大肠杆菌的培养和分离学案

选修1 生物技术实践

第一部分微生物的利用——大肠杆菌的培养和分离学案

一、课标内容：进行微生物的分离和培养

三、知识要点：

1．微生物是指结构、形体的细胞、细胞或细胞结构的生物，如。绝大多数微生物与传染病无关，对人类，有多种用途。

2．细菌是单细胞的生物，从形态上分为菌、菌、菌（弧菌）。细菌结构上，有，无，只有一环状。有些细菌外有荚膜和鞭毛。有些细菌在不良的环境条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做。当环境适宜时，休眠体又可以萌发，形成一个细菌。细菌繁殖方式: 繁殖，速度很快。单个细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做。他是的重要依据。细菌在基因工程中应用广泛，可为其提供载体，也可作为细胞。细菌用革兰氏染色法分为革兰氏菌和菌两大类，区别在的成分不同。大肠杆菌是革兰氏、厌氧的肠道菌。

3．培养基按物理状态分：培养基、培养基、培养基。其中液体培养基常用于，半固体培养基可观察微生物的，固体培养基用于。细菌扩大培养要用培养基，细菌分离要用培养基。细菌的分离方法有两种：和。是消除的通用方法，也是用于高表达量菌株的最简便方法之一。划线分离法，方法；涂布分离法，单菌落，但操作。不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方，细菌，霉菌。通常细菌培养基要用和提取物来配制，还要加入一定的，以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用配制或豆芽汁即可。尽管培养基的配方各不相同，但一般都含有、、和等营养物质。另外还需要满足微生物生长对、、等的要求。如细菌需要环境，霉菌需要环境；厌氧生物需要控制含量。有的还需要在培养基中加入特殊营养物质。

4.在培养微生物时，必须进行。（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和；（2）将培养器皿、接种用具和使用前和使用后的培养基等进行；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在超净台的火焰附近旁进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。

常用的消毒方法：，常用的灭菌方法：（1）灼烧灭菌，适用于；（2）干热灭菌℃下加热，适用于；（3）灭菌：1kg/cm2、℃、 min

通常用于，如果各种器皿用此法灭菌，灭菌后放入的烘箱中烘

5.

●培养基的配置与灭菌

●倒平板

注意事项

（1）培养基灭菌后，需要冷却到℃左右时，才能用来倒平板

（2）灭菌及消毒：超净台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用消毒

（3）操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在旁操作.

（4）使锥形瓶通过灼烧，再向培养皿倒入培养基。

（5）倒入培养基后，立即将培养皿置于，并轻轻晃动，使培养基铺满底部形成。（6）平板冷凝后，要将平板 .

（7）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板不能用来培养微生物

●大肠杆菌的扩大培养

注意事项:

（1）在超净台的酒精灯火焰旁从斜面上用接种环取菌;

（2）取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌, 后方能取菌;

（3）取菌后封口膜和棉塞复原.

●大肠杆菌的划线分离

注意事项:

（1）接种环只蘸菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.操作第一步、每次划线之前及操作结束之后都需要接种环。

（2）划线首尾

（3）划线后,培养皿培养12～24h。（是因为培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落见相互影响，很难在分成单菌落，达不到分离的目的。）

涂布分离时，需要先将培养的菌液，通常稀释到10-5～10-7之间，然后去 ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的培养基上，用涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿中有的单菌落为最合适。

●大肠杆菌分离后保存

将每个菌落分别接种在斜面上，37℃培养24小时，菌落长成后置于冰箱保存。

细菌的菌落表面一般是光滑而湿润的，有黏稠性，多数透明或半透明，但也有细菌的菌落表面是干燥、有褶皱的；放线菌菌落表面是紧密的绒状、坚实多皱，长孢子后就成粉末状，菌落培养基底部和菌落表面都有不同的颜色；酵母菌落类似于细菌菌落，表面光滑而湿润，有黏稠性但大多呈乳白色，少数呈红色。

四、练习反馈

1．某学校打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各种食用菌菌种。请根据材料回答下列问题：

⑴对买来的菌种要进行扩大培养，首先需要制备培养基，写出制备LB固体培养基所需要的原料：蛋白胨、、、和。

⑵微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，配培养基时各成分要有合适的。在烧杯中加入琼脂后要不停地，防止琼脂糊底导致烧杯破裂。

⑶将配好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干个试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入中灭菌，温度为，时间为。灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到0时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应。

⑸从一支试管向另一支试管接种时注意，接种环要在酒精灯焰灭菌，并且待接种环后蘸取菌种，试管口不能离开酒精灯火焰附近，将接种的试管在适温下培养，长成菌落后放入℃冰箱中保存。

2．利用微生物分解玉米淀粉生产糖浆，具有广阔的应用前景。但现有野生菌株对淀粉的转换效率低，某同学尝试对其进行改造，以获得高效菌株。

⑴实验步骤：

①配置（固体、半固体、液体）培养基，该培养基的碳源应为。

②将接入已灭菌的培养基平板上。

③立即用适当剂量的紫外线照射，其目的是。

④菌落形成后，加入碘液，观察菌落周围培养基的颜色变化和变化范围的大小。周围出现现象的菌落即为初选菌落。

⑵分离：将初选菌落向液体培养基中接种时应注意，接种环要在酒精灯（内或外）焰灭菌，并且待接种环后蘸取菌种，防止细菌菌体死亡；菌体的分离可采用法，出现时标志着菌落已被分离。在无菌操作下，将单菌落用接种环取出，接种到斜面上，适宜温度下培养一段时间，长成菌落后放入℃冰箱中保存。

3．回答下列有关细菌培养和分离的实验

⑴在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑、和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小，结构简单、变异类型易选择、、等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。

⑵在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行（消毒、灭菌）；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能。

⑶若在涂布分离法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的。

⑷通常对获得的纯菌种还可以一句菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的。

⑸培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对固体培养基应采用的检测方法是。

⑹若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过处理后才能丢弃，防止培养物的扩散。

4.某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌（目的菌）。实验的主要步骤如图所示。请分析回答问题：

（1）培养基中加入化合物A的目的是筛选_________，这种培养基属于选择培养基。

（2）“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的__________，实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是__________。

（3）培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量_______的培养液，接入新的培养液中连续培养，使“目的菌”的数量______。

（4）转为固体培养时，常采用______的方法接种，获得单菌落后继续筛选。

（5）若研究“目的菌”的生长规律，将单个菌落进行液体培养，可采用________的方法进行计数，以时间为横坐标，以___________为纵坐标，绘制生长曲线。

（6）实验结束后，使用过的培养基应该进行______处理后，才能倒掉。