意更改,一个菌种在同样的发酵培养基中,因为只少了或多了某个成分,发酵的成品就完全不同。如金色链霉菌在含氯的培养基中可形成金霉素,而在没有氯化物或在培养基中加入抑制生成氯化的物质,就产生四环素。药物生产菌投入发酵罐生产,必须经过种子的扩大制备。从保存的菌种斜面移接到摇瓶培养,长好的摇瓶种子接入培养量大的种子罐中,生长好后可接入发酵罐中培养。不同的发酵规模亦有不同的发酵罐,如10吨、30吨、50吨、100吨,甚至更大的罐。这如同我们作饭时用的大小不同的锅。 生物制药发展现状: 现在,世界生物制药技术的产业化已进入投资收获期,生物技术药品已应用和渗透到医药、保健食品和日化产品等各个领域,尤其在新药研究、开发、生产和改造传统制药工业中得到日益广泛的应用,生物制药产业已成为最活跃、进展最快的产业之一。 在中国生物制药技术还比较落后。总的来说研发跟不上,生产上就是做发酵。大学毕业生就业比较难。建议读完本科后出国深造,回国后作为学术带头人,加速国内相关领域的发展。 合成生物学对生物技术制药的发展,2003年美国大学J.Keasling成立了世界上第一家合成生物学系基于系统生物学的基因工程,采用酵母细胞表达天然植物药箐篙素分子,实现工程微生物代谢工程制药。采用计算机辅助设计、人工合成基因、基因网络乃至基因组等技术,将细胞作为细胞工厂来进行重新设计,从而进入了合成生物技术制药时代,并将带来细胞制药厂的产业化,2007年英国皇家工程院士R.I.Kitney称“系统生物学与合成生物学偶合,将产生第3次工业革命”。 生物技术制药分为四大类: (1)应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽,蛋白质类治疗剂。 (2)基因药物,如基因治疗剂,基因疫苗,反义药物和核酶等

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中,总共有两次筛选,第一次筛选出杂交瘤细胞,第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法:细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径:一条途径是生物合成途径(“D途径”),即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物,可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径(“S途径”),它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸,两种酶缺一不可。因此,在HAT培养液中,未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断,虽“S途径”正常,但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型(HGPRT)细胞,因此自身没有“S途径”,且“D途径”又被氨基喋呤阻断,所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的“S途径”,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HA T培养液中选择性存活下来,并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法:在实际免疫过程中,由于采用连续注射抗原的方法,且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞,因此,从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的,经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异,所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔的细胞培养板上,使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞(理论上30%的孔中细胞数为0时,才能保证有些孔中是单个细胞),再由这些单细胞克隆生长,最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此,单克隆抗体制备过程中,两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理: B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,再进一步克隆化,这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力,又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程: 1)免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备,也可采用脾内直接免疫法。 2)骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前,骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选,防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性(恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活)。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养,融合前24h换液一次,使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3)细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术。 4)阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测,过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质,以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便,RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次,均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5)克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的,有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多,而最常用的是有限稀释法。 (1)显微操作法:在显微镜下取单细胞,然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂,效率低,故不常用。 (2)有限稀释法:将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后,按每孔1个细胞接种在培养皿中,细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化,所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2~3次的再克隆才成。应该注意的是,每次克隆化过程中所有有意义的细胞都

fda人用单克隆抗体制品生产及检定考虑要点

人用单克隆抗体制品生产及检定考虑要点 前言 生物制品评价和研究中心(CBER)正在修订1987年的“人用单克隆抗体的生产和检定考虑要点(PTC)”。该最新修订本的目的是向开发单克隆抗体制品的发起人和研究人员提供帮助,包括研究性新药(IND)和产品许可证申请时应提交的资料。 此文件取代了1987年的文件,并反映了在多次国内、国际会议上讨论过的值得重视的经验,这些会议包括: 1.FDA疫苗和相关生物制品咨委会于1990年8月召开的“生物制品潜在逆转录病毒污染”讨论会。 2.由国际生物标准化学会(IABS)发起并于1990年11月在伦敦召开的“生物制品安全性的病毒学方面会议”。 3.由FDA、IABS、NIH、国家疫苗规划办公室、HHS和WHO发起,于1991年3月在Bethesda召开的“传代细胞系当前所面临的问题”的国际性会议。 4.由FDA和NIH联合发起,于1992年1月在Bethesda召开的”单克隆抗体的临床前安全性试验工作会议”。 单克隆抗体和其他生物制品一样都有可供参考的法规(21 CFR部分200~299和600~680)。与CBER制定的其他考虑要点一样,单克隆抗体考虑要点亦不试图包容所有问题。当特殊制品产生特殊的未包括在“考虑要点”中的问题时,则应根据具体情况进行评估。本文及相应的法规本对生产和生产设施进行讨论,发起人应与治疗药物研究和评审办公室及生产企业许可证发放和产品监督办公室磋商。 某些单克隆抗体可由CDER负责主要审查工作,或由CDRH与CBER联合复审,各中心的管辖权依据1991年10月CBER和CDER及CBER和CDRH的内部协议执行。本考虑要点适合于按此协议联合复审的单克隆抗体。 主档案 在研究性新药申请初始阶段不需要全部完成本文中讨论的所有资料,而应在临床开发阶段,由适当的中心以对话方式指导下,使资料不断完善。在某些情况下,在同一设施内以相同的方法制备及检定的单克隆抗体时,资料应归于单一主档案

单克隆抗体制备过程中的两次筛选

单克隆抗体制备过程中的两次筛选 动物细胞工程中动物细胞融合的主要应用是制备单克隆抗体。在单克隆抗体制备过程中,有两次筛选,这地方学生很容易弄混了。第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞,第二次筛选的目的是筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,两次筛选的原理和方法并不相同。 第一次筛选: 细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)。 其依据是细胞中的DNA合成有两条途径:一条途径是生物合成途径(“D途径”),即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物,可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径(“S途径”),它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸,两种酶缺一不可。因此,在HAT培养液中,未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断,虽“S途径”正常,但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型(HGPRT)细胞,因此自身没有“S途径”,且“D途径”又被氨基喋呤阻断,所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的“S途径”,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HAT培养液中选择性存活下来,并不断增殖。 第二次筛选: 在实际免疫过程中,由于采用连续注射抗原的方法,且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞,因此,从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的,经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异,所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔的细胞培养板上,使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞(理论上30%的孔中细胞数为0时,才能保证有些孔中是单个细胞),再由这些单细胞克隆生长,最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。 因此,单克隆抗体制备过程中,两次筛选的原理和方法是不相同的。

单克隆抗体

单克隆抗体技术——伏马菌素B1快速检测试剂盒 每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系,含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时,抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙,即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆,并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养,就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群,即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体,称为单克隆抗体。 用任何抗原、半抗原,包括各种细菌、激素、酶素、病原体、氨基酸序列、核酸,还有其他异体蛋白或糖蛋白等抗原物质,都可以用杂交瘤技术获得相应的单克隆抗体。因而人们可以在体外或动物体内按自己的需要,生产不同类型的单抗。现在,已经可以制出多种病毒、细菌、支原体、霉菌、寄生虫表面抗原,癌胚抗原,血型红细胞抗原,移植抗原,肿瘤相关抗原,多种血清成份,DNA ,RNA ,基因片段等等单克隆抗体。已应用单克隆抗体制成免疫荧光技术,酶免疫吸附实单克隆抗体技术及其在食品卫生检验中的应用。 抗体药物的研发关键步骤主要包括:抗体靶点的确定、抗体库的建立、表达载体的构建、细胞株的筛选,中试工艺、临床前研究及临床研究。 到2016年全球约有250亿美元单抗药物的专利到期,抗体药仿制时代来临。据美国投资公司Collins Stewart估计,开发一种适应症的单克隆抗体生物仿制药将会花费1亿美元,新的治疗性抗体的开发将花10~16年和5亿~10亿美元,而且生物仿制药成稿概率高达90%,明显高于生物新药研发概率。单抗药物价格非常昂贵,在我国接受全自费Avastin和Erbitux等的治疗,每剂5000—6000元,年治疗费用在18万元左右。生物仿制药较原研药安全性相当,但是在价格上有显著竞争优势,安全效益比更高。

单克隆抗体制备实验过程

单克隆抗体制备实验过程 I 细胸培养 选出所需要的细J腕 群,继续培养 免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋巴细胞 的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠,按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器 官,刺激相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖,并分化成为致敏B 淋巴细胞。 杂交瘤细腕 体内培养 体外培养 从培养液中 \ /从腹水中提取 单克隆抗体

说明:FCA弗氏完全佐剂;FIA,弗氏不完全佐剂;Quickantibody ,北京康碧泉公司研制 的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM,存在亲和力弱等缺点,慎用。 PS:1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原,每只小鼠注射6-8个点为宜。 2 、腹腔注射时,如果抗原混有弗氏佐剂,建议注射在左侧腹腔,如果采用右侧腹腔注射,则在免疫过程中,很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况,造成后期取出脾脏麻烦。 3 、冲击免疫完成后,应在96小时内完成细胞融合,否则相应的B 细胞数量会下降到未冲击前的水平。 二、细胞融合(Cell fusion) 【材料和试剂】 (1)骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株,取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞,制备细胞悬液。 (2)免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠,眼眶放血,?分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠,浸泡于75%酒精中3?5min。无菌操作取出脾脏,置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤,剪去周围

的结缔组织,将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上,先用剪刀剪成3?5个小块,然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中,加不完全培养液50ml, 1000r/min 离心5min,弃上清,再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中,计活细胞数,一般一只小鼠可得0.5?2X 108个脾细胞。 (3)饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后,用消毒剪镊 从后腹掀起腹部皮肤,暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔,注意避免穿入肠管。右手固定注射器,使针头留置在腹腔内,左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟, 随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟,弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮,根据细胞计数结果,补加HAT培养基,使细胞浓度为2X 105/ml,备用。 (4)主要试剂的配制 ①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM (Dulberco Modified Eagles Medium )两种基础培养基,配好后过滤除菌 (0.22um),分装,4C保存。 不完全RPMI-1640培养基: 完全RPMI-1640或DMEI培养基: HT或HAT培养基:

单克隆抗体制备流程图

单抗制备流程 1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤,下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。 一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×107/0.5ml ip (腹腔内注射) ↓2~3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天) 1×107/0.5ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂,常用佐剂:福氏完全佐剂,福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。 初次免疫 Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│(一般0.8~1ml 0.2ml/点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同上,不加佐剂,ip │ (5~7天后采血测其效价,检测免疫效果) ↓2~3周后 加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv ↓3天后 取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,促进免疫细胞对抗原反应性。 (二) 饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中,许多环节需要加饲养细胞,如:在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞,也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞,使用比较方便,照射后可放入液氮罐长期保存,随用随复苏。 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系,常用BaLb/c小鼠6~10周龄 ↓ 拉颈处死浸泡于75%酒精,消毒3~5分钟 ↓

制备单克隆抗体方法

制备单克隆抗体方法 1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上,创建立杂交瘤技术,他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合,成为杂交细胞系,既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性,又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养,可形成单细胞系,即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法,便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体,其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的,而且在培养过程中,只要没有变异,不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。 这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题,可用于探讨①蛋白质的精细结构;②淋巴细胞亚群的表面新抗原;③组织相容性抗原;④激素和药物的放射免疫(或酶免疫)分析;⑤肿瘤的定位和分类;⑥纯化微生物和寄生虫抗原;⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法(“导弹”疗法,利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合,将药物带至病灶部位。因此,单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究,为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。 制备过程

1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠,按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官,刺激相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖,并分化成为致敏B淋巴细胞。 2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠,无菌操作取出脾脏,在平皿内挤压研磨,制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合,并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下,各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合,形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞,一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中,未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性,因此能在HAT培养基中存活和增殖。 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞,只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞,因此,必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法,筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞,并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后,及时进行冻存。 5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。 (1)体内诱生法取Balb/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后,腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖,并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周,可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水,即可获得大量单克隆抗体。 (2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中,杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体,收集培养上清液,离心去除细胞及其碎片,即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现,大大提高了抗体的生产量。

单克隆抗体地制备(详细材料)

单克隆抗体的研制 一、单克隆抗体的概念 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体,仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而,常规血清抗体又称多克隆抗体(polyclonal antibody),简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质,加之不同批次的抗体制剂质量差异很大,使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此,制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生,这一目标得以实现。 1975年,Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术,他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合,形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死,又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系,即杂交瘤细胞系,它所产 monoclonal antibody),简称单抗。 与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次革命,而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用,促进了众多学科的发展。 Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 (一)杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,为杂交瘤技术提供了必要理论基础,同时,骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日,Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity)的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase,HGPRT)的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导,杂交细胞通过在含有次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基喋呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)的培养基(HAT)中生长进行选择。在融合后的细胞群体里,尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+,但不能连续培养,只能在培养基中存活几天,而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活,只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自

最新单克隆抗体制备方案

单克隆抗体制备方案

单克隆抗体制备方案 细胞融合前准备 一、动物免疫 1.1 动物 选择与所用骨髓瘤细胞同源的纯系Balb/c小白鼠,雌雄皆可,鼠龄8周左右。为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫3~4只小鼠。 1.2免疫原制备 15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA(使用前需震摇) 50μg /只:称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入7mlPBS 中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。100μg/只:称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入3mlPBS 中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。150μg/只:称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入2mlPBS 中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。200μg/只:称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入1mlPBS 中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。250μg/只:称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入1mlPBS 中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。 1.3 实验步骤 初次免疫: 50μg、100μg、150μg、200μg、250μg抗原溶于PBS中,加等体积的福氏完全佐剂(CFA)腹腔和皮下注射。(共25只小鼠,每组5只,两只采用背部皮下注射,共1ml,0.2ml/点,3只采用腹腔注射) 3周后 第二次免疫:与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加福氏不完全佐剂(IFA),腹腔和皮下注射 3周后 第三次免疫:与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加IFA,腹腔和皮下注射,5天后内眦静脉或断尾取血以ELISA间接法测效价 2~3周后 加强免疫:取初次免疫抗原一半的量溶于PBS,静脉或脾内缓慢注射,以免动物发生过敏性休克而死亡。 3~4天后 腹腔注射 大鼠、小鼠一般一人即可注射:以左手大拇指与食指执住鼠两耳及头部皮肤,腹部向上,将鼠固定在手掌间,必要时,以左手无名指及小指夹住鼠尾;右手持连有5号针

单克隆抗体制备的基本原理

精心整理单克隆抗体制备的基本原理 ?一、单克隆抗体的概念 抗体(antibody)是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原 1975 交瘤细胞的单克隆系,即杂交瘤细胞系,它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体,即所谓单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb),简称单抗。

与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次**,而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用,促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒(GeorgesKo1er)和英国科学家米尔斯坦(CesarMilstein)两人由此杰 抗 《自 ( 他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransferase,HGPRT)的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导,杂交细胞通过在含有次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基喋呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)的培养基(HAT)中生长进行选择。在融合后的细胞群体里,尽管未融合的正常脾细

胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+,但不能连续培养,只能在培养基中存活几天,而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活,只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性,而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样,最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞 题,NSO/1 合后细胞将以多种形式出现,如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中存活仅5~7天,无需特别筛选,细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。在细胞融合后,要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞,一般使用HAT培养进行筛选,HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程 (一)动物的选择与免疫 1.动物的选择纯种BALB/C小鼠,较温顺,离窝的活动范围小,体弱,食量及排污较小,一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2.免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 (1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原,再加佐 剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8~1ml,0.2ml/点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射)(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同一,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价) ↓2~3周 加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv(静脉内注射) ↓3天后 取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如:① 将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。 (2)颗粒抗原免疫性强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例,免疫时要求抗原量为1~2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2~3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天)1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 (二)细胞融合

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