凉血解毒汤对再障小鼠骨髓免疫紊乱的调控_胡永珍
凉血解毒汤对再障小鼠骨髓免疫紊乱的调控
胡永珍,李 达
(广州中医药大学第二附属医院,广东广州510120)
摘 要:目的:观察再障小鼠骨髓免疫功能及造血负调控因子的变化,及凉血解毒汤的影响。方法:用物理化学复合法复制再障小鼠模型,并给予凉血解毒汤,测小鼠外周血象,骨髓造血干细胞和T 细胞凋亡的情况,及骨髓造血负调控因子IFN -C 、TN F -A 、IL -2水平。结果:再障小鼠外周血三系减少,网织红细胞下降,骨髓T 细胞比例增加,凋亡减少,而造血干细胞比例减少,凋亡增加。凉血解毒汤能在一定程度上促进骨髓T 细胞的凋亡,从而减少骨髓造血负调控因子的分泌,抑制造血干细胞的凋亡,促进外周血象及网织红细胞的恢复。结论:凉血解毒汤能有效地改善再障小鼠骨髓T 细胞与造血干细胞凋亡失衡的状况,降低造血负调控因子的水平,从实验角度直接说明了热毒与细胞免疫亢进相关。
关键词:再生障碍性贫血;中医药疗法;免疫紊乱;凋亡
中图分类号:R 285 文献标识码:A 文章编号:1000-1719(2009)02-0298-03
Liang -xue -jie -du Decoction Adjust t he M arro w I mm une -d is order in Ap lastic Ane m ia M ouse
H U Yong -zhen,LI D a
(T he S econd Affiliated H osp ital of Guangzhou University of TC M ,Guangzhou 510120,Guangdong ,Ch i na)
Abstrac t :O bjective :T o observe the i m mune disorde r and ant-i he m atopoe itic factor l eve l in aplasti c anem ia m ice ,and the e ffect o f L i ang -xue -jie -du decocti on on t hem .M et hod s :W e dupli cate aplastic ane m i a m ice model by che m ophysica l m ethod ,ad -m i nistrate L iang -xue -ji e -du decocti on on the m,and analyze the full blood count ,re ti cular ce ll count ,apoptos i s of m arro w he m o -topo i e ti c ste m ce ll and T cel,l and the leve l o f ant-i hem atopo i e ti c factor i n m arrow.Results :The modelm ice show ed the full b l ood count ,reticu l a r ce ll count are decreased ,T ce ll i n bone m arrow is i ncreased and apoptosis is suppressed ,wh i ch lead to up -regu l a -ti on of ant-i he m atopoietic factor and i n turn pro m ote the apoptos i s o f he m atopo ietic stem ce l.l L iang -xue -ji e -du decocti on can par-t ly reverse these eff ec t and i m prove the full blood count ,reticular cell count .C oncl us i on :L i ang -xue -jie -du decocti on can ad j ust the unbalance be t w een apoptosis o f bone m arro w T ce ll and hema topo i e ti c ste m ce l,l reduce t he an t-i he m atopo ietic factor ,w hich sug -gest hea t tox ity i n TC M is corre l a ted w ith cell i m mune d i so rder .
K ey word s :A plasti c anem ia ;T raditiona l Chi nese M edic i ne ;I mmune -d i sorder ;A poptosis
收稿日期:2008-04-28
作者简介:胡永珍(1974-),女,四川成都人,主治医师,博士,主要从事
血液病方面中西医结合临床及研究工作。
细胞免疫亢进是再障发病的主要机理,是当前研究的热点。纵观近年来中医治疗再障的实践,笔者发现细胞免疫亢进相当于中医之/热毒0,其异常程度与中医热毒之程度相一致:重型再障以热毒为主,称为/急劳髓枯0。轻型再障病情由轻转重的过程伴随着热毒程度的加深及免疫异常的加重[1]。名老中医梁冰首创凉血解毒汤治疗重型再障疗效显著[2],突破了再障从补肾论治的传统,也为解毒法治疗慢性再障开辟了先河。为了阐明再障之/热毒0与细胞免疫亢进的内在关系,本研究复制了再障小鼠模型,观察了凉血解毒法对再障小鼠骨髓细胞免疫的影响,为凉血解毒法治疗再障提供了细胞水平上的佐证,为免疫介导性血细胞减少性疾病中医治疗提供新的思路与方法。1 材料与方法111 实验动物
ba l b /c 小鼠,雌雄兼用,8~12周龄。
由中山大学动物实验中心提供。
112
试剂
PE ant-i m ouse CD117,PE /Cy5anti -
m ouse CD3购自eB ioscience 公司,A nnex in V -F I TC
Apoptosis Detection K it 购自B iov isi on R esearch P r oducts (US A ),环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份公司,批号:07052721),氯霉素(福建古田药业有限公司,批号:070420),小鼠I FN -C 、TNF -A 、I L -2的EL IS A 试剂盒(晶美公司,进口分装)。
中药:凉血解毒汤由羚羊角、赤芍、生地、苍耳子、贯众、三七、天门冬、黄柏等组成。将上述药物用300mL 水浸泡15m i n ,羚羊角、三七先煎30m i n ,再煎其他药物,文火煎取100mL ,生药10g /10mL 。113 造模及给药 参考孙纪元的方法[3],小鼠一次全身照射310Gy ,对照组以铅砖屏蔽后假照射,照射后第4、5、6天腹腔注射环磷酰胺50m g /kg ,氯霉素6215m g /kg ,对照组腹腔注射生理盐水,中药组从第7天给药,对照组及正常组给蒸馏水。
114 分组及处理 balb /c 小鼠30只,随机分为3组。正常组不造模。造模后,中药组从第7天给药,以凉血解毒汤按012mL /10g 体重灌胃,日1次,对照组及正常组给蒸馏水,连续10天。
115外周血象检测第18天处死小鼠。摘除眼球取外周血,EDTA2抗凝,外周血测白细胞,血红蛋白,血小板,网织红细胞。
116骨髓单个核细胞悬液的制备小鼠处死后,无菌取各组小鼠取双侧股骨,用RP M I1640培养液冲出骨髓细胞,吹打并经过0133L m滤膜,离心取上清,即为骨髓液,沉淀加入红细胞裂解液,1000r/m in离心10m i n,PBS洗涤两次,制成骨髓单个核细胞悬液(B MMNC)。
117造血负调控因子的测定采用EL IS A法,按说明书检测骨髓液中I FN-C、TNF-A、I L-2水平,用酶标仪在450n m读取吸光度A值。以标准A值绘制标准曲线,根据样品的A值查出相应的造血调控因子的含量。
118骨髓造血祖细胞及T细胞凋亡取骨髓单个核细胞悬液,调细胞浓度至107/mL,取106个细胞,标记CD117(造血祖细胞),CD3(T细胞),避光20m i n,PBS 洗一次,再标记Annex in V-F I TC,避光5m i n,上机行流式细胞仪检测,以Annex i n表达阳性者为凋亡细胞。计算CD117阳性细胞比例,CD3阳性细胞比例,并分别得出CD117阳性细胞的凋亡率及CD3阳性细胞的凋亡率。
119统计方法数据以均数?标准差(
x?s)表示,用SPSS1110软件包进行处理,均数间两组比较用t检验(双侧),多组间两两比较用方差分析及q检验。P< 0105为有统计学意义。
2结果
211小鼠外周血象的变化见表1。
表1各组小鼠外周血W BC RBC HGB PLT RET的结果(
x?s)组别n WBC(109/L)RBC(1012/L)HGB(g/L)PL T(109/L)RET(109/L)
正常组9 4.20?0.3911.06?0.48169.00?4.61635.44?46.62752.67?115.23
模型组8 1.45?0.18v8.86?1.27v133.88?3.48v360.13?31.84v374.40?101.56*中药组9 3.57?0.25v#10.37?0.38v#154.50?6.82v#593.88?89.92#638.45?99.03#注:v与空白对照组比,P<0101;#与模型对照组比,P<0101;*与模型对照组比,P<0105。
模型组小鼠外周血白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、网织红细胞均减少(与正常组比较P<0101),中药组上述各项指标均有所恢复(与模型组比P< 0101),其中网织红细胞及血小板与正常组相比差别无统计学意义。
212小鼠骨髓造血负调控因子的变化见表2。
表2各组小鼠骨髓液IFN-C TNF-A I L-2浓度检测结果(
x?s)组别n I FN-C(pg/mL)TNF-A(pg/mL)I L-2(pg/mL)
正常组90.43?17.7518.27?45.4714.93?27.55
模型组831.78?17.08v113.85?44.69v54.48?22.35v
中药组916.06?6.34v55.24?21.57*v24.68?13.88*注:v与空白对照组比,P<0101;*与模型对照组比,P<0105。
模型组小鼠骨髓液造血负调控因子I FN-C、TNF -A、I L-2浓度明显升高(与正常组比P<0101),而中药组小鼠上述负调控因子较模型组均有下降(与模型组比P<0105)。
213小鼠骨髓造血祖细胞及T细胞凋亡见表3。
表3各组小鼠骨髓造血祖细胞(CD117+)
T细胞(CD3+)凋亡率检测结果(
x?s)
组别n CD117+(%)CD3+(%)CD117+A nnex in+(%)CD3+A nnex in V+(%)
正常组93.40?0.192.33?0.7614.09?1.6950.80?2.56
模型组81.20?0.60
v13.98?1.67v34.49?6.38v33.05?2.38v
中药组92.62?1.820.39?0.17*16.24?7.32v*56.13?8.56*注:v与空白对照组比,P<0101;*与模型组比,P<0105。
模型组小鼠骨髓造血祖细胞比例下降,凋亡增加,而T细胞比例上升,凋亡减少。中药组小鼠骨髓造血祖细胞比例回升至正常,凋亡率较模型组下降;而T 细胞比例减少,凋亡增加。
结果显示:再障小鼠骨髓造血负调控因子水平异常升高,骨髓造血干细胞凋亡增加,骨髓CD3细胞凋亡减少,凉血解毒汤可促进骨髓CD3细胞凋亡,下调再障小鼠骨髓造血负调控因子I FN-C、TNF-A、I L-2的水平,减少骨髓造血干细胞凋亡。
3讨论
再障传统上从肾论治,分为补阳与滋阴两法,然而,当病人以出血、高热为主时,补阳热更炽,滋阴血不生,人们逐渐认识到此时热毒为主要病机,这一观点为梁冰教授首先提出并取得显著疗效,其后合用清热解毒法治疗再障为越来越多的医家采用[4-5]。再障病情的严重程度与热毒轻重程度相平行。重型再障发热、出血明显,热毒重;而慢性再障无明显发热及出血,热毒轻。随着再障病情的好转,治疗原则亦有/凉、平、温、热0的转变。再障发病的主要机理是细胞免疫亢进导致骨髓衰竭,因此,细胞免疫亢进的程度与骨髓衰竭的程度相平行,而骨髓衰竭越重,则粒细胞、血小板越低,发热、出血等中医热毒的表现越明显。所以,再障中医之热毒与细胞免疫亢进有内在的联系。
再障患者骨髓T淋巴细胞凋亡明显延迟,导致活化的T淋巴细胞不能及时清除[6],活化的T细胞释放大量造血负调控因子如I FN-C等,能上调造血干细胞F as抗原表达,使其成为活化T淋巴细胞的靶细胞而大量凋亡[7]。因此,T细胞凋亡延迟和造血干细胞凋亡过多,分别体现了再障细胞免疫亢进的成因及后果。
本研究选择了物理化学因素复合造模法,造模后小鼠外周血三系下降,网织红减少,符合再障表现。模型组小鼠骨髓中造血负调控因子增加,CD3+细胞(主要为T细胞)比例升高,凋亡减少,CD117+细胞(造血干细胞)比例减少,凋亡增加。说明T细胞凋亡减少,分泌造血负调控因子,从而导致造血干细胞凋亡增加,引起再障。而再障小鼠灌服中药凉血解毒汤,能诱导骨髓T细胞凋亡,减少造血负调控因子释放,使骨髓中造血干细胞凋亡减少,数量增加,提升网织红细胞水平,改善了外周血三系减少的情况。
本研究的结果表明,凉血解毒汤能有效地改善再障小鼠骨髓T细胞与造血干细胞凋亡失衡的状况,降低造血负调控因子的水平,这是凉血解毒汤治疗再障的机理,也从实验角度直接说明了热毒与细胞免疫亢进相关,为进一步运用凉血解毒汤治疗免疫介导性血
细胞减少性疾病:如特发性血小板减少性紫癜,骨髓增生异常综合征等提供了实验研究上的依据。
参考文献
[1]张文曦,姜敏,李晓惠,等.再生障碍性贫血中医辨证分型客观化
指标的探讨[J].现代中西医结合杂志,2005,14(14):1832-
1833.
收稿日期:2008-04-28
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30560173)
作者简介:李洪亮(1983-),男,江西赣州人,助教,硕士研究生,主要从事心血管药理的研究。
通讯作者:曾靖(1958-),男,江西赣州人,教授,硕士生导师,学士,主要从事心血管药理、中草药药理的研究工作。[2]梁冰.治疗再生障碍性贫血的思路[J].中医杂志,1995,36(12):
749.
[3]孙纪元,王四旺,谢艳华,等.再生障碍性贫血的动物模型实验研
究[J].中国实验动物学杂志,2000,10(4):210-212.
[4]刘大同.再生障碍性贫血中医治疗进展与解毒生血法[J].吉林中
医药,1997(2):5-6.
[5]黄振翘,黄韬,周永明,等.补肾泻肝方治疗再生障碍性贫血的临
床研究[J].上海中医药大学学报,2000,14(1):20-24.
[6]刘晓莉,张茂宏,徐从高,等.再生障碍性贫血患者骨髓T淋巴细
胞Fas抗原表达与凋亡[J].中华血液学杂志,2003,24(11):604 -605.
[7]L i u H,M i h ara K,K i m uea A,et a.l Inducti on of apop t osis i n CD34+
cells by s era fro m patients w it h apiasti e ane m ia[J].H i rosh i m a J M ed S c,i1999,48(2):57-63.
3'-大豆苷元磺酸钠对慢性心力衰竭
大鼠心肌PLB和SERCA mRNA表达的影响
李洪亮,程齐来,曾靖
(赣南医学院药学系,江西赣州341000)
摘要:目的:观察3-'大豆苷元磺酸钠对慢性心力衰竭大鼠心肌受磷蛋白(phospho la m ban,PLB)和Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATP ase,SERCA)mRNA表达的影响,探讨3-'大豆苷元磺酸钠抗心力衰竭的机制。方法:结扎大鼠冠状动脉前降支造成心肌梗死后慢性充血性心力衰竭(CHF)模型,采用实时荧光定量PCR技术观察。心肌PLB和SERCA mRNA 表达以及3-'大豆苷元磺酸钠对其影响。结果:各给药组均可不同程度的下调PLB mRNA表达,上调降低SER C A mRNA 表达,其中3-'大豆苷元磺酸钠014m g#kg-1剂量组、地高辛组与模型组比较有显著性差异(P<0105);各给药组均能降低PLB/SERCA比值,地高辛组和3-'大豆苷元磺酸钠014mg#kg-1、012mg#kg-1剂量组与模型组比较差异具有显著性(P<0105,P<0101)。结论:3-'大豆苷元磺酸钠治疗能提高SER C A mRNA表达,降低PLB mRNA表达,改善PLB/SER-C A比值,这可能是3-'大豆苷元磺酸钠抗心力衰竭的机制之一。
关键词:杠柳毒苷;受磷蛋白(PLB);Ca2+-ATP酶(SERCA);RT-PCR
中图分类号:R-33文献标识码:A文章编号:1000-1719(2009)02-0300-03
Effect of3-'daidze i n Su lfonate Sodiu m on t he Expressi on
of PLB and S ERCA mRNA in Chron ic Heart Fail u re R ats
LI H ong-li ang,C H E N G Q i-lai,ZENG J ing
(D e p ar t m ent of Phar m aceutical,G annan M e d ical University,Ganzhou341000,J i angx i,China)
Abstrac t:O bjective:T o observe the effect o f3-'da i dze i n su lfonate sodi um on the expression of PLB and SERCA mRNA in chron i c heart fail ure(C H F)rats and the m echan is m o f3-'daidzein sulfona te sodiu m ag ai nst hea rt fail ure.M ethods:T he m ode l of C HF was i nduced by li gati ng t he anterior descend i ng branch of t he left co ronary artery.T he rats were a t random div i ded i nto si x g roups:sha m ope ration g roup,m ode l g roup,d i gaox i n group,three treat ment g roups treated w ith014m g#kg-1,012m g#kg-1and 011m g#kg-1do sage of3-'da i dze i n sulf onate sod i u m.A fter ad m i nistrati on for4w eeks.T he e ffect o f3-'daidze i n sulfonate sod-i u m i n trea t m ent on t he expression of PLB and SERCA mRNA was observed by RT-PCR.R esults:A ll the treated groups could de-
c rease t he expressi on of PLB mRNA an
d i ncreas
e t he expressi on o
f SERCA mRNA i n different degree,and t here w as si gnificant
d ifferenc
e bet w een the3-'da i dze i n sulfonate sod i u m014m g#kg-1dosag e trea ted g roup,digaox i n group and mode l group(P< 0105);A ll t he trea ted groups cou l d decrease rati o o
f PLB/SERCA.Co m pared w it h model group,digaox i n group and t he3-'daid-ze i n sulfona te sodiu m014m g#kg-1,012mg#kg-1dosage treated group had si gn ifican t d iffe rence(P<0105,P<0101).Conclu-sion:G l ucope ri p l ocy m a r i n treat m ent cou l d i ncrease the expression o f SERCA mRNA,decrease the expression o f PLB mRNA and i m prove t he ratio o f PLB/SERCA,and it m igh t be one of the m echan is m o f3-'da i dze i n sulfonate sodi um i n aga i nst hea rt fa il ure.
K ey word s:3-'da i dze i n sulf onate sod i u m;PLB;SERCA;RT-PCR
心力衰竭,简称心衰,是指在有适量静脉回流的情况下,由于心脏收缩和(或)舒张功能障碍,心排血量不足以维持正常组织代谢需要的一种病理生理综合征。慢性心力衰竭是各种心脏疾病的终末期表现。心力衰竭的基本机制是心肌收缩和(或)舒张功能的障碍,而Ca2+的运动是调控心肌舒缩活动的中心环节。