波谱学杂志
第27卷第1期
2010年3月 Chinese Journal of M agnetic Resonance Vo l.27No.1 M ar.2010
文章编号:1000-4556(2010)01-068-12
核磁共振波谱在药物发现中的应用
周秋菊1,2,向俊锋1,唐亚林1*
(1.中国科学院化学研究所,分子动态与稳态结构国家重点实验室,北京100190;
2.中国科学院研究生院,北京100049)
摘 要:核磁共振波谱通过检测组成有机化合物分子的原子核跃迁而得到反映核性质的参数以及周围化学环境对这些参数的影响规律.这些参数的相关内容包含了极其详尽的有机化合物分子结构和分子间相互作用的信息,并构成了核磁共振结构解析和生物靶分子-配体相互作用研究的理论基础.在生物医药研发领域内,科研院所和公司企业的研发工作者们一直在努力探索利用核磁共振波谱监测生物靶分子-配体相互作用作为药物发现工具的潜能.本文旨在针对核磁共振波谱在药物发现过程中活性化合物筛选的最新研究进展进行综述.
关键词:核磁共振(N M R);药物发现;DO SY;G-四链体;筛选方法
中图分类号:O482.53 文献标识码:A
引言
核磁共振波谱是一种物理方法,它检测的是组成有机化合物分子的原子核的性质及其周围化学环境的相互作用.从核磁共振波谱得到的反映核性质的参数,以及周围化学环境对这些参数的影响规律,包含了极其详尽的有机化合物分子结构和分子间相互作用[1,2]的信息,并构成了核磁共振结构解析和生物靶分子-配体相互作用研究的理论基础[3-8].在过去的10年,在学术界和工业界的研发工作者们的共同努力下,核磁共振在新药研发的各个阶段,特别是在新药的临床前研究中正在发挥着越来越大的作用.在以往,核磁共振(NM R)在新药研发中的作用主要在于药靶分子如蛋白[9-16]和核酸分子[17-23]的空间结构研究,以及小分子先导化合物和天然产物的结构分析.最近几年,随着各种技术和核磁谱仪的发展,如今核磁共振已经在蛋白质-配体相互作用的分子机理研究、小分子的高通量筛选、药物构效关系研究以及毒理学和新药安全评价等方面起着
收稿日期:2009-12-15
作者简介:周秋菊(1978-),女,湖北竹山人,博士研究生,主要从事基于核磁共振技术的天然抗肿瘤活性化合物结构筛选工作. *通讯联系人:唐亚林,电话:010-********,E-mail:tangyl@https://www.wendangku.net/doc/9b10797398.html,.
越来越重要的作用.在已经知道生物靶分子的空间结构之后,NM R 在研究生物靶分子-配体相互作用方面的快速性是其它方法难以比拟的.在新药筛选过程中,传统的高通量(H TS )方法[24-28]
尽管非常好,但却有其固有的限制,如需要花费大量的时间和精力去建立针对一个或一类蛋白的鉴定方法;所能检测到的都是亲和力相对较强的分子;要直接针对一个很大的化合物库进行筛选.而NM R 方法却具有普遍适应性,不需要去针对每一个蛋白质建立特殊的方法,一旦靶分子被确定,就可以进行筛选;能够检测出亲和力较弱的配体;所筛选的可以是小的分子骨架,而这些骨架片段可以通过桥链连接成许多不同的分子.当然,选择适当的化合物库也是很重要的,已经有人专门研究针对NM R 筛选方法设计化合物库.随着实验技术特别是硬件技术的发展,NM R 的灵敏度得到了大大提高,NM R 筛选方法所需要的生物靶分子用量正在大量降低,使得它的适用性更高.
核磁共振波谱在药物发现过程中的典型技术主要有化学位移扰动[29,30],扩散[31-34],弛豫[31,35],NOE 效应[36-39],饱和转移[40]等等.依据不同的研究对象,可以对上述这些核磁共振技术进行不同的组合或与其它分析技术、虚拟计算相结合,在活性化合物的筛选方面发挥巨大作用.下面就对近年来基于NM R 技术在活性化合物筛选的典型应用进行综述.1 活性化合物的筛选
利用NM R 技术所建立的生物活性化合物筛选方法按对象可分为2种:基于药靶的筛选和基于配体的筛选.基于药靶的筛选方法是通过观察生物靶分子的化学位移变化来实现的.最著名的就是由Abbo tt 实验室的Fesik 小组发明的方法,称为SA R -by -NM R
(Structure -activity relatio nship by NM R )[41-45]和受到同行关注的基于G -四链体识别和
核磁共振技术的天然抗肿瘤化合物的筛选及结构鉴定一体化方法[29,30].基于配体的筛选方法主要有2类:基于流体力学性质(如扩散和弛豫)变化的方法和基于磁化矢量转移的方法;前者包括扩散[31-34]和弛豫滤波[31,
35]的方法;后者包括转移NOE [36]、饱和转移[40,46-52]等方法,下面分别加以阐述.
1.1 SAR -by -NMR
SA R -by -NM R 方法是利用15N 标记的蛋白质和15N -1H H SQC 实验来实现的.由于小分子和蛋白质结合后,蛋白质结合位点的局部化学环境会发生改变,因此通过2D 15N -1H H SQC 谱中15N 或1H 的化学位移的变化可以检测到是否有小分子和蛋白结合.同时配体和蛋白质的结合常数可以通过化学位移的变化和配体浓度的关系测得,结合位点也可以由发生化学位移变化的原子核来确定.SAR -by -NM R 方法的基本步骤如图1所示,首先筛选结合于生物靶分子亚活性位点的低亲和性配体A 和B ,然后通过优化和组装便得到所期望的高亲和性配体C [42].
SA R -by -NM R 成功的关键在于使用了NM R 实验方法来辨别小分子和生物靶分子的结合,能够很快地从小分子化合物库中发现结合于靶分子亚活性位点的低亲和性配体.NM R 还可以通过蛋白质特定酰胺信号的变化直接得到配体结合位点的结构信息,这一点对辨别小分子是否结合在靶蛋白的不同亚位点上非常重要.同时,通过比较结合在同一亚位点的小分子的结构,可以得到对结合有主要贡献的官能团的信息,然后通过
69
第1期 周秋菊等:核磁共振波谱在药物发现中的应用
图1 SAR -by -NM R 基本步骤(图片来源:http ://
w ww -bioc .rice .edu /bios576/nm r /nmr .h tm l #ex am -
ple )
Fig .1 Sch ematic diag ram depicting S AR -by -NM R
experiments (Cited from the w eb :http ://w w w -
bioc .rice .edu /bios576/nm r /n mr .html #example .)结构与活性的关系对小分子进行优化.除
此之外,这个方法还可以用于直接研究“变
构效应”,即在第1个亚位点配体存在下进
行筛选时可能发现那些只有在第1个配体
存在下才能和靶蛋白的其他亚位点结合的
配体,第2个配体只有在另1个配体存在
的情况下才能和靶蛋白稳定地结合.
SAR -by -NM R 的出现除了由于药物发
现领域本身各种方法不断发展之外,也离
不开相关领域的发展与成熟.例如在分子
生物学的发展方面,通过基因工程和蛋白
质工程可以得到大量经过重组的纯蛋白质,
而且可以对蛋白质进行稳定同位素标记,
使蛋白质适于进行N M R 结构分析.多维
核磁共振技术自身的不断成熟和发展,使
其可以解析越来越大的蛋白质结构[53-58],
甚至是膜蛋白结构的解析[59].尤其重要的
是,由于蛋白质可以在接近生理环境的溶
液中或者在活细胞中[60]直接进行NM R 结
构测定,因此得到的配体和蛋白质相互作
用结构信息更为直观、可靠,这些都是
SAR -by -NM R 成功的关键因素.
SAR -by -NM R 和基于组合化学的方法
的相似之处是两者都须经过筛选大量化合
物,都充分利用了有机化合物结构多样性的特点,从中获得高活性的先导化合物.两者的差别在于:组合化学是先制备由大量化合物组成的化合物库,然后对这些化合物库进行直接筛选;而SA R -by -N M R 筛选的是未经“组合”(连接)的小分子化合物
骨架,得到结合于靶蛋白亚活性位点的低
亲和性配体,经优化后再“组装”成高亲和性的配体.SA R -by -NM R 方法采用了2D 15N -
H SQC 技术,因为15N 标记的蛋白质的15N -HSQC 谱中酰胺基的15N 和1H 的相关信号的分辨率较高,而且能在10min 之内完成一次对浓度在0.5m mol /L 的15N 标记的蛋白质的检测.如果以10个化合物为一组,使用自动样品交换器,每天可以筛选1000个化合物.这样10天便可以筛选10000个左右化合物.如果采用低温探头,则可采用100个化合物一组,一天就可以筛选10000个化合物,而且所需要的蛋白质量只为以前的1/
10.这个数目和组合化学中动辄数十万的化合物库相比,表面上看似乎相对小了一些,然而它们只是将被连接起来的最终化合物的骨架片段,如果再假设所设计的连接桥有10
70波 谱 学 杂 志 第27卷
种,那么这10000个小分子片段实际代表了一个由10亿(10000×10000×10)个分子组成的化合物库.真正合成并筛选如此巨大的化合物库需要耗费极大的财力和物力.由于SA R -by -NM R 所筛选的大多数小分子及其类似物大多都有储备或商品供应,所以整个过程只需进行少量有目的的有机合成,从而节省了大量的财力和物力,尤其节省了可贵的时间,如Abbo tt 实验室的Fesik 小组筛选基质溶素(stromely sin )的抑制剂只用了半年时间[43,44].
SA R -by -NM R 在发现高亲和性配体(或药物先导化合物)方面有巨大的潜力.尤其是该方法能够节省大量的时间和费用及其在药物设计方面的有效性是其它方法所不及的.该方法的主要限制在于,它需要知道靶蛋白确切的N M R 三维结构,目前NM R 技术解析的蛋白质的分子量限制约为30000[61];另外实验还需要足够量的15
N 标记的靶蛋白用以筛选和结构测定,这对于那些不能在细菌中大量表达的药物标靶蛋白来讲,是一个难以克服的困难,而且大量15N 标记蛋白,也是很昂贵的,这些方面的问题限制了该方法的更广泛的应用.
1.2 基于G -四链体识别和核磁共振技术的天然抗肿瘤化合物的筛选及结构鉴定一体化方法
所谓G -四链体,是鸟嘌呤在一定条件下通过氢键形成的G -四联体相互堆积在一起之后形成的一种独特的DNA 二级结构,这种G -四链体结构在人体内广泛存在.研究发现,这种G -四链体具有很重要的生理功能,它能抑制一种在85%的肿瘤细胞中都高度表达的端粒酶的活性;还可以下调c -my c 、c -kit 、bcl -2等致癌基因的表达,所以,G -四链体作为抗肿瘤药物分子靶点,成为研究热点.寻找G -四链体的稳定剂以开发抗肿瘤药物受到广泛关注[62-67].到现在为止,与小分子作为G -四链体结构稳定剂相关的文献有上千篇,但是绝大多数已报道G -四链体稳定剂对于DNA 双链或者三链体有着相同甚至更高的亲和性[68,69],选择性差是当前大部分G -四链体稳定剂难以成药的症结之一.因此,
寻找结构新颖的对G -四链体有特异性结合的小分子是以G -四链体为靶点来研究开发抗肿瘤药物的一个关键问题[70].
而植物来源化合物一直都是开发结构复杂多样、抗肿瘤机制奇特的抗肿瘤新药的宝贵源泉[71-74],我们希望从丰富的植物资源中找到结构新颖的对G -四链体有特异性结合的小分子.但是,目前用来寻找G -四链体配体的方法,如热融荧光分析法[75]
、电泳分析法[76]、电喷雾离子化质谱法[77]和端粒重复序列扩增[78]等技术都只能筛选结构已知的化合物.到目前为止,还没有一种能够直接从成分复杂、结构未知的天然产物中筛选G -四链体稳定剂的方法.因此,利用G -四链体与某些相对应的专一分子特异性结合的特性,开发一种直接从成分复杂、结构未知的天然产物中筛选G -四链体配体的方法势在必行.在这里,我们针对G -四链体这种特定的生物靶分子,提出了一种不同于传统的以生物活性为导向的理化分离方法的快速筛选方法即基于G -四链体识别和核磁共振技术的天然抗肿瘤化合物的筛选及结构鉴定一体化方法.
基于G -四链体识别和核磁共振技术的天然抗肿瘤化合物的筛选及结构鉴定一体化方法的总体思路是:在天然产物中引入G -四链体,利用G -四链体对其配体的特异性识别作用获取配体核磁共振谱学信息,进而对其结构进行鉴定.该方法主要由以下3步实验构成,如图2所示:通过1H NM R 谱中G -四链体亚氨基质子化学位移的变化判断植71
第1期 周秋菊等:核磁共振波谱在药物发现中的应用
物提取物中G -四链体配体的存在;利用扩散序谱(DOSY )对G -四链体配体进行虚拟分离,得到其特征峰;再进一步利用异核单量子相关(H SQC )、异核多键相关(H MBC )等二维核磁共振技术进行结构解析,得到G -四链体配体即活性化合物的化学结构
.
图2 基于G -四链体识别和核磁共振技术的天然抗肿瘤化合物的筛选及结构鉴定一体化方法的技术路线Fig .2 S chematic diagram depicting the technique line of “Screening Poten tial Antitumor Agen ts from
Natural Plant Extracts by G -Quad ruplex Recognition and NM R M ethods
”
图3 基于G -四链体识别和核磁共振技术的天然抗肿瘤化合物的筛选及结构鉴定一体化方法的基本步骤[30]Fig .3 S chematic diagram depicting the basic s teps of “Screening Potential Antitumor Agen ts from Natu ral Plan t Extracts by G -Quadruplex Recognition and NM R M ethods ”
72波 谱 学 杂 志 第27卷
该方法特点在于:第一,利用自由态的G -四链体与结合态G -四链体低场区(δ12~
10)亚氨基质子化学位移差异来判断植物粗提物中活性化合物的存在.一般有机化合物在该低场区(δ12~10)没有信号,所以不受干扰;另外,低场区亚氨基质子信号是G -四链体特有信号,不需要对靶分子进行同位素标记.第二,利用植物粗提物中活性化合物与G -四链体结合之后的扩散系数将远小于其它非活性化合物的扩散系数这种差异,采用DOS Y 对植物粗提物中的活性化合物进行“虚拟”分离,通过比对靶分子扩散维上信号在受到粗提物“干扰”前后的差异找出活性化合物的部分信号.与传统的分离提取方法相比,该方法的优点是:不需要生物活性检测和理化分离提取就可以获得活性分子的结构,因此也就缩短了流程、降低了难度、节约了成本.与SA R -by -NM R 相比,对于G -四链体这一特殊的靶分子来说,该方法还省掉了同位素标记的费用.该方法报道后,被《Nature ·China 》选为研究亮点,并以“Screening Me thods :Loo king fo r Ligands ”为题对这一成果进行了介绍.当然,同SA R -by -NM R 一样,该方法所检测的也是靶分子的信号,它需要足够量靶分子用以筛选和结构测定,所以该方法也无可避免地受限制于靶分子的来源和合成.
1.3 基于流体力学性质(如扩散和弛豫)改变的方法
横向弛豫时间(T 2)和自扩散系数(D )也与分子的大小有明显的相关性,当小分子与大分子结合之后,其T 2值将会减小,谱线会变宽,而且谱线变宽的程度与其结合强度是一致的
[79-81],如图4所示,当有蛋白质存在时,与蛋白质结合的小分子的谱峰就减弱[81].同样,小分子的扩散速率要比大的蛋白质分子快几个数量级,当小分子与大分子结合之后,其自扩散系数将会明显减小,减小程度也依赖于其与大分子的亲和性[29-34].用简单的一维脉冲场梯度核磁共振实验就可以测量自扩散系数的变化.对小分子混合物,可以采用扩散编辑的一系列2D TOCS Y 谱来对各自的自旋体系进行归属.
基于上述图4 横向弛豫时间研究靶分子-配体相互作用的1H NM R 谱[81]Fig .4 1H NM R spectra of the in teraction s betw een nacromolecule and its ligands (Recorded by the s tand -ard Bru ker pu lse program cpmg1d that app l ies C ar r -Pu rcell -M eiboom -Gill sequ ence fo r T 2filter )技术,有2种对化合物库进行筛选的、
较为实用的方法,分别是基于弛豫和扩
散的一维谱方法,所利用的同样是弛豫
时间和扩散性质的变化[82,83].当有蛋白
质存在时,与蛋白质结合的小分子的谱
峰就消失了,将2张谱相减,得到的差
谱即是与蛋白质结合的小分子的共振
峰.由于这些方法检测的是未与大分子
结合的小分子的信号,而不是与大分子
结合的小分子或大分子本身的信号,使
其可以用来检测分子量大得多的蛋白质
标靶系统.同时,由于不需要进行同位
素标记,也不需要做二维谱,既可以节
省时间,又可以节省费用;其缺点在于
有可能在做差谱时产生错误[83].
73
第1期 周秋菊等:核磁共振波谱在药物发现中的应用
1.4 基于磁化矢量转移的方法
饱和转移差谱(saturation transfe r difference ,S TD )方法属于基于配体的筛选方法,该方法的基本步骤如图5所示.蛋白质等大分子包含有许多质子,这些质子之间存在偶极-偶极相互作用,蛋白质中的质子的横向弛豫速率R 1是由交叉弛豫速率决定的,当我们选择性地照射蛋白质中的一部分质子时,磁化强度就会传递到整个蛋白质中,通过分子间相互作用,磁化强度也会传递到与蛋白质结合的小分子上,使得它的信号部分被饱和.由未经选择性照射和经选择性照射得到的谱图之间的差谱,可以清楚地显示出与蛋白质结合的小分子的谱峰[46,47,51].同时,利用配体分子中各部分被饱和程度的不同,还可以据此确定小分子的结合部位[40,49].STD 谱的灵敏度取决于蛋白质的大小、照射的时间长短、配体的解离速率以及配体的过量程度
.
图5 饱和转移差谱的基本步骤[84]
Fig .5 S chematic diagram depicting difference spectroscopy in th e ST D experiment
转移NOE 实验是一个已经很完善的方法.当小分子配体与大分子结合并且处于快速交换状态时,转移NOE 实验可以检测结合状态的小分子配体的构象.当小分子与大分子结合之后,其NOE 的大小和符号都发生了变化,将小分子混合物与蛋白质分子加在一起,然后采集NOES Y 谱.对那些自由的小分子,其NOE 交叉峰与对角峰是反向的,而与蛋白质结合的小分子的NOE 交叉峰与对角峰是同向的.这就可以将与大分子结合的小分子同未结合的小分子区别开来,从而达到对混合物进行筛选的目的.74波 谱 学 杂 志 第27卷
2 结论与展望
综上所述,核磁共振技术在活性化合物的筛选方面有着巨大的潜力,尤其是上述基于靶分子的筛选方法能够节省大量的时间和费用及其发现活性化合物方面的有效性是其它方法所不可替代的.我们有理由相信,随着生物技术的发展和后人类基因组时代的到来,越来越多的和疾病相关的靶蛋白或生物靶分子被发现和合成,上述一系列筛选方法在发现具有生物活性的化合物方面将会发挥越来越巨大的作用.
参考文献:
[1] Fadeev E A ,Sam M D ,Clu bb R T .NM R structure of the amin o -terminal domain of the lambda integras e pro -
tein in com plex w ith DNA :immobilization of a flexible tail facilitates beta -sheet recognition of the major groove
[J ].J M ol Biol ,2009,388(4):682-690.
[2] C hristen B ,Ho rn emann S ,Damberger F F ,et al .Prion protein NM R s tru cture from tammar w allaby (M acro -
pu s eugenii )show s th at the beta2-alpha2loop is modulated by long -range sequen ce effects [J ].J M ol Biol ,2009,389(5):833-845.
[3] Pellecchia M ,S em D S ,W uthrich K .NM R in d ru g discovery [J ].Nat Rev Drug Discov ,2002,1(3):211-
219.
[4] Pellecchia M ,Bertini I ,Cow bu rn D ,et al .Perspectives on NM R in drug discovery :a technique comes of age
[J ].Nat Rev Dru g Discov ,2008,7(9):738-745.
[5] S un H ,T ang Y ,Xiang J ,et a l .Spectroscopic studies of the interaction betw een quercetin and G -quad ruplex
DNA [J ].Bioorg M ed Ch em Lett ,2006,16(13):3586-3589.
[6] S un H ,Xiang J ,Tang Y ,et al .Regulation and recognization of th e extended G -quadruplex by rutin [J ].Bio -
chem Biophys Res Commu n ,2007,352(4):942-946.
[7] Li Q ,Xiang J ,Li X ,et al .S tabilizing parallel G -qu adrup lex DNA by a new class of ligands :Tw o non -planar al -
kaloids through in teraction in lateral grooves [J ].Biochimie ,2009,91(7):811-819.
[8] Yang Q ,Xiang J ,Yang S ,eta l .Verification of s pecific G -quadruplex structure by usin g a novel cyanine dye su -
p ramolecular as sem bly :Ⅱ.The bin ding characterization w ith specific intram olecu lar G -qu adrup lex and the rec -ognizing mech anism [J ].Nu cleic Acids Res ,2009,doi :10.1093/nar /gkp1045.
[9] W eidauer S E ,Schmieder P ,Beerbaum M ,et al .NM R structure of the W nt m odu lator protein S clerostin [J ].
Biochem Biophys Res Commu n ,2009,380(1):160-165.
[10] Lau ren ts D V ,Bruix M ,Jimenez M A ,et a l .T he 1H ,
13C ,15N resonance assignment ,solu tion structu re ,and res idue level stability of eosinophil cationic protein /RNas e 3determined by NM R s pectros copy [J ].Biopoly -mers ,2009,91(12):1018-1028.
[11] Elets ky A ,Su kumaran D K ,Xiao R ,eta l .NM R structu re of protein YvyC from Bacillus su btilis reveals unex -
pected structural similarity betw een tw o PFAM families [J ].Proteins ,2009,76(4):1037-1041.
[12] Nanga R P ,Bren der J R ,Xu J ,et al .Th ree -dimensional structure and orien tation of rat islet amy loid polypep -
tide protein in a mem brane environm en t by solution NM R spectroscopy [J ].J Am Chem Soc ,2009,131(23):8252-8261.
[13] M acek P ,C hmelik J ,K rizova I ,et al .NM R s tru cture of th e N -terminal domain of capsid p rotein from the ma -
son -pfizer monkey viru s [J ].J M ol Biol ,2009,392(1):100-114.
[14] Ryab ov Y ,S uh J Y ,Grish aev A ,et al .Using the experimentally determined com ponen ts of the overall rota -
tional diffu sion tensor to restrain molecular shape an d size in NM R s tru cture determination of globu lar protein s an d protein -p rotein complexes [J ].J Am Ch em Soc ,2009,131(27):9522-9531.
[15] Theisgen S ,S cheidt H A ,M agalhaes A ,et a l .A solid -state NM R study of the structu re an d dynamics of the 75
第1期 周秋菊等:核磁共振波谱在药物发现中的应用
76波 谱 学 杂 志 第27卷
myris toylated N-terminu s of th e guany late cyclase-activating protein-2[J].Biochim Biophy s Acta,2010,1798
(2):266-274.
[16] S aio T,Yokochi M,Inagaki F.T he NM R structu re of the p62PB1dom ain,a key protein in au tophagy and
NF-k appaB s ignaling pathw ay[J].J Biomol NM R,2009,45(3):335-341.
[17] W ang Y,Patel D J.Solution s tru cture of a parallel-stranded G-qu adru plex DNA[J].J M ol Biol,1993,234
(4):1171-1183.
[18] Kettani A,Bouaziz S,Wang W,et a l.Bombyx mori single repeat telomeric DNA sequence form s a G-quad ru-
plex capped by base triads[J].Nat Struct Biol,1997,4(5):382-389.
[19] Zh ang N,Ph an A T,Patel D J.(3+1)Assembly of three human telom eric repeats into an asym metric dimer-
ic G-quadruplex[J].J Am Ch em Soc,2005,127(49):17277-17285.
[20] Phan A T,Ku ryavyi V,Gaw H Y,et al.S mall-molecule interaction w ith a five-guanine-tract G-quad ruplex
structu re from the h uman M YC promoter[J].Nat C hem Biol,2005,1(3):167-173.
[21] Luu K N,Phan A T,Ku ryavyi V,et al.S tru cture of the hum an telomere in K+s olution:an intram olecular(3
+1)G-quad ru plex s caffold[J].J Am Ch em Soc,2006,128(30):9963-9970.
[22] Phan A T,Ku ryavyi V,Bu rge S,et al.S tru cture of an un precedented G-quadruplex scaffold in th e hu man c-kit
promoter[J].J Am Chem S oc,2007,129(14):4386-4392.
[23] Lim K W,Amrane S,Bouaziz S,et a l.Structure of the hu man telomere in K+solution:a stab le basket-type
G-quadruplex with only tw o G-tetrad layers[J].J Am Ch em Soc,2009,131(12):4301-4309.
[24] C hataigner I I,Gennari C,Piarulli U,et a l.Discovery of a new efficient chiral ligand for copper-catalyz ed enan-
tios elective michael additions by high-throughpu t screening of a parallel library[J].Angew Chem Int Ed En gl, 2000,39(5):916-918.
[25] S eneci P,M iertu s S.C om binatorial chemistry and high-throughpu t screening in drug discovery:different strat-
egies and form ats[J].M ol Divers,2000,5(2):75-89.
[26] Potyrailo R A,C hish olm B J,Olson D R,et al.Development of combinatorial chemis try meth od s for coating s:
high-throughpu t screening of ab rasion resis tance of coating s libraries[J].Anal Chem,2002,74(19):5105-5111.
[27] Fon seca M H,List B.C om binato rial chemistry and high-through pu t screening for the discovery of organ ocata-
lysts[J].Cu rr Opin Chem Biol,2004,8(3):319-326.
[28] Diller D J.The synergy between com binatorial chemistry and high-throughpu t screening[J].C urr Opin Drug
Dis cov Devel,2008,11(3):346-355.
[29] Zh ou Q,Li L,Xiang J,eta l.Screening poten tial antitumor agen ts from natu ral plan t extracts by G-quad ruplex
recognition and NM R methods[J].Angew Chem In t Ed Engl,2008,47(30):5590-5592.
[30] Zhou Q,Li L,Xiang J,et al.Fast s creening and structu ral elu cidation of G-quad ruplex ligands from a mixture
via G-quadruplex recognition and NM R methods[J].Biochimie,2009,91(2):304-308.
[31] Hajduk P J,Olejniczak E T,Fesik S W.One-dimen sional relaxation-and diffu sion-edited NM R methods for
screening compounds that bin d to m acromolecules[J].J Am C hem Soc,1997,119(50):12257-12261. [32] Price W S.Pulsed-field g radient nuclear magn etic resonance as a tool for s tudying tran slational diffusion.1.
Basic th eory[J].C on cep ts M agn Reson,1997,9(5):299-336.
[33] Price W S.Pu lsed-field gradien t nuclear magnetic resonan ce as a tool for s tu dying trans lational diffusion:Part
Ⅱ.E xperim ental aspects[J].Concepts M agn Reson,1998,10(4):197-237.
[34] Deh ner A,Kess ler H.Diffusion NM R spectroscopy:Folding and aggregation of dom ain s in p53[J].C hem bio-
chem,2005,6(9):1550-1565.
[35] S tebbin s J L,Ju ng D,Leone M,et al.A s tru cture-based approach to retinoid X receptor-alp ha inhibition[J].
J Biol Ch em,2006,281(24):16643-16648.
[36] Fejzo J,Lepre C A,Peng J W,et a l.The S HAPES strategy:an NM R-b ased app roach for lead generation in
drug discovery[J].C hem Biol,1999,6(10):755-769.
[37] J ohnson E C ,Feh er V A ,Peng J W ,et al .Application of NM R S HAPES screening to an RNA target [J ].
J Am C hem S oc ,2003,125(51):15724-15725.
[38] Lepre C A ,Peng J ,Fejz o J ,et al .Applications of S HAPES screening in drug dis covery [J ].Comb C hem Hig h
Th roughpu t Screen ,2002,5(8):583-590.
[39] Leone M ,Freeze H H ,Chan C S ,et al .Th e Nuclear Overhau ser Effect in th e lead identification p rocess [J ].
Curr Dru g Discov Techn ol ,2006,3(2):91-100.
[40] M eyer B ,Klein J ,M ayer M ,et a l .Saturation tran sfer difference NM R s pectroscopy for identifying ligand
epitopes and binding specificities [J ].Erns t Scherin g Res Found Work shop ,2004,44:149-167.
[41] Hajduk P J ,Greer J .A decade of fragmen t -based drug design :s trategic advan ces and les sons learned [J ].Nat
Rev Drug Discov ,2007,6(3):211-219.
[42] S huker S B ,H ajdu k P J ,M eadow s R P ,et a l .Discovering hig h -affinity ligands for p roteins :SA R by NM R
[J ].Science ,1996,274(5292):1531-1534.
[43] Hajduk P J ,Sheppard G ,Nettes heim D G ,eta l .Discovery of poten t nonpep tide inhibito rs of stromely sin using
SAR by NM R [J ].J Am Ch em Soc ,1997,119(25):5818-5827.
[44] M acPh ers on L J ,Baybu rt E K ,Cap parelli M P ,et al .Dis covery of CGS 27023A ,a n on -peptidic ,p otent ,and
orally active stromelysin inhibito r that block s cartilage deg radation in rabbits [J ].J M ed Chem ,1997,40(16):2525-2532.
[45] Petros A M ,Dinges J ,Au geri D J ,et a l .Discovery of a poten t in hibitor of the antiapoptotic protein Bcl -xL
from NM R and parallel syn th esis [J ].J M ed Chem ,2006,49(2):656-663.
[46] M ayer M ,M eyer B .Characteriz ation of ligand bin ding by satu ration transfer difference NM R spectroscopy [J ].
Angew Chem In t Ed Engl ,1999,38(12):1784-1788.
[47] M ayer M ,M eyer B .Group epitope mapping by s aturation tran sfer differen ce NM R to iden tify segmen ts of a
ligand in direct contact w ith a protein recep tor [J ].J Am Chem S oc ,2001,123(25):6108-6117.
[48] M ayer M ,James T L .NM R -based characterization of phen othiazin es as a RNA binding scaffold [J ].J Am
Chem S oc ,2004,126(13):4453-4460.
[49] S alvatella X ,M artinell M ,Gairi M ,et al .A tetragu anidinium ligand binds to the su rface of th e tetramerization
domain of p rotein P53[J ].Angew Ch em Int Ed Engl ,2004,43(2):196-198.
[50] M ayer M ,Lang P T ,Gerb er S ,et al .Sy nthesis an d testing of a focused phen othiazin e lib rary for binding to
HIV -1TA R RNA [J ].Chem Biol ,2006,13(9):993-1000.
[51] M ayer M ,James T L .Detecting ligand bin ding to a small RNA target via satu ration tran sfer difference NM R
ex periments in D (2)O and H (2)O [J ].J Am Chem S oc ,2002,124(45):13376-13377.
[52] Yan J ,Kline A D ,M o H ,et a l .The effect of relaxation on the epitope mapping by saturation transfer differ -
ence NM R [J ].J M agn Reson ,2003,163(2):270-276.
[53] Ramelot T A ,Raman S ,Ku zin A P ,et a l .Improving NM R protein structure quality by Rosetta refinement :a
molecular replacement s tudy [J ].Protein s ,2009,75(1):147-167.
[54] W illiams on M P ,C raven C J .Automated protein structure calcu lation from NM R data [J ].J Biomol NM R ,
2009,43(3):131-143.
[55] Sharma S ,Zheng H ,Hu ang Y J ,et al .Cons tru ct optimization for protein NM R structu re analysis using amide
hydrogen /deuterium exchange mass spectrometry [J ].Protein s ,2009,76(4):882-894.
[56] Berjanskii M ,Tang P ,Liang J ,et a l .GeNM R :a w eb server fo r rapid NM R -bas ed protein structu re determi -
nation [J ].Nucleic Acids Res ,2009,37(Web Server issue ):W 670-677.
[57] S alm on L ,Bouvignies G ,M arkwick P ,et al .Protein conformational flexibility from structu re -free analysis of
NM R dipolar coupling s :quan titative and absolu te determination of back bone m otion in ubiquitin [J ].Angew Chem In t Ed Engl ,2009,48(23):4154-4157.
[58] Ram an S ,Huang Y J ,M ao B ,et al .Accurate automated protein NM R structure determination using u nas -signed NOES Y data [J ].J Am Ch em Soc ,2010,132(1):202-207.
77
第1期 周秋菊等:核磁共振波谱在药物发现中的应用
78波 谱 学 杂 志 第27卷
[59] C olumbus L,Lipfert J,Jam bunathan K,et al.M ixing and m atching detergents for membrane protein NM R
structu re determination[J].J Am Chem Soc,2009,131(21):7320-7326.
[60] S ak akib ara D,Sasaki A,Ikey a T,et a l.Protein s tru cture determination in living cells by in-cell NM R spectros-
copy[J].Natu re,2009,458(7234):102-105.
[61] Pellecchia M,M einin ger D,Dong Q,et al.NM R-based structural ch aracterization of large protein-ligand inter-
action s[J].J Biom ol NM R,2002,22(2):165-173.
[62] M ergny J L,H elene C.G-quadruplex DNA:a target for drug design[J].Nat M ed,1998,4(12):1366-
1367.
[63] Hu rley L H.DNA and its as sociated p roces ses as targets for can cer therapy[J].Nat Rev Can cer,2002,2(3):
188-200.
[64] Neidle S,Parkins on G.Telomere m aintenan ce as a target for antican cer drug discovery[J].Nat Rev Dru g Dis-
cov,2002,1(5):383-393.
[65] Hu rley L H,Wheelhouse R T,Sun D,et al.G-quad ru plex es as targets for drug design[J].Pharmacol Ther,
2000,85(3):141-158.
[66] Hu rley L H.Secondary DNA s tru ctures as molecular targets for cancer therapeutics[J].Biochem Soc T ran s,
2001,29(Pt6):692-696.
[67] Neidle S,Read M A.G-quadruplexes as therapeutic targets[J].Biop oly mers,2000,56(3):195-208.
[68] Koeppel F,Riou J F,Laoui A,eta l.Ethidium derivatives bind to G-quartets,inhibit telomerase and act as flu-
orescent probes for qu ad ru plexes[J].Nucleic Acids Res,2001,29(5):1087-1096.
[69] Ren J,Ch aires J B.Preferential Binding of3,3′-Diethyloxadicarbocyanine to T riplex DNA[J].J Am Chem
Soc,2000,122(2):424-425.
[70] Borman S.Ascent of qu adrup lexes[J].Chem Eng New s,2007,85(22):12-14.
[71] New man D J.Natural products as leads to potential drug s:an old process or the new hope for drug discovery?
[J].J M ed Chem,2008,51(9):2589-2599.
[72] Kin tzios S E.T errestrial plan t-derived an ticancer agents an d plant species u sed in an ticancer research[J].Crit
Rev Plant S ci,2006,25(2):79-113.
[73] Balandrin M F,Klock e J A,W urtele E S,et al.Natu ral p lan t chemicals:sources of indus trial and medicinal
materials[J].Science,1985,228(4704):1154-1160.
[74] Pezzuto J M.Plant-derived anticancer agen ts[J].Biochem Pharmacol,1997,53(2):121-133.
[75] Koeppel F,Riou J F,Laoui A,eta l.Ethidium derivatives bind to G-quartets,inhibit telomerase and act as flu-
orescent probes for qu ad ru plexes[J].Nucleic Acids Res,2001,29(5):1087-1096.
[76] Gomez D,M ergny J L,Riou J F.Detection of telomerase inhibitors based on G-quadruplex ligands by a modi-
fied telomeric repeat am plification protocol as say[J].Cancer Res,2002,62(12):3365-3368.
[77] Rosu F,De Pauw E,Guittat L,et al.S elective interaction of ethidium derivatives with quadruplexes:an equi-
librium dialysis and electrospray ionization m as s spectrometry analysis[J].Biochemis try,2003,42(35): 10361-10371.
[78] Ladame S,Whitn ey A M,Balas ubramanian S.T argeting nu cleic acid secondary structu res with polyamides u-
sing an optimized dynamic combinatorial approach[J].A ngew Ch em Int Ed Engl,2005,44(35):5736-5739.
[79] M eiboom S,Gill D.M odified Spin-E cho M ethod fo r M easu rin g Nuclear Relaxation Times[J].Rev S ci Ins tru m,
1958,29(8):688-691.
[80] S tockman B J,Dalvit C.NM R s creening techniqu es in drug discovery and drug design[J].Prog Nucl M agn Re-
son S pectrosc,2002,41(3-4):187-231.
[81] Zhou Q,Bi Y,Xiang J,et al.Investigation on a potential targeting drug delivery system con sisting of folate,
mitoxantrone and hu man serum albumin[J].C hinese J Chem,2008,26(8):1385-1389.
[82] Zartler E R,Yan J,M o H,et a l.1D NM R M ethods in ligand-receptor interactions[J].Curr Top M ed Chem,
2003,3(1):25-37.[83] Xu Q ,S achs J R ,Wang T C ,et a l .Quantification and identification of com ponen ts in solu tion mix tu res from
1D proton NM R spectra using singular value decomposition [J ].An al Chem ,2006,78(20):7175-7185.
[84] Lep re C A ,M oore J M ,Peng J W .Theory and app lication s of NM R -based screening in ph armaceutical research
[J ].Chem Rev ,2004,104(8):3641-3676.
Applications of Nuclear Magnetic Resonance S pectroscopy
in Drug Discovery
Z HOU Qiu -ju 1,2,X I AN G J un -feng 1,TA NG Y a -lin 1*
(1.S tate Key Lab oratory for Structu ral Chemistry of Un stable and Stable Species ,Institute of Chemistry ,
Chinese Academy of S ciences ,Beijing 100190,China ;
2.Graduate University of Chinese Academy of S ciences ,Beijing ,100049,China )
A bstract :Nuclear mag netic reso nance (NM R )spectro sco py is often valued fo r its ability to shed light o n molecular structure ,but its g reatest po tential in drug discove ry proba -bly lies in the info rmatio n it can reveal about mo lecular inte ractio ns at atomic level .T he NM R parameter s of the atoms in a compound ,such as chemical shift ,diffusion coeffi -cient and relax atio n time ,are highly sensitive to the chemical environm ent surrounding them .M easuring these param eters therefo re can provide information on whether a small molecule binds to a targ et pro tein o r nucleic acid ,and w hat are the interacting parts of the small molecule and the m acrom olecular target .The NM R appro ache s can be used to validate ligand binding and /o r to identify potential lig ands in the mixtures o f co m -pounds .In the last decade ,the ability of NM R spectroscopy as a too l to monitor inter -m olecular inte ractio ns in drug disco very has been increasingly appreciated in both acade -mia and industry .In this perspective ,w e hig hlight some major applicatio ns of NM R in drug discovery in this review article ,with focus o n hit screening .
Key words :NM R ,drug discov ery ,DOS Y ,G -quadruplex ,screening methods *C orresp onding author :Tang Ya -lin ,Tel :010-********,E -m ail :tangyl @iccas .ac .cn .79
第1期 周秋菊等:
核磁共振波谱在药物发现中的应用