非常有用的多种凋亡方法的比较

◆TUNEL 与ELISA 检测凋亡的方法比较

TUNEL法

细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.

ELISA法测细胞凋亡

细胞凋亡时，Ca2+,Mg2+离子依赖的内源性核酸内切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断，产生单或寡合苷酸小体，各核小体的DNA与核组蛋白H2A,H2B,H3,H4形成紧密的复合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。主要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。

◆几种检测凋亡的方法

一、形态学观察方法

1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。

2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

二、DNA凝胶电泳

（一）、检测原理

细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

（二）结果判断

正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定

凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。

（一）检测步骤

1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；

2、在微定量板上吸附组蛋白体’

3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘

4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’

4、加酶的底物，测光吸收制。

（二）用途

该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。

四、流式细胞仪定量分析

（一）检测原理

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。

（二）应用价值

流式细胞仪检测具有以下特点：

1)、检测的细胞数量螅虼似浞从橙禾逑赴牡蛲鲎刺冉献既?BR>2)、可以做许多相关性分析

3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期

■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI)而呈强的红色荧光。

■DNA片断原位标记法

凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3·的羟基（－OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。

DNA片段原位标记法有二种：

1、原位缺口转移（in situ nick-translation,ISNT)技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3·－OH端

2、原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL)，即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3·-OH端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL更为合适。

■检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法

1、原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。

2、结果判断：正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。

3、应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

◆几点参考

1.大部分凋亡细胞可能并不见得有非常典型的凋亡表型，如电镜的染色体边集、凋亡小体等，DNA电泳也不见得都有DNA ladder，但对某些指标来说还算稳定，如PI染色及TUNEL法，所以如果某个方法效果不

好，可以换用其他方法检测

2.坏死与凋亡的区分传统上认为是无序与有序的过程，楼上所说的线粒体肿大也是以前的一个传统认识，但现在有很多人认为坏死的发生也是有序发生的，因此也有了程序化坏死一说，在很大程度上，由于凋亡是时间依赖性的过程，细胞发生凋亡也并非同步化的，凋亡的晚期与坏死进行区分是困难的，而且我认为如果不是对于凋亡或是坏死本身通路进行研究的话，强行区分是没有意义的

◆细胞凋亡检测技术与方法

细胞凋亡（Apoptosis），又称细胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death)，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。细胞凋亡概念提出至今还不到30年的时间，但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用，引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究，成为目前生命科学界最为热门话题之一，也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。从近年的SCI排名中我们可以看到，信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的，而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。随着这方面研究的持续升温，涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测，其中不少已经有商品化的产品出现，大大加速了研究的进程。具体来说，针对凋亡的不同阶段有以下一些方法（概括如图1）：

1．早期检测:

1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测:

PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生, 可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。

美国著名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分别开发了多种标记的Annexin V产品，简便快速，10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC，灵敏度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP与PS 的结合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的Annexin V，可通过常用的酶联显色反应来检测。另外，MACS公司将磁珠包被Annexin V，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。

2）细胞内氧化还原状态改变的检测：

这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH 公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通过荧光染料monochlorobimane(MC 体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。

正常状态下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jurcat和一些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。

由于GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。

3）细胞色素C的定位检测

细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外

膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。

ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。

4) 线粒体膜电位变化的检测：

在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。

2．晚期检测：

细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法：

1）TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）

通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接（通过地高辛）或直接接到DNA片段的3’-OH 端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中，直接标记步骤少，操作简便。而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高。

2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)

当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通过LM-PCR（ligation-mediated PCR）,连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。

3) Telemerase Detection (端粒酶检测)

这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白，它可以自身RNA 为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分别与底物及端粒重复序列配对的引物。如果待测样本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的6碱基（GGTTAG）端粒重复序列，通

过PCR反应，产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNA Ladder现象（参见图4）。此外，Intergen

公司还提供用酶联免疫法（ELISA）检测的试剂盒.

同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。

3．mRNA水平的检测

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells）等靶细胞。Bcl-2 和bcl-X (长的) 作为抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。一般多采用Northern杂交和RT-PCR走胶对它们进行检测。随着近年来荧光定量PCR技术的发展，用定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。Intergen公司的Amplifluor? Apoptosis Gene Systems就根据这一新技术原理，通过检测fas, bax-alpha 和bcl-X (长的) 基因的mRNA 表达水平来进行细胞凋亡的检测。

以上介绍了针对凋亡不同阶段特征的检测方法，随着凋亡机制研究的深入，近年来还发展了许多针对特定的凋亡途径的检测，如抗体法，酶活性测定等等，Cell Signeling technology公司，DAKO公司，Santa-Cruz 公司，Calbiochem & Oncogene公司都紧跟科研潮流，开发了大量的抗体及活性测定产品。

随着对细胞凋亡的研究和认识的不断深入，对包括肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本的细胞凋亡的检测已成为一种迫切需要。目前，多种方法已得到较广泛的应用。然而如何选择适当的方法并对检测的结果作出正确的判断及愉如其分的解释仍是值得探讨的问题。本文简要评述几种常用的细胞凋亡检测方法。

◆

一、细胞凋亡的形态学观察

细胞凋亡（apoptosis）的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般的形态学特征。目前对细胞凋亡的认识正不断得到深化，检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，但形态改变仍是确定细胞凋亡的最可靠的方法。

光学显微镜观察

凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特征的指标，具有较强的主观性，重复性差。本方法可用于调亡现象的初步观察，作为分析指标之一。

检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。

视频时差显微技术（video time-lapse microscopy）

本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观察细胞表和外形的变化。凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，特续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可养壑培养中的凋亡细胞，但不能用于病理组织。

检测方法：收集2×105细胞/ml培胞，置于多孔培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，每隔分钟30秒作序列摄影，连续24小时。如同进进行荧光染色，可参荧光晃微镜下观察和摄影。

电子显微镜观察

关于凋亡细胞的超微结构特征，包括透射电镜和扫描电镜下的改变，在许我文献中已有详尽描述。凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，在透射电镜下得到最佳的体现。为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。本方法的缺点是样品制作过程较复杂，且仪器、设备的费用昂贵，较难广泛大量开展。由于样品范围局限，在凋亡细胞数较少时需进行大量的观察才能观察到典型的凋亡改变。还应指出的是，在观察体外培养的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡小体很少见到，出现较多的是凋亡初期胞体收缩、染色质边聚和后期凋亡小体（或整个凋亡细胞）被吞噬和降解的现象。一些不典型的改变容易被忽略，在观察时要特别予以注意。

检测方法：透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。

流式细胞技术

流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光两种，前向散射光的强度与细胞大小、体积相产，右向角射光的强度与细胞结构的析射性、颗粒性（granu-larity）有关。细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性发生改变。早期凋亡细胞主要表现为前向散射光减弱而右向角散射光增强或不变，前者反映了细胞的皱缩，后者反映了细胞的核逐缩及碎裂。晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均减弱。由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱。因此，只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞。

细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡细胞。根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞。

检测方法：获取密度1×106细胞/ml左右的细胞悬液，精洗，固定，荧光染料染色，上流式细胞仪分析。

二、细胞凋亡的细胞化学测定

细胞凋亡的细胞化学测定包括细胞表面（细胞膜）的结构和通透性改变的测定和细胞核DNA改变的测定。根据应用的范围，又可分为细胞群休和单个细胞测定两种，以下仅介绍其中几种较为常用的方法。

碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测

早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI)不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。

检测方法：获取11×106细胞/ml的细胞悬液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，进行流式细胞仪分析或荧光显微镜观察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外线激发，前者荧光为红色（620nm）,后

者荧光为蓝色（480nm）。正常细胞蓝色最强。早期凋亡细胞由于DNA的漏出蓝色稍弱并有少量的红色荧光，晚期凋亡细胞红色荧光加强。坏死细胞红色荧光最强。

膜联蛋白（annexin）V标记

正常细胞的细胞膜磷脂分布是不对称的，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）位于细胞膜内侧，在细胞凋亡时转至细胞膜外表面，这一改变被认为是特导性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记。PS表面化发生于凋早期，其机制尚不清，可能是一种导致机体吞噬凋亡细胞的信号。膜联蛋白V是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力，荧光标记的膜联蛋白V与细胞表现PS结合，再用显微镜或流式细胞仪进行检测，可以观察凋亡过程中细胞膜PS的表面化。结合PI染色进行双参数检测尚能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。正常细胞膜联蛋白V（-）PI（-），早期凋亡细胞膜联蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞膜联蛋白V（+）PI（+）。有研究表明膜联蛋白V标记仅有不到三分之一的凋亡细胞出现阳性标记，其原因尚不明。同时需注意度的是凋亡后期溶解阶段，细胞碎片也可出现明显的阳性着色。

检测方法：1×106细胞/ml细胞悬液，先后用膜联蛋白V--FITC及PI染色，流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方图（cytogram），每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数在所点的组份。左下象限代表正常细胞（An-PI-）,右下象限代表早期凋亡细胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞（An+PI+）,左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞（An-PI+）。用生物素标记膜联蛋白V还可以作体内试验。将生物素标记膜联蛋白V注射小鼠体内，30分钟后处死，迅速取出要研究的组织置于甲醛内固定，然后，常规石蜡切片，脱蜡、水化，用亲和素标记的过氧化物酶程程序孵育，DAB显色，光镜下观察凋亡细胞。

DNA琼脂凝胶电泳法

细胞凋亡时，在内源性核酸内切酶的作用下，DNA在核小体间被切割成180-200bp整数倍的单或寡核苷酸片段，在电泳时表现为特征性的“梯形带”。自Wyllie把内源性核酸内切酶降解产生“梯形带”与细胞凋亡相联系以来，“梯形带”被作为细胞凋亡的一个重要的生化指标。尽管有报道指出，实验中出现典型的形态改变时可不伴有核小体间的DNA降解，对这一指标提出质疑，本方法仍被广泛应用。但此方法敏感性不高，大量凋亡细胞同时存在时才出现典型的结果，且只能被用于细胞群体，不能用于组织的原位检测。

检测方法：培养细胞清洗、离心，加入细胞裂解液裂解，高速离心，取上清液用酚/氯仿抽提二次，RNA酶消化，然后加到含溴已锭的1％-2％的琼脂糖凝胶的样品的孔中进行电泳，最后在紫外线灯下观察和摄影。DNA裂解的原位检测

在细胞水平检测DNA裂解的原位标记技术已越来越多地被用于组织切片和培养细胞，细胞凋亡时，由于DNA的裂解，形成单或寡核小体的双链相对分子质量小的片段及在相对分子质量大的DNA上形成单的继裂（缺口，nick）。此类断裂可用生物素、地高辛或荧光素标记的核苷酸在3`-OH端予以显示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脱氧核苷酸转移酶（TdT），前者使核苷酸结合于缺口，需要模板存在，标记方法通常被称为“原位缺口平移”(insitu nick translation,ISNT),后者使核苷酸在双链的断端延伸，不需要模板的存在，其方法被称为未端记（end labeling）、加尾法（tailing reaction）或TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）。上述方法，尤其是TUNEL的应用已很广泛，其优点是可用于原位标记，可用于病理组织，并可进行定量分析。值得注意的是坏死期由于内源性核酸内切酶和蛋白质酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出现阳性反应。组织或细胞外理不当时可出现假阳性。因而，TUNEL等方法对凋亡细胞的标记是选择性的。而不是特异性的，TUNEL或其他DNA裂解原位标记的分析应结合阳性细胞的形态，尤其是核的特征，细胞的分布和有无炎症反应，除外非凋亡的阳性反应。

检测方法：石蜡切片常规脱蜡、水化，蛋白质酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，显色（辣根过氧化物酶标记可用DAB显色，碱性磷酸酶标可用NBT+BCIP显色），复染，脱水，封片。凋亡细胞核呈现蓝色（NBT+BCIP显色）或者棕黄色（DAB显色）。

凋亡蛋白质酶（Caspase）-3及其底物的检测

凋亡蛋白质酶是一类半胱氨酸蛋白质酶，具有特异性水解底物分子天冬氨酸（Asp）残七C端肽键功能，是近年随着调亡研究的深入而发现的重要凋亡分子。迄今已有13个分子得到命名，分别为凋亡蛋白质酶1-13。基中凋亡蛋白质-3是被认为在多种组织、细胞类型中最常涉及的凋亡效应分子。活化的凋亡蛋白质酶-3仅在凋亡细胞中发现，因此，检测凋亡蛋白质酶-3的活性有助于发现早期的凋亡细胞。一般采用人工合成四肽荧光底物如DEVD-AMC，凋亡蛋白质酶-3在D与AMC之间水解，释放荧光物质、AMC，后者在紫外线激发下发出波长为430-460nm的荧光，通过流式细胞仪或分光光度计对其强度进行定量，从而测定凋亡蛋白质酶-3的活性。由于醛对凋亡蛋白质酶-3的水解活性抑制作用，因此同时加入含醛四肽如DEVD-CHO可以抑制凋亡蛋白质酶-3对DEVD-AMC的水解，不产生荧光。这样的抑制试验可作为对照，使凋亡蛋白质酶-3的活性分析更有特异性。但是，上述方法不适用于组只切片，因此有人尝试采用针对活化的凋亡蛋白质酶-3亚基的抗体，通过免疫组化显示凋亡细胞，然而其敏感性及特异性尚不能令人满意。

检测方法：培养细胞（也可以预先作凋亡诱导并在不同时段收集细胞）在裂解液内裂解、离心、去上清液。加入凋亡蛋白质酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育，同时用不加底物的样品作对照，流式细胞仪检测，加有底物的样品释放出的荧光强度样对照样品明显增强。如加入DEVD-AMC时再加入DEVD-CHO，样品释放的荧光强度与对照样品无差异。

凋亡蛋白质酶-3导致细胞凋亡是通过水解或灭活一些细胞关键蛋白质实现的，因此检测凋亡蛋白质酶-3底物的改变也有助于辨认细胞的凋亡。PARP是第一个被认识的凋亡蛋白质酶-3底物，它的相对分子质量为116000，水解后形成相对分子质量为85000及相对分子质量为25000的两个片段，用运载相对分子质量为85000片段的抗体可以观察细胞是否发生凋亡。细胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白质酶-3水解后，在其C端的第387-396位氨基酸残基形成一个新的抗原表位，用抗此表位的抗体可以在组织切片上辨认凋亡细胞。另外一种细胞骨架蛋白质肌动蛋白（actin）被水解后产生一种称为“fractin”的片段，在凋亡早期出现，并认为与细胞膜的起泡有关，可能有助于早期凋亡细胞的辨认。总之，随着对凋亡蛋白质酶及其底物的进一步研究，将会发现更有价值的有助于检测凋亡细胞的方法。

三、展望

除了以上介绍的几种较常用检测细胞凋亡的方尖，还有一些尚未被列入的检测方法，新的方法正将出现。尽管用于检测细胞凋亡的方法较多，但形态学观察，尤其是透射电镜观察仍具有不可替代的作用，只是其应用受到一定限制。在细胞化学检测方法中，迄今没有任何一种方法具有足够的敏感性和特异性，尤其在病理组织中要作出准确定量分析仍较为因难。在目前情况下标本和病变的特点，选择多种适当的方法进行综合检测，常可行到较准确结果，同样重要的是，要充分理解各种方法的原理及应范围，并对结果作出合理的分析和判断。随着对细胞凋亡认识的深化和有关技术的进展，期待更敏感、更特异的方法面世，这对于病理状态（包括肿瘤）中细胞凋亡的研究将具有重要意义。

◆有关细胞爬片

1. 处理细胞爬片：用灭菌的去离子水将多聚赖氨酸配成0.1mg/ml,处理载玻片过夜即可。用前再用去离子水漂洗一次，就可直接接种细胞！

2. 热疗对细胞内热休克蛋白70的诱导

陈必良1，安晓汾2，辛晓燕1，王德堂1，郭慧玲1（1第四军医大学西京医院妇产科，

陕西西安710032；2第四军医大学吉林军医学院附属医院妇产科，吉林省吉林市，132011）

【摘要】目的探讨肿瘤细胞（以人卵巢癌细胞为例）在受热不同时间、不同间隔后细胞内热休克蛋白70表达的异同；明确人卵巢癌细胞对热耐受的敏感程度。方法体外培养人卵巢癌细胞HO-8910，制成细胞爬片。加热温度设为42℃，实验分成两部分：①加热时间分别设为15、30、60、90、120、150min，加热后立即固定细胞；②将细胞加热120 min后，置于37℃细胞培养箱中复温不同时间，收集复温后1h、4h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h后的细胞爬片固定。然后将两组细胞爬片行HSP70的免疫组化染色，观察热疗前后HSP70的不同表达。结果未加热细胞仅有少量HSP70的表达，随加热时间延长，HSP70的表达逐渐增多；加热后不同间隔HSP70的表达不同，间隔6 h HSP70的表达最强，随后逐渐减少，5-6天后，恢复至未加热状态。结论①温和加热时间过长可诱导HSP70的大量产生，从而使肿瘤细胞对热疗产生热耐受作用; ②卵巢癌HO-8910细胞对加热有较强的耐受性。

关键词：热休克蛋白70；免疫组织化学；热耐受；卵巢癌；

随着科学技术和医学科学的发展，对癌症的诊断和治疗有了长足的进步。高温治疗也称热疗（hyperthermia，HT，又叫温热疗法）,以其无手术痛苦、无术后并发症及无化疗及放疗带来的副反应而发展成为癌症治疗的有一种有效方法[1]。高温可导致肿瘤细胞死亡或者生长抑制，同时高温还可提高肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性，因为肿瘤细胞对于高温的敏感性明显高于正常细胞。但在应用过程中也发现，随热疗重复次数的增加，热疗效果反而下降，会出现所谓“热耐受（thermotolerance）”现象，即第1次加温可影响第2次加温的生物学效应。这说明在热疗过程中，肿瘤细胞内生成了某些物质可降低其对热的敏感性。研究表明[2]，该现象与热休克蛋白家族尤其与热休克蛋白70（HSP70）的关系密切。本研究利用人卵巢癌细胞HO-8910受热后进行HSP70免疫组化染色，以了解在该细胞中HSP70的表达与加热之间的关系。

1 材料和方法

1.1 材料人卵巢癌细胞系HO-8910为分化差的卵巢浆液性囊腺癌细胞，由第四军医大学西京医院实验室提供。HSP70成套免疫组化试剂盒（产品编号SA2077）及DAB显色试剂盒（产品编号ED1022）均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 加热处理将细胞接种于含热灭活的15%小牛血清及双抗的RPMI1640 (Gibco BRL,USA) 培养液中，常规培养。取对数生长期的细胞，经0.25%胰酶消化后制成细胞悬液，细胞密度为1×105/ml。将

1cm×1cm 大小的盖玻片置于24孔板中，每孔加入1ml的细胞悬液，制成细胞爬片。12 h后，将24孔板置于42℃培养箱中分别进行两种实验处理：①加热时间分别设6个时间点，即15、30、60、90、120和150 min，加热后的细胞即刻用0.01M PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定细胞40 min，制成细胞爬片后置于4℃冰箱中保存备用；②将细胞加热120 min后，置于37℃细胞培养箱中复温不同时间，收集复温后1、4、6、12、24、48、72、96、120及144 h后的细胞爬片按照上述步骤处理细胞固定后备用。

1.2.2 HSP70表达的免疫组化染色检测将细胞爬片置于3% H2O2中室温孵育10 min，以蒸馏水洗涤后次滴加正常山羊血清封闭液室温放置20 min、滴加小鼠抗HSP70的抗体37℃1 h、滴加二抗及试剂SABC 室温下各放置20 min，最后以DAB显色, 染色时间统一设为5 min后终止。再经苏木素轻度复染、常规脱水、透明和封片后，于显微镜下观察并照相。阳性细胞胞浆/胞核染成棕黄色。

1.2.3 统计学处理采用等级资料的秩和检验

2 结果

①在42℃条件下，加热不同时间，卵巢癌细胞HO-8910细胞内HSP70的表达见表1。未加热的细胞内(见图1A), 有少量的HSP70表达，表现为胞浆内有极淡的淡黄染色；当42℃加温15 min时，细胞内HSP70的表达与正常细胞相比较无明显改变；加热30 min后(见图1 ，可见胞浆内HSP70的染色略增强，但颜色仍较淡，仅限于胞浆，但胞浆染色数量增加；无胞核染色；加温60 min时(见图1C)，可见胞浆内HSP70

的表达增强，表现为胞浆染色加深呈深黄色，染色细胞接近100%，但未见核染色；加温90 min时(见图1D)，胞浆内染色进一步加强呈棕黄色，偶尔可见核染色；加温120 min时(见图1E)，胞浆内染色表现为明显的棕黄色，核染色的细胞增多；加温150 min时(见图1F)，胞浆内呈深棕黄色，核染色细胞数进一步增多。

表1 HO-8910细胞温和加热不同时间的免疫组化染色

组别例数染色分级胞浆染色的细胞数核染色的细胞数

第一组10 Ⅰ（淡黄色）40%～50% 0

第二组15 Ⅰ（淡黄色）40%～50% 0

第三组20 Ⅰ（淡黄色）80%～90% 0

第四组20 Ⅱ（深黄色）100% 0

第五组20 Ⅲ（棕黄色）100% 5%

第六组20 Ⅲ（棕黄色）100% 10%～15%

第七组20 Ⅳ（深棕黄色）100% 20%～30%

※P<0.05

注：①第一组为未加热细胞；第二组为42℃加热15 min；第三组为42℃加热30 min；第四组为42℃加热

60 min；第五组为42℃加热90min；第六组为42℃加热120min；第七组为42℃加热120min

②免疫组化细胞染色分级标准——淡黄色Ⅰ级；深黄色Ⅱ级；棕黄色Ⅲ级；深棕黄色Ⅳ级

②HO-8910细胞加热120 min后，间隔不同时间进行免疫组化染色，结果表明, 加热后1 h，细胞染色呈深棕黄色仍保持强阳性（Ⅳ级），未见明显淡化；加热后4 h（见图2A），在所有染色的细胞爬片中，细胞染色表现为最强Ⅳ级，核染色的细胞约占50%；加热后6 h，几乎维持原水平；加热后12 h，可见胞浆染色有所淡化呈Ⅲ级棕黄色，但核染色未见明显减少(见图2 ；加热后24 h，染色程度呈Ⅲ级，染色细胞数量仍保持100%，但胞核染色明显减少，(见图2C)；加热后48 h，核染色全部消失，胞浆染色明显变淡呈Ⅱ级深黄色(见图2D)；72 h后，HSP70的表达进一步减少，细胞染色呈黄色（图2E），随后，细胞染色每隔24 h即有明显淡化趋势，120 h后，细胞恢复至正常状态。

3 讨论

肿瘤热疗学是近20年来迅速发展起来的一门新兴学科，为肿瘤患者的治疗带来了一线生机[3]。在临床应用过程中，发现肿瘤细胞可出现对热的耐受现象，尤其是当加热温度低于43℃（温和热疗）或加热时间过长时，更易发生热耐受[4]。热耐受不是细胞固有的特性、不遗传，是一种暂时现象，可能是热疗过程中肿瘤细胞产生的某些物质降低了其对热的敏感性。研究表明，肿瘤细胞在热应激发生后，最根本的变化是蛋白质谱的改变，表现为合成了一组特殊的高度保守的蛋白质——HSP或称为应激蛋白[5]，而正常蛋白质合成却被抑制。HSP是高热诱导的一种适应性蛋白，属于一种分子伴侣，主要功能在于当细胞处于应激状态时，可纠正新合成蛋白质的折叠和空间构象错误，协助转运蛋白质，抵抗应激原引起的变性，维持生理平衡，从而降低高热诱导的细胞凋亡[6]。HSP70在HSP家族的众多成员中,是最出色的热耐受预测因子[7]。加热过程中，伴随HSP70水平的升高，正常蛋白质的合成受到不同程度的抑制。加温后半小时无蛋白质的合成，随着HSP70的产生，蛋白质的生物合成逐渐恢复，肿瘤细胞的自我保护机制开始启动，从而引起肿瘤细胞对热的敏感性下降。

卵巢癌是威胁女性健康的生殖器三大恶性肿瘤之一，死亡率高，5年生存率不到50%。由于耐药及抵抗放疗效果的肿瘤细胞出现，为卵巢癌的治疗带来了新问题。随着热疗学理论的日趋成熟，已有研究将其应用于卵巢癌的临床治疗[8]。为了更好的将这一理论应用于临床，有必要了解卵巢癌细胞对热疗的敏感性。本实验结果表明：①人卵巢癌细胞HO-8910在未加热状态下，即有少量的HSP70表达，当给予温和加热（即加热温度为42℃）时，短时间内，诱导产生的HSP70未见明显增加。加热时间≥60 min后，尤其是加热时间超过120 min后，HSP70的表达明显增加，表现为随加热时间的延长而胞浆的染色加深，而且核染色阳性的细胞数量明显增多，这一结果表明细胞的热耐受已启动。②当细胞受热120 min后，停止加热，在最初的几个小时内（1～4 h），HSP70的表达保持加热当时的水平，4 h后，HSP70的生成达高峰，表

现为染色程度最强，核染色细胞数量最多，说明此时细胞对热的敏感性最差。如再次加热，高温对该细胞的细胞毒作用最低。此后，随着时间的推移，HSP70的表达明显减少，5～6 d后恢复至正常水平。从实验结果还可看出，卵巢癌细胞HO-8910 对HSP70的表达有一定的时间依赖性，这也是临床上肿瘤热疗间隔需3～4 d的原因之一。此外，虽然可通过提高加热温度来减少HSP70的表达，但毕竟39℃～42℃的温度对于人体来说是能够承受的温度，因而，可考虑通过抑制热疗过程中HSP的生成而提高热疗的效率，国外已有相关的文献报道[9]。

一般而言，肿瘤细胞受热温度偏低，时间越长，越易形成热耐受[10]。人卵巢癌细胞HO-8910细胞在受热60 min后，就已有明显的HSP70的表达，而该细胞的恢复过程时间却长达5～6 d，这就提示我们肿瘤细胞对加热有一定程度的耐受性，而且热耐受因细胞不同而有不同的表现[11]，因此，在临床应用过程中需要考虑到这一要素。

◆细胞坏死与细胞凋亡

细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。

一、细胞凋亡的形态学检测

根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。

1 光学显微镜和倒置显微镜

（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。

贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割

成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。

结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。

3 透射电子显微镜观察

结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

方法

1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

结果[图4、图5]

注意事项

1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。

三、线粒体膜势能的检测

线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，

3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。

注意事项

1．始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。

2．与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。

四、DNA片断化检测

细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

1. 大分子染色体DNA片段的测定

细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。因此，细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向

前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量大小分开。

参考文献Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

2．DNA Ladder 测定

方法：收获细胞（1′107）沉淀?细胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，

2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4°C过夜?14000rpm′15min?最后将沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer?1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色并照相。

结果：[图6]

参考文献Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

3．凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析

方法：收集细胞?70%冷乙醇（in PBS）4°C固定过夜?PBS洗涤，1000rpm′10min?RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min?PI（50mg/ml）染色，室温避光15min?FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。

结果：[图7]

4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)

优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。

五TUNEL法

细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

六、Caspase-3活性的检测

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly （ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

方法：

收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T （含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→TBS-T洗3次，5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。

结果：[图8-1、图8-2]

2 荧光分光光度计分析

原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。

方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）?37°C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。

结果：[图9]

3 流式细胞术分析

方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?加Ac-DEVD-AMC?37°C反应1h?UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。

结果：[图10]

七、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。

（一）TFAR19蛋白的细胞定位分析

材料试剂：

FITC标记的单克隆抗体，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip头，移液器。

仪器：低温水平离心机, 37°C水浴箱，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜，流式细胞计

方法：

1 悬浮细胞的染色：

（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。

（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。

（5）加入5ml FITC标记的TFAR19单抗（终浓度为1：40），4°C反应30min

（6）荧光细胞洗液洗2次，1000rpm′10min。

结果观察：将细胞沉淀滴片，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。[图11]

2：贴壁细胞的原位染色

（1）贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。

（2）将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。

（3）将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描

显微

镜观察TFAR19在细胞中的定位。

结果观察：[图12]

3：临床病理切片的染色、检测。

4：原代细胞的培养、检测。

5：分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的分布及定位

（二）TFAR19蛋白的表达与临床疾病

1．ELISA法检测正常人和疾病状态下，以及疾病的不同时期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平。

材料和试剂：

1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer

2. 洗涤液：pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20

3. 封闭液：3%BSA（用洗涤液配制）

4. 酶标抗体的稀释：用封闭液稀释

5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g

柠檬酸0.51g

DDW 100ml

6. 显色液（现配现用）：底物Buffer 10ml

OPD 2mg

30% H2O2 2ml

7. 终止液2Mol/L H2SO48. 重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA Reader（OD490nm），洗板机

操作步骤

1. 用包被Buffer稀释的重组人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C 过夜（一般24h以上）。

2. 洗涤Buffer洗板三次，加入封闭液，200 ml/well ，37°C孵育2h或4°C

过夜。

3. 洗涤Buffer洗板三次，加入不同稀释度的病人血清（3个重复孔）100ml/well ，37°C孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对照。

4. 洗涤Buffer洗板三次，加入1：2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。

5. 洗涤Buffer洗板三次，加入显色液，100 ml/well，避光反应10~15min。

6. 加入H2SO4终止反应，50 ml/well。

7. ELISA Reader 读取OD490 光密度值，分析和比较病人血清和正常血清中TFAR19自身抗体的表达水平。

2．Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表达水平。

◆细胞凋亡与肝病（一篇综述）

摘要：细胞凋亡是能量依赖的细胞内死亡程序活化而致的细胞自杀。细胞凋亡偏重于凋亡小体的形态学的变化过程，并且可见于许多非生理状态，如疾病所引起的细胞凋亡和抗癌药物所引起的癌细胞死亡等，而程序性细胞死亡则偏重于其分子生物学和生理性功能，一般指生理性死亡。近年来有关肝病凋亡的论文发表量日益增多，本文就此进行综述。

一、细胞凋亡的特征和检测方法

细胞凋亡在形态学上有四大特征：1）、细胞变圆，2）、胞浆起泡，3）、核固缩，4）、凋亡小体形成。形态学观察到凋亡小体是细胞凋亡的金标准，但此法并不敏感。（1）琼脂糖凝胶电泳对凋亡细胞基因组进行分析发现其DNA片段呈180-200bp的阶梯状的电泳条带。检测出这种典型的电泳条带是细胞凋亡的可

靠指标。（2）近年来用于检测细胞凋亡的技术还有TUNEL 法，通常认为其对细胞凋亡数量的估计过高。（3）因此在研究细胞凋亡时应尽可能的做琼脂糖凝胶电泳作为对照。另外还有流式细胞仪法测凋亡细胞峰法，通常认为它可以测定细胞凋亡的数量，并能够将坏死细胞、活细胞区分开来，是一种比较好的检测方法。可进行定量半定量的分析。（4）

在肝脏凋亡小体被认为就是Councilman 小体、嗜酸性小体和固缩坏死。（5）并且发现肝脏凋亡发生迅速，可在几分钟、几小时内完成。通常凋亡细胞的清除是一个不伴有炎症的过程，因为细胞内的内容物被膜包

裹形成凋亡小体而被枯否细胞、临近的肝细胞清除，细胞内的酶不外溢。这通常是对的，然而肝细胞的凋

亡并非人们所想象的那样隐蔽而不容易被发现，在肝细胞的凋亡过程中可以检测到细胞内酶，并且当凋亡

的肝细胞的数量超过肝组织的清除能力时，组织结构的丢失将会发生炎症，因此细胞凋亡在过去认为由细

胞坏死触发的许多疾病中可能起重要作用。（6）

二、细胞凋亡的机制

在凋亡的过程中，凋亡启动阶段可以与凋亡执行阶段区分开来，在执行阶段Caspases( 一组新的特异性水解底物天冬氨酸残基的半胱氨酸蛋白酶家族)，可以依次激活来水解细胞和裂解一些关键的蛋白。Caspases 通常以酶原Procaspases的形式存在于细胞胞浆内，需要蛋白酶先将其裂解为有功能的蛋白酶的形式才可

发挥作用。并且现在认为Procaspases具有Caspases的活性，但其活性较Caspases为低。如Procaspase-8具有活化Caspase-8 1%~2%的活性。所以Procaspase-8相互聚集时可以自我激活或相互激活为Caspase-8。Procaspases的相互聚集可由结合调节分子介导,如CARDs(caspases recruitment domains) 和DEDs(death effector domains)，CARDs和DEDs与Fas 和p75NGF 受体死亡区域具有相似的结构（6个折叠闭环，两歧性反向平行的α螺旋）。因此Procaspases可以相互聚集形成“apoptosome”来激活Caspases。之后Caspases可将蛋白从天冬氨酸盐羟基端一分为二。同时Caspases自身也是通过对其天冬氨酸残基进行裂

解而激活。通常认为Caspases是通过其他的Caspases的裂解而激活。Caspases激活Caspases的过程会

导致Caspases的级联放大反应。Caspases(-3，-6，-7)被认为是Caspases中下游的Caspases，并且是分

解底物的关键酶，是细胞凋亡的执行者。近来已发现两条激活Caspases的通路。一条涉及到死亡因子和死亡受体，另一条与线粒体功能障碍有关。(7)

死亡受体是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族的成员。到目前为止共发现8种死亡受体，其中TNF受体1（TNF receptor-1,TNF-R1）和Fas（又称CD95/APO-1）白被研究的最多，它们均通过其

配体而被激活起作用。Fas和TNF-α可以动员细胞内不同的死亡复合体伴随的调节蛋白和procaspases 而活化死亡复合体，然后由死亡复合体激活一系列的上游Caspases，最主要的是Caspase-8,由它激活下游的Caspases 蛋白酶来执行促使细胞凋亡的作用。(7、8)

在第二条通路，细胞应激可以促发细胞色素C从线粒体上脱落，这通常可能是通过线粒体内膜的通透性改变而介导的。脱落的细胞色素C与Apaf-1结合后而激活Caspase-9, Caspase-9然后激活下游的Caspases 执行促使细胞凋亡的作用。(7)近来的资料表明线粒体和死亡复合体可以通过Bid蛋白联系起来，Caspase-8激活Bid蛋白，Bid蛋白随后可以诱导线粒体释放细胞色素C。Bid 蛋白是Bcl-2家族的一员。目前还发现

其它几种胞浆蛋白参与细胞凋亡的调节，主要是Bcl-2的家族成员。目前在哺乳动物中已鉴定出至少１５

种Bcl-2蛋白。它们可以分成两大类：促进细胞凋亡的，如Bax、Bak、Bok Bcl-xS、Bag、Bid、Hrk、BNIP3、BimL、EGL、Blk和Bad；抑制细胞凋亡的，如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、Bfl-1、Brg-1、和A1。(9,10)促进和抑制细胞凋亡的Bcl-2家族成员能结伴形成同源或异源二聚体。抗细胞凋亡的Bcl-2家族成员可以与线粒体结合抑制其释放细胞色素C，发挥抗细胞凋亡的作用。(11)已有的研究表明当Bcl-2/Bax>Bax/Bax 时，细胞趋向于存活，当Bcl-2/Bax〈Bax/Bax时，细胞趋向于凋亡。尽管Bcl-2家族成员在调节凋亡中的

确切作用不十分清楚，但Bcl-2家族之间的相互平衡最终决定凋亡刺激因素是否导致细胞发生死亡。(1) 三、细胞凋亡在肝病发病中的作用

１酒精性肝病

到目前为止仅有有限的关于细胞凋亡在酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）发病中作用的报导。但是细胞凋亡在ALD发病中的作用却日益明朗化。事实上凋亡在ALD中的表现形式是嗜酸性小体，而且凋亡的标志物和Mallory小体可以在ALD 的肝细胞中同时观察到，提示这些细胞在组织中是通过凋亡的形式被清除的。同时在实验性ALD也可发现肝细胞凋亡，长期给予酒精的小鼠肝细胞内可见凋亡小体的数量明显增多，主要集中在肝小叶中央静脉末端的周围，这些病变在终止酒精给予后可逆。另一研究表明伴有肝损伤（如脂肪肝或肝炎症侵润）的酒精饲养大鼠肝细胞凋亡细胞数量增加。潜在的肝病理状态，使肝细胞更易于发生酒精诱导的肝细胞凋亡，这在肝铁超负荷时可以见到，而肝铁超负荷可见于许多酒精性肝病患者。在一个研究肝铁影响的大鼠模型中，在这些动物中凋亡细胞的数量超过了肝铁储积的作用，提示尚有其它的途径参与肝细胞凋亡。

酒精导致得肝损伤被认为与氧化应激导致的活性氧中间产物有关。在急性酒精中毒导致谷胱甘肽缺乏的大鼠模型中可见到许多凋亡的肝细胞。伴随着氧化应激在酒精导致得肝损伤中的作用，抗氧化剂在同一动物模型中可以减少凋亡细胞的数量。活性氧中间产物和脂质过氧化的形成被认为与细胞色素P450

2E1(CYP2E1)有关，而CYP2E1在肝细胞内大量表达。在导入CYP2E1表达的肝细胞中，由活性氧中间产物介导的脂质过氧化和随后在那些富含花生四烯酸的肝细胞中可见到细胞凋亡。同样通过导入Bcl-2可以阻止由CYP2E1介导的肝细胞凋亡。另一研究在有明显炎症和脂质过氧化的实验性ALD模型中发现Bcl-2 蛋白表达增加。因此肝细胞通过表达抗凋亡的Bcl-2蛋白可能是其抵抗酒精诱导的肝损伤的一种保护机制。氧化应激也被认为与Fas系统相关，在酒精性肝损伤的病人中，肝细胞Fas配体mRNA转录增多，体内Fas 配体可能是由活性氧中间产物诱导产生的。由于肝细胞可表达Fas受体，这些发现提示肝细胞可能通过旁分泌或自分泌的机制来介导自身的死亡。这种由酒精诱导肝损伤的潜在尚未完全阐明的重要机制被称为“fractricide”.

其它的几种细胞因子也可以参与酒精导致的细胞凋亡。纤维原性生长因子，转化生长因子(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)可诱导培养的肝细胞发生凋亡，在ALD的进展中可能具有双重作用：1）促进纤维化，2）通过凋亡杀死细胞。另外TNF-α1活性在临床ALD病人中和实验性ALD大鼠的肝细胞中表达均增强。慢性酒精消耗也可使肝细胞TNF-α1表达增加。总之，在慢性酒精消耗TNF-α1表达上调使肝细胞易于发生由这些细胞因子诱导的细胞凋亡，提示TNF-α1在ALD发病的病理生理中其重要作用。( 以上参考文献2，6，12，13，14，15，16，17)

2 病毒性肝炎

研究表明肝细胞凋亡在病毒性肝炎中起重要作用。病理形态学研究表明人肝炎中的确存在死亡的凋亡细胞，事实上在病毒性肝炎中可以经常观察到肝细胞以凋亡的行式被清除掉，病毒感染伴随凋亡被认为是由细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic Tlymphocyte，CTL）作用的结果。CTL在识别病毒抗原是诱导自身表达Fas 配体，并与靶细胞表面的Fas结合，启动凋亡信号，活化细胞死亡程序，使细胞死亡。已有的资料提示有几种不同的凋亡通路参与了肝细胞的凋亡，包括Fas系统、TNF-α系统、Perforin/Granzyme系统。

对于细胞凋亡在病毒性肝炎中的作用仅有有限的资料。小样本的资料研究表明在三例爆发性乙型病毒性肝炎中Fas蛋白表达增多。TUNEL分析表明大多数肝细胞呈阳性，提示Fas系统介导的凋亡参与急性肝炎的发病。

HBV和HCV是慢性肝病的主要致病因素。这些病毒感染使肝细胞易于发生凋亡，也可以通过model和病毒蛋白抑制凋亡。例如在小鼠肝细胞系中，TNF-α只能诱导高度表达HBV的肝细胞发生广泛的凋亡。感染HBV的肝细胞对促进凋亡因素的敏感性增高被认为与HBV的X-基因产物有关；同样HCV感染的肝细胞，HCV的病毒核心蛋白可以与TNF-αR1的胞浆内区域结合，这种相互作用在小鼠和人肝细胞株均可通过TNF 信号转导系统介导而促进肝细胞凋亡。HBV、HCV感染肝细胞凋亡的敏感性增高的机制是不十分清楚的，但可能与TNF-αR1表达上调无关。为了完成自身的复制和阻止感染的肝细胞被清除，病毒同时发展了阻止凋亡的机制，这可以从HCV的NS3蛋白可抑制放线菌素诱导的肝细胞凋亡中得到例证。病毒蛋白对凋亡的总体作用似乎与凋望刺激物、细胞内容物和不同的病毒蛋白表达的相对水平有关。

目前的临床研究资料提示在HBV和HCV感染的肝细胞中有免疫介导的凋亡途径激活。在慢性HCV感染的40位病人的肝组织中用免疫组化的方法研究发现其Fas 和HCV核心蛋白抗原的表达明显高于健康者。在慢性HBV感染的病人也可以观察到其Fas系统激活，并且Fas不但在肝细胞中高度表达，而且在分子水平上上调。有趣的是Fas mRNA主要在淋巴细胞浸润的区域被发现，这也支持CTL介导感染肝细胞通过Fas 系统发生凋亡。因此人们推测以凋亡的形式清除肝细胞可能是：1）感染了肝炎病毒的肝细胞表面除了病毒抗原和MHCⅠ类抗原外，Fas表达也增多。2）肝炎病毒抗原和MHCⅠ类抗原与CTL表面的T细胞受体结合，活化CTL诱导其表达Fas配体。3）表达于CTL表面的Fas配体与肝细胞表面的Fas结合，传导死亡信号，激活caspases 等使肝细胞死亡。（以上参考文献2，6，12，14，17，18，19，20）

3 胆汁淤滞性肝病

在许多临床综合征中可以观察到胆汁淤滞，胆汁淤滞是一组慢性进行肝病的主要特征，并可最终导致肝硬化、肝衰竭和死亡。肝内疏水的毒性胆盐储滞长期以来被认为是肝损伤的一个主要原因，并被认为是胆汁淤滞性肝病肝损伤的一个关键原因。事实上肝内毒性胆盐：鹅脱氧胆酸和脱氧胆酸盐的储滞水平与肝损伤的程度呈正相关。在大多数胆汁淤滞性肝病中广泛的坏死并不常见，因此细胞凋亡介导的肝细胞死亡在胆汁淤滞性肝病中远较细胞坏死为常见。如在原发性胆管性肝硬化的病人肝组织中凋亡的特征较对照组为明显。毒性胆盐诱发的凋亡近年来已被部分阐明。毒性胆盐可诱导培养的啮齿类动物肝细胞发生凋亡，这可能是由非Fas配体依赖性途径激活裂解激活Caspases-8，然后由其激活下游的Caspases导致肝细胞死亡。组织蛋白酶B（一种胱氨酸蛋白酶）在这种凋亡中起重要的作用，实际上胱氨酸蛋白酶被激活后被转运到细胞核内作为毒性胆盐导致的细胞凋亡的效应物而起作用。毒性胆盐诱导的细胞凋亡同时需要蛋白激酶C 的激活和转位，使细胞内的镁离子增多，激活镁依赖性核酸内切酶降解DNA。然而非毒性的疏水胆盐：熊去氧胆酸和一种毒性胆盐同时加入培养的肝细胞内，死亡的肝细胞减少。所以认为熊去氧胆酸有抗凋亡的作用，这可能与其降低线粒体的通透性有关。因此抗凋亡作用可能是熊去氧胆酸在胆汁淤滞性肝病中发挥治疗作用的重要机制。

对于Bcl-2在抗毒性胆盐诱导的肝细胞凋亡的作用，已有人用胆道结扎的方法作为胆汁淤积的模型进行研究，正常情况下肝细胞并不表达Bcl-2。然而在胆道结扎的小鼠中，可发现Bcl-2表达，提示这是肝细胞的一种适应性机制来抵抗毒性胆盐导致的细胞凋亡。在于胆汁分泌直接相关的胆管细胞中可发现Bcl-2的表达，进一步支持这一看法。在原发性胆管性肝硬化病人的肝组织中也可发现Bcl-2表达。具有抗凋亡作用的Bcl-2表达被认为可以阻止毒性胆盐介导的肝损伤。（以上参考文献2，6，12，14，18，19）

4 肝细胞肿瘤

上述所提到的肝病有一个共同的特点，既细胞凋亡的数量与正常对照组相比均提高，从而导致肝损伤。而在肝细胞肿瘤（hepatocelleular carcinoma，HCC）形成中损伤DNA和恶性细胞凋亡不足被认为是一个决定性因素。研究表明在HCC多步形成机制中凋亡不足起重要的作用。有人分析22例HCC病人肝细胞发现Fas表达部分或全部缺失，而在健康的肝组织中可表达。另一研究表明Fas与HCC的分化程度有关：在低分化、门脉肿瘤栓塞、肝外浸润的HCC中，Fas表达明显降低，这些结果均支持Fas表达缺失是恶性肿瘤细胞逃避CTL细胞杀伤和促进其生存的一条重要途径。另一研究在给于不同的化疗药物治疗后均有P-53依赖性Fas表达上调导致的肝肿瘤细胞的凋亡增加,并且呈剂量依赖性。

TGF-β1介导的细胞凋亡异常被认为是HCC 形成的又一重要的细胞因子。如前所述TGF-β1能够诱导正常肝细胞发生凋亡。TGF-β1的信号转导涉及两种不同的受体：1型和2型。TGF-β1选择性的与2型受体结合，之后与1型受体形成复合物，激活下游的的信号传导。在HCC病人1型、2型受体mRNA转录水平均明显降低，导致细胞凋亡异常。另一项研究提示尽管在HCC病人的肝细胞中有2型受体的表达，但弥散分布在胞浆内，在细胞膜上不能检测到。这些研究均提示肝细胞膜上TGF-β2型受体的表达缺陷是肿瘤细胞逃避TGF-β1介导的细胞凋亡而增殖的原因。

HCC的肝细胞凋亡数与P53蛋白的表达水平呈正相关，支持P53在肿瘤性肝损伤中参与肿瘤细胞凋亡。P53蛋白是一种肿瘤抑制基因，而其表达的P53蛋白是细胞DNA损伤后修复所不可少的。如果DNA不能修复，P53便诱导肿瘤细胞发生凋亡。因此P53的功能不良使肿瘤细胞可逃避凋亡而不断增殖。（以上参考文献

2，6，12，14，17，20，22，23，24。）

总之由以上分析可见，细胞凋亡在肝病发病的病理生理中起重要作用。细胞凋亡的增多涉及许多不同的介导因子，如Fas、TNF- α、TNF-β1和Bcl-2家族在许多不同的肝损伤中均可发挥作用，这些疾病包括病毒性肝炎、胆汁淤滞性肝病和酒精性肝病。在这些疾病中凋亡的减少可能是有益的，并是未来药物发展的方向。在另一方面，凋亡的调节异常使恶性的肝肿瘤细胞可避免被杀伤。对于HCC的预防和治疗来说特异地诱导肿瘤细胞凋亡是一个新的有价值的选择。

分数的大小比较教学设计

分数的大小比较教学设计 教学内容：西南师大版五年级下册一单元二小节《分数大小的比较》 教学目标： 1.使学生掌握分母相同或分子相同的两个分数大小比较的方法,进一步加深对分数意义的理解,培养学的发散思维能力。 2.鼓励学生从不同角度思考问题，培养学生动手操作，观察比较和概括的能力。 3.通过学生的独立、合作探究,培养学生独立思考,勇于探究的精神,培养学生的合作意识,创新精神和初步的创新能力. 过程与方法： 1.让学生在探索活动中理解并掌握比较分母相同或分子相同的两个分数大小的方法。 2.通过日常生活中的例子来引入新知识。 教学重点：分母相同或分子相同的两个分数大小比较的方法。 教学难点：会用不同的方法解决问题，能运用分数的意义、分数单位等知识说明算理。 教 具： 多媒体课件，图片 学 具： 两张同样大小的纸，分数小圆片。 教学设计： 一．激趣导入： 师:一天，小红过生日，妈妈将蛋糕的 73分给了小红， 7 2 分给了她的弟弟小明，小明很不高兴。于是妈妈又说谁先吃完，就将剩下的蛋

糕分给谁。小红用了 21 刻钟吃完，小明用了 3 1刻钟吃完。 1.小明为什么不高兴呢？ 2.最后谁又会吃到剩下的蛋糕呢？（生尝试回答) 师:到底小明为什么不高兴呢？最后谁又会吃到剩下的蛋糕呢？学了今天的知识你就会明白了。今天我们就来学习"分数大小的比较"。(出示课题) 二．复习旧知，为新课铺垫： 生完成以下题目： （1）把一块蛋糕平均分成四份，每份是它的______。（检测学生是否掌握了分数的意义） （2）4 3的分数单位是______，里面有（ ）个（ ）。（检测学生是否掌握了分数单位） 三．探究新知： （一）同分母分数的大小比较 例1.比较4 1 和4 3的大小 师：拿出两张大小完全相同的纸，并向学生提问：我们怎样来比较这两张纸的大小呢？ 生：把两张纸重叠放在一起，如果完全重合，则说明两张纸相等，否则不相等。 师：同学们将这张纸对折两次平均分成4份，同桌的一个同学将其中的一份涂上颜色，另一个同学将其中的三份涂上颜色，现在两个同学们把你们涂了色的剪下来重叠看看是一份大还是三份大？

几种育种方法的比较

育种的方法和应用 生物育种是一门很复杂的技术，针对不同的生物应采用不同的育种方式，要对各种育种方式进行比较，选择简易、可操作的方式。同一种育种方式应用于不同的生物也会有不尽相同的育种过程，所以我们无论在生产实践中还是有关习题训练中都应灵活应用。 一、几种育种的方法的比较 在高中阶段所介绍的育种方法主要有：诱变育种、杂交育种、多倍体育种、单倍体育种、细胞工程育种（组织培养育种）、基因工程育种（转基因育种）、植物激素育种等。 1、杂交育种 (1)原理：基因重组。 (2)方法：连续自交，不断选种。（不同个体间杂交产生后代，然后连续自交，筛选所需纯合子） (3)发生时期：有性生殖的减数分裂第一次分裂后期或四分体时期， (4)优点：使同种生物的不同优良性状集中于同一个个体，具有预见性。’ (5)缺点：育种年限长，需连续自交才能选育出需要的优良性状。 (6)举例：矮茎抗锈病小麦等。 2、诱变育种 (1)原理：基因突变。 (2)方法：用物理因素(如x射线、1射线等)、化学因素(如亚硝酸、秋水仙素等各种化学药剂)、生物因素或空间诱变育种(用宇宙强辐射、微重力等条件)来处理生物。 (3)发生时期：有丝分裂间期或减数分裂第一次分裂间期(DNA分子复制的时候)。 (4)优点：能提高变异频率，加速育种进程，可大幅度改良某些性状，创造人类需要的变异类型，从中选择培育出优良的生物品种；变异范围广。 (5)缺点：有利变异少，须大量处理材料；诱变的方向和性质不能控制；改良数量性状效果较差，具有盲目性。 (6)举例：青霉素高产菌株、太空椒、高产小麦、“彩色小麦”等。 3、多倍体育种 (1)原理：染色体变异。 (2)方法：秋水仙素处理萌发的种子或幼苗(秋水仙素能抑制细胞有丝分裂过程中纺锤体的形成)。 (3)优点：可培育出自然界中没有的新品种，且培育出的植物器官大，产量高，营养丰富。 (4)缺点：结实率低，发育延迟。 (5)举例：三倍体无子西瓜、八倍体小黑麦。 4、单倍体育种 (1)原理：染色体变异。 (2)方法：花药离体培养获得单倍体植株，再用秋水仙素等诱导剂人工诱导染色体数目加倍。 (3)优点：自交后代不发生性状分离，能明显缩短育种年限，加速育种进程。 (4)缺点：技术相当复杂，需与杂交育种结合，其中的花药离体培养过程需要组织培养技术手段的支持，多限于植物。 (5)举例：“京花一号”小麦。 5、细胞工程育种 （1）方式：植物组织培养植物体细胞杂交细胞核移植 （2）原理：植物细胞的全能性植物细胞膜的流动性动物细胞核的全能性 （3）方法：离体的植物器官、组织或细胞→愈伤组织→根、芽→植物体去掉细胞壁

利用多种方法识字.

利用多种方法识字，提升学生的识记水平 汉字源远流长，博大精深，是承载中华文化的重要工具。郭沫若先生曾说：“识字是一切探求之第一步。”人生聪明识字始，汉字教学与人的发展关系之重大。由此可见，识字教学是小学语文一、二年级主要的学习任务。《语文课程标准》在此学段明确提出识字目标：要求理解1600—1800个汉字，培养独立识字的水平，使孩子喜欢学习汉字，有主动理解的愿望。在教学建议中还提出“识字教学要将儿童熟识的语言因素作为主要材料，同时充分利用儿童的生活经验，注重教给识字方法，培养识字水平，力求识用结合。使用多种形象直观的教学手段，创设丰富多彩的教学情境。”在评价建议中提出“注重学生日常识字的兴趣，激发学生识字、写字的积极性。” 一年级识字教学的对象是6—7岁的儿童。心理学研究表明，这个阶段的儿童共同的心理特征是：活泼好动，爱玩，不能长时间专注某一事物，喜欢具体形象的东西，记忆力较强，但学得快，忘得也快。在学习一个汉字时，儿童对这个字的形状辨认经历的理解过程往往是： （1）先整体后局部，即识字总是先感知字的整体，然后辨认个别笔画。 （2）先轮廓后内涵，即儿童往往对字形的轮廓容易掌握，对内部细节难以牢记。 （3）先上部后下部，先左后右。 （4）先熟悉后生疏。 了解儿童的这些认知特点，再联系我们的教学实践，就明白了，教学不当容易使学生感到枯燥，失去信心。所以，我们在实行识字教学时，就要从内容、形式、方法等多方面来考虑，为儿童探求新知提供可能。 一、掌握三套识字工具是基础 小学语文教育专家袁瑢老师曾讲，一个小学生有了独立识字水平，就等于掌握了一把开启宝库的金钥匙。她还在《提升小学一年级识字教学质量的体会》一

识字教学方法都有哪些

识字教学方法都有哪些 常见的有五种方法：图解识字法、猜谜语识字法、编儿歌和顺口溜识字法、编故事识字法及部件识字法等。 1.图解识字法 所谓图解识字法，是指利用图画（简笔画、贴画等）帮助识记字形的一种方法。此方法主要适用于象形字。用此法识字，既有趣，又能培养学生的想象力，如：“日、月、水、火、山、石、田、土”等最简单的象形字，都是实物的象形，笔画简单，与图画接近，学习这类汉字可以充分发挥学生的想象力。让孩子们模仿古人造字：画画大山的“山”是什么样？说说“田”怎样写，大家造字、说字兴趣浓厚，同时从中体会到以形象造字的成就感，而且也利用字形识记了字。 2.猜谜识字法 顾名思义，猜谜识字法是利用编谜语和猜谜语的方法，帮助学生识字的一种方法。此方法适用于间架结构相对比较简单，每个部件之间有一定联系的汉字。通过猜谜语来巩固已学的知识，既可调动积极性，又可以培养学生的逻辑思维能力。如：“一口咬掉手尾巴”（告）；“一点一横，叉叉顶门。”（文）等，根据字形的特点用谜语帮助识字，更能激发学生的情趣，活跃学生的思维，学生在“猜”的过程中，很自然地就理解和掌握了字形和字义。 3.编儿歌和顺口溜识字法 此方法是利用编儿歌和顺口溜来帮助学生识字的一种方法。这种通过形象化的语言帮助学生识字的形式，是容易被学生接受的，它能让学生在兴趣盎然，轻松愉快中识字。如：一个人，他姓王，口袋里装着两块糖（金）；“一人胆子

大，敢把大王压”（全）；“两个小儿土上坐”（坐）；“两人为从”“三人为众”“三木为森”“不正为歪”“小土为尘”“上小下大为尖”。儿歌和顺口溜识字的方法，幽默风趣，富教于乐，易学易记，既能展现语文的趣味性，又能提高识字的效果。如学“爱”字念：“爪字头，平宝盖，小朋友真可爱。“小小铅笔尖尖头，上小下大要记牢（尖）；小朋友们要坐直，身体不正就要歪（歪）；大口妈妈等小口，小口要回家（回）……”。 4.编故事识字法 编故事识字法，就是把汉字的几个部件利用故事巧妙地联系起来，帮助学生识字的一种方法。此方法适用于识记字形复杂的字。多数汉字是由几个部件组成的，如果发挥想象，把几个部件巧妙地联系起来，让一个个抽象的字变成一个个生动的小故事，这样既使枯燥抽象的笔画变得富有灵气，又给识字增添了趣味性。如：“灭”字（发生火灾时，用水去浇灭）；“游”字（有一个戴着泳帽的小孩子正在方形的泳池里游泳）；“左”字（左边的人在认真工作）；“右”字（右边的人在大口吃东西）。这样一想，这些字就会深深地印在脑子里，学生的想象力和创造力在这一刻也得到了发展。 5.部件识字法 所谓部件识字法，即是利用已学过的熟字部件，通过“加一加、减一减、换一换”换掉字的偏旁，帮助学生识字的一种方法。此方法主要适用于形声字和部件相同的字。如，记忆请、情、清，利用已学过的“青”字加上“氵”就成了“清”，再联系“清澈的河水”就知道了“清”与“水”有关，又理解了字义，“请”，人要用嘴，所以就有一个言字旁；情，与

运用多种识字方法

运用多种识字方法，调动学生识字的积极性 “授之以鱼不如受之以渔”。教学的最终目的是让学生能够自己学习，所以尽快地教给学生识字的方法，同时运用丰富多彩、灵活多样的识字方法，可以让学生在轻松、愉悦的环境中识字，有利于激发学生的学习兴趣，提高识字教学质量。 1、故事识字法：小学生都喜欢听故事，在识字教学中，若能把一个个抽象的汉字演绎活化成一个个生动有趣的小故事，让他们通过听故事、讲故事，在轻松、愉快的氛围中记住生字，更能激发他们的识字兴趣。教学“泼”时，把“泼”字拆成三点水和“发”利用泼的基本组词泼水来讲故事：小明倒掉盆里的水，他向门外一泼，刚好泼到了路过的小红，小红的头发全被泼湿了。通过讲故事的方式，，让学生在轻松愉快的氛围中识字，效果很好。 2、儿歌识字法：读儿歌是低年级学生比较感兴趣的活动。人教版一年级上册就有《日月明》这种拆字式的识字歌，为了帮助学生分清和记忆“看”、“着”、“春”，我编了“手目看、羊目着；三人日，就是春。”还可以根据汉字的特点，引导学生编一些适合儿童情趣和理解水平的歌诀，让他们反复诵读，使学生对字形产生直观形象，从而提高记忆字形的准确性。如：“朋”字，“两个月亮手拉手，做成好朋友。”这样学生记忆就比较深刻。“坐、座、做”这三个字读音一样，但是字形、意义都不一样，在编了“两人站土上，座位请加‘广’，做事就用单人旁。”读了这个儿歌后，学生不仅能区分字形还可以领会它们所表示的不同意思。 3、字谜识字法：学生对字谜非常感兴趣，恰到好处地运用字谜帮助学生识字。如：“半个月亮──胖”，“一口咬掉牛尾巴──告”，“牛走独木桥──生”，“一点一横长，口字摆中央，下面开扇门，门里长着嘴──高”。学生猜谜语的过程就是识记生字的过程，这种识记不同于机械识记，是在积极的思维活动中记忆，印象非常深刻。但这种方法对于字义的理解容易出现偏差，教学中要注意对字义的正确理解。 识字的方法很多，如：加一加、减一减、换一换等等。运用时要结合所学生字的特点，引导学生灵活使用，以便激发学生的识字兴趣，提高教学质量。 “授之以鱼不如受之以渔”。教学的最终目的是让学生能够自己学习，所以尽快地教给学生识字的方法，同时运用丰富多彩、灵活多样的识字方法，可以让学生在轻松、愉悦的环境中识字，有利于激发学生的学习兴趣，提高识字教学质量。 1、故事识字法：小学生都喜欢听故事，在识字教学中，若能把一个个抽象的汉字演绎活

A股讲武堂：比较两个分数大小的12种常用方法

A股讲武堂：比较两个分数大小的12种常用方法 A股讲武堂表示，在小学的初级阶段，一开始所学的除法是整除。当我们随着所学知识范围的扩大，会发现有些除法不能整除，也就出现了带余除法。有一类除法还更特殊，被除数比除数要小，商是0，后面要带个余数，比如3÷7=0……3，这样书写比较麻烦。为了方便的表示一个整数除以另外一个整数的商，就人们使用了分数来表达。 带余除法 把单位“1”平均分成若干份，表示这样的一份或几份的数，分子小于分母，叫做真分数。若分子大于或者等于分母就成为假分数。分母表示把一个物体平均分成几份，分子表示取了其中的几份。分子在上面，分母在下面。 分数和除法它是有一定的关联的，但也有区别。除法是一种运算过程，而分数它表示的是除法算式的商，它是一个值。在计算题最后结果一般要求化成最简分数，也就是大家说的要约分。 不同的分数有大小之分，分数的比较大小，是小学阶段必须掌握的一个重要知识点。它涉及

到的知识点有最大公因数，最小公倍数。分数比较大的方法非常多，甚至多达十余种。 所在年级不同，所学的知识点范围不同，所能用到的方法也略有不同。这里把小学阶段常用的比较分数的大小的方法做个大致的分析。今天我们着重介绍真分数的比较大小的方法。以下方法没有特别说明的，均以真分数比较大小为例。 同分母分数 说到分数比较大小，最简单的是同分母分数间的比较大小。直接比较分子大小。分子越大，分数的值越大；反之分子越小，分数越小。当然这种题很少，绝大多数题是异分母分数的比较大小。 异分母分数比较大小 两个异分母分数怎么比较大小？多数人的脑海中首先想到的是通分。把两个分数通分成分母相同。这里要用到的知识点是：两个数的最小公倍数。 通分成分母相同，其实这个原理非常简单，由于分子相当于除法算式中的被除数，如果除数相同，自然分子越大商也越大。相当于把两个分数变成最简单的同分母分数比较大小了。化成小数比较 其实有一种粗暴的方法，而且是万能的，只不过对有些题比较快，有时计算量比较大。 根据分数与除法的关系，分数相当于除法算式的商。所以说比较分数大小可以将分数化成小数的形式。 小数的比较大小，相信大家都清楚，从最高位开始比较，直到分出大小的数位为止。有时直接通过估算，就可以得出两个分数的大小。比如2/3与3/4比较大小，前者化成小数大约是0.6几，后者是0.7几，谁大谁小，一目了然。 通分子 可能有部分网友会觉得这个说法有点奇怪。还有通分子这样的说法吗？其实也是非常简单

几种常用的育种方法比较

几种常用的育种方法比较（总结整理） 一、诱变育种： 诱变育种是指利用人工诱变的方法获得生物新品种的育种方法 原理：基因突变 方法：辐射诱变，激光、化学物质诱变，太空（辐射、失重）诱发变异→选择育成新品种 优点：能提高变异频率，加速育种过程，可大幅度改良某些性状；变异范围广。 缺点：有利变异少，须大量处理材料；诱变的方向和性质不能控制。改良数量性状效果较差。 二、杂交育种： 杂交育种是指利用具有不同基因组成的同种（或不同种）生物个体进行杂交，获得所需要的表现型类型的育种方法。其原理是基因重组。 方法：杂交→自交→选优 优点：能根据人的预见把位于两个生物体上的优良性状集于一身。 缺点：时间长，需及时发现优良性状。 三、单倍体育种： 单倍体育种是利用花药离体培养技术获得单倍体植株，再诱导其染色体加倍，从而获得所需要的纯系植株的育种方法。（主要是考虑到结合中学课本，经查阅相关资料无误。）其原理是染色体变异。优点是可大大缩短育种时间。 原理：染色体变异，组织培养 方法：选择亲本→有性杂交→F1产生的花粉离体培养获得单倍体植株→诱导染色体加倍获得可育纯合子→选择所需要的类型。 优点：明显缩短育种年限，加速育种进程。 缺点：技术较复杂，需与杂交育种结合，多限于植物。 四、多倍体育种： 原理：染色体变异（染色体加倍） 方法：秋水仙素处理萌发的种子或幼苗。 优点：可培育出自然界中没有的新品种，且培育出的植物器官大，产量高，营养丰富。缺点：只适于植物，结实率低。 五、细胞工程育种： 细胞工程育种是指用细胞融合的方法获得杂种细胞，利用细胞的全能性，用组织培养的方法培育杂种植株的方法。 原理：细胞的全能性 方法：（1）植物：去细胞壁→细胞融合→组织培养 （2）动物克隆：核移植→胚胎移植 优点：能克服远缘杂交的不亲和性，有目的地培育优良品种。动物体细胞克隆，可用于保存濒危物种、保持优良品种、挽救濒危动物、利用克隆动物相同的基因背景进行生物医学研究等。

识字教学策略与方法

尊重规律科学识字提升实效（定稿） ——识字教学策略与方法 新修订的《语文课程标准》更加重视识字与写字教学： 高度重视贯穿始终 降低数量提升质量 多认少写识写并重 重视习惯培养能力 两表先行先认先写 一、走进识字课堂了解教学现状 （一）学生的问题： 1. 时间紧、任务重：《语文课程标准》指出：“第一学段( 一、二年级) 认识常用汉字1600 个左右，其中800个左右会写。”占六年识字总量的百分之五十还多。两年要求认1600 个常用汉字，这是建国以来历次教学大纲所不多见的。新教材就注重学生大量识字, 老师感到困难。 2. 反复强调，错误依旧：有的字教师反复强调学生还是会出现错误，令老师大为恼火有迷 惑不解。尤其是在二年级的下学期和三年级会出现一个错别字的高峰期。形近字难以区分、 书写错误会大量出现。 3. 识字课单调，学生不喜欢: 识字教学缺乏生动性和情趣性，难以激发学生的学习热情，加上低年级学生自控力差，学习汉字感觉困难。识字课的效果也大打折扣。 4. 低年级既要识字又要阅读, 怎样处理好关系: 低年级阅读教学和识字、写字教学的时间分 配怎样更合理，两者之间的关系怎样更合理。 （二）教师的问题： 1．识字教学不注重提高学生的人文素养，缺乏情趣。 在识字教学中，教师只把汉字作为一种符号传授给学生，只注重汉字的拼读、认写，注 重记忆，而汉字所呈现的画面、情趣，汉字里面蕴含的思想、情感却被教师所忽略，汉字对于 学生的教育功能被教师忽视。 2．教学策略不适应学生身心发展的特点。教法单一，程序固化，令学生对识字兴味索然。 （一拼拼音，二读生字，三唱笔画，最后组词）。 3．窄化识字写字教学的途径，不注重语言实践活动的开展。

比较分数大小常用的几种方法

比较分数大小常用的几种方法 江苏省泗阳县李口中学沈正中 比较分数大小的方法有很多，通常采用的方法是先通分再比较它们的大小，这种方法叫“同分母法”。比较分数大小最基本的方法就是“同分母法”和“同分子法”。下面介绍几种比较分数大小的常用方法。 一、同分母法 先把分母不同的两个分数化成分母相同的两个分数，然后再根据“分母相同的两个分数，分子大的分数较大”进行比较。 【题1】 【解析】把原来两个分数的分母4和11的最小公倍数44作为两个新分数的分母，根据分数的基本性质可得：由此可知： 二、同分子法 先把分子不同的两个分数化成分子相同的两个分数，然后再根据“分子相同的两个分数，分母小的分数较大”进行比较。 【题2】 【解析】把原来两个分数的分子3和5的最小公倍数15作为两个新分数的分子，根据分数的基本性质可得：，，因为，所以。 二、化为小数法 先把两个分数化成小数，再进行比较。 【题3】 【解析】先把这两个分数化成小数，即由此可知：。

四、中间分数法 在要比较的两个分数之间，找一个中间分数，根据这两个分数和中间分数的大小关系，比较这两个分数的大小。 【题4】 【解析】根据两个分数的分子和分母的大小关系，把作为中间分数。可以很容易看出：所以。 五、差等法 根据两个分数特点，利用“若两个真分数的分子与分母的差相等，则分子与分母和较大的分数较大（或分母较大的分数较大）；若两个假分数的分子与分母的差相等，则分子与分母和较大的分数较小（或分母较大的分数较小）”比较两个分数的大小。 【题5】 【解析】这两个真分数的分子与分母的差都是1，因为 ，所以。 【题6】 【解析】这两个假分数的分子与分母的差都是4，因为 六、交叉相乘法 根据“若第一个分数的分子乘以第二个分数的分母相的积大于第一个分数的分母乘以第二个分数的分子的积，则第一个分数较大。否则第一个分数较小。”比较两个分数的大小。 【题7】 【解析】因为7×9 >12×5，所以。 七、比较倒数法 根据“倒数较小的分数较大，倒数较大的分数较小。”比较两个分数的大小。 【题8】

二年级语文识字学习方法

二年级语文识字学习方法 ----WORD文档，下载后可编辑修改---- 二年级语文学习方法之识字篇 一、教学生在自学中掌握汉字的构字规律。 过去的教学一般是老师教，学生学，学生处于被动地位。新教材在识字教学方面充分体现了让学生自学，用多种方法思考、记忆、分析字形的思想，培养学生自主识字能力，放手让学生自己思考，自己发现问题，想办法解决问题。这样不仅激发了学生识字的兴趣，对字形的记忆也会更加扎实牢固，还可以从中摸索体会汉字的构字规律。 1. 熟字带生字法 利用学过的熟字进行形近字对比、同音字对比、去掉偏旁、拆分部件、减笔画、添笔画等方式变换成生字。如学习"天"字，有的说"大"字加一横就是天;有的说"人"字加两横就是天;有的说"夫"字不出头就是天。学习"园"字时，有的说是在"元"字外面加上围墙"口"就是"园"，从而明白"校园、公园"是有围墙的，以区别"元、园"的用法。学习"爱"字，学生把它拆成"、冖、友"，我配上儿歌"爪字头，秃宝盖，小朋友，真可爱"。这样学生很快就记住了生字。 2. 同偏旁部首识字法 在教学认识同一类偏旁的生字时，如三点水的字与水有关，日子旁的字与太阳有关，金字旁的字与金属有关;同部首的字"清""请""情""蜻""睛" "晴"，都有部首"青"，分别加上不同的偏旁就变成了六个不同字，鼓励学生自己去探索它们的秘密，发现它们的共同点，揭

示构字的规律，初步掌握构字特点，举一反三，触类旁通，会大大提高学生的识字能力。 3. 象形识字法 课本中的"山、石、田、土、井"这一类字是由古代的象形字演变而成，这些字与实物都有许多相似处，所以让学生观察实物或实物图片后再识记，轻而易举。低年级学生的形象思维能力比抽象思维能力要强得多。所以，识字教学与具体的事物和形象相结合，利于学生识记。如用手遮目"看"，用竹毛制成"笔"。通过这样的描述，在学生头脑中建立起直观印象，达到了既认形又明意的效果。 4. 形声识字法 汉字中有相当一部分的字是形声字，部首表意，声旁表音。形声字的这一特点能比较有效地帮助学生理解、记忆字形。例如："蜻"是蜻蜓的"蜻"，所以用虫字旁，右边读音，整个字也读"qīng"。从这个角度思考、讲解，学生基本做到过目不忘。 5. 会意识字法 会意字也就比较容易掌握了。如：教学"从"字，请两位学生上台表演一人跟着一人走，形象的表演启发学生理解了"跟从"，接着出示插图让学生观察，学生立刻就明白了"从"的字形和字义。 根据这一特点来学习生字，事半功倍。 6. 归类识字法 根据字的组成规律或生活中的类别进行分类识字。如：教材中的第四册归类识字(二)，教学内容是一些动物的名字，分别有鸟类、兽

小学低年级识字教学的五种方法

小学低年级识字教学的五种方法 巧用图画，激发学生识字的兴趣；营造生活化、真实性的識字情境；利用游戏调动学生识字的兴趣；运用有趣的吟唱，诱发学生识字的兴趣；实施灵活丰富的激励性的识字评价。 标签：图画；生活；真实；游戏；吟唱；评价 认识汉字是学好语文的基础。简单、重复的识字教学会使学生觉得枯燥乏味，甚至厌烦，以至于无法达到教师的预期教学效果。如何让学生准确掌握生字词，既是小学低年级语文教学的重点，也是难点。为了使学生在轻松愉快的气氛中主动地识字，我根据儿童的年龄特点，采取针对性措施，有意识地提高学生的识字兴趣，拓宽识字途径，培养他们的识字能力。 一、巧用图画，激发学生识字的兴趣 有人说：一个汉字，就是一幅美丽的图画。对于汉字，文学家唐兰先生曾有这样的说法：“文字本于图画，最初的文字是可以读出来的图画。”可见，很多汉字是由图画衍生出来的。低年级儿童对图画的兴趣浓于文字。识字教学中，可以充分利用多彩的图画帮助学生把识字和认识事物联系起来，让儿童学得轻松愉快。 在生字字形教学中，教师要不失时机地让学生发挥自己的想象，给学生配上“图画”。如在教学《口耳目》一课时，教师可分别出示口、耳、目的汉字、古字和图画，以古代的象形字来引出现代汉字，通过画面与文字的演变，引导学生观察事物和古字的联系，并把其配成对，对号入座。在津津有味地看、兴致勃勃地找的过程中，学生不但认识了事物，观察了字形，更了解了字义。 这种方式使枯燥的识字过程演变成活泼有趣的活动过程，极大地激发学生的学习热情，提高了学生识字的积极性。再如教学“跳、蹦、扔、扛、拍、扫”一课时，我让学生给生字配上“身体动画”，运用想象，让字形在脑海中如动画般流出来，让一个个静止的生字都“动”起来，初步培养了他们的识字能力。给字配“画”恰当地结合在图画与文字的巧妙联系中，丰富了学生的想象。使学生生动地识字，有效地提高学习效率。 二、营造生活化、真实性的识字情境 语言文字来源于生活，最终还是应该回归于生活，联系生活实际进行识字教学。创设生活化情境，将识字内容与儿童的生活实际相联系，构建一个开放自主的课堂，方能引导学生的学习兴趣。 如在教学《菜园里》一课时，课前，我将学生分成四个大组，每组摆上许多新鲜的蔬菜：白菜、卷心菜、白色的萝卜、绿色的辣椒、紫色的茄子、黄色的南

六年级奥数—01比较分数的大小

六年级奥数—01比较分数的大小 同学们从一开始接触数学，就有比较数的大小问题。比较整数、小数的大小的方法比较简单，而比较分数的大小就不那么简单了，因此也就产生了多种多样的方法。 对于两个不同的分数，有分母相同，分子相同以及分子、分母都不相同三种情况，其中前两种情况判别大小的方法是： 分母相同的两个分数，分子大的那个分数比较大； 分子相同的两个分数，分母大的那个分数比较小。 第三种情况，即分子、分母都不同的两个分数，通常是采用通分的方法，使它们的分母相同，化为第一种情况，再比较大小。 由于要比较的分数千差万别，所以通分的方法不一定是最简捷的。下面我们介绍另外几种方法。 1.“通分子”。 当两个已知分数的分母的最小公倍数比较大，而分子的最小公倍数比较小时，可以把它们化成同分子的分数，再比较大小，这种方法比通分的方法简便。 如果我们把课本里的通分称为“通分母”，那么这里讲的方法可以称为“通分子”。 2.化为小数。 这种方法对任意的分数都适用，因此也叫万能方法。但在比较大小时是否简便，就要看具体情况了。 3.先约分，后比较。 有时已知分数不是最简分数，可以先约分。 4.根据倒数比较大小。

5.若两个真分数的分母与分子的差相等、则分母（子）大的分数较大；若两个假分数的分子与分母的差相等，则分母（子）小的分数较大。也就是说， 6.借助第三个数进行比较。有以下几种情况： （1）对于分数m和n，若m＞k，k＞n，则m＞n。 （2）对于分数m和n，若m-k＞n-k，则m＞n。 前一个差比较小，所以m＜n。 （3）对于分数m和n，若k-m＜k-n，则m＞n。

注意，（2）与（3）的差别在于，（2）中借助的数k小于原来的两个分数m和n；（3）中借助的数k大于原来的两个分数m和n。 （4）把两个已知分数的分母、分子分别相加，得到一个新分数。新分数一定介于两个已知分数之间，即比其中一个分数大，比另一个分数小。 利用这一点，当两个已知分数不容易比较大小，新分数与其中一个已知分数容易比较大小时，就可以借助于这个新分数。 比较分数大小的方法还有很多，同学们可以在学习中不断发现总结，但无论哪种方法，均来源于：“分母相同，分子大的分数大；分子相同，分母小的分数大”这一基本方法。 练习1 1.比较下列各组分数的大小： 答案与提示练习1

小课题运用多种识字方法提高二年级学生的识字能力

浅谈如何运用多种识字方法提高 二年级学生的识字能力 一、小课题提出的背景 识字是小学低年级的教学重点，是学生提高阅读能力的基础。随着新课改的实施，低年级的识字量明显增多，如何让学生识记生字便成为教学的一个难点。在识字教学中，应利用不同的教学方法，充分发挥学生的自主性，调动学生的多种感官参与学习，达到识字的目的。这就要求我们在语文教学中采用多样的教学方法，交给学生多样的识字方法，带给学生学习语文的乐趣。上了二年级学生的识字量立刻增大，为了打好基础，开个好头，我们二年级三个班选择了这个小课题进行研究。 二、研究这一小课题的意义 1.现实意义 识字教学是低年级语文教学的重中之重，《语文课程标准》指出：低年级识字教学的目标，首先要让学生“喜欢学习汉字，有主动识字的愿望。”因为兴趣是学习的动力，只有有了这种对汉字的喜欢，才会激发他们学习的欲望。同时，识字写字是阅读和写作的基础，是整个小学阶段语文教学关键。学生除养成良好的识字习惯外, 还必须掌握“活”的识记方法，为今后的自学阅读打下良好的基础。小学低年级学

生的思维特点是以具体形象思维为主，对于低年级学生来讲，识字写字虽然是教学的重难点，但是，低年级学生一打开课本就是大量的、抽象的归类识字，不知不觉之中就解决了这个重难点。在识字教学中，为了使学生在愉快轻松的气氛中主动地识字，我们教师要根据低年级学生的心理特点，采用灵活新颖的教学方式，为学生创造快乐的学习环境。 2、创新意义 识字是小学低年级的教学重点，是学生提高阅读能力的基础。如何解决学生识记枯燥的生字成为教学的难点。当今很多教师就研究了不同的教学方法，运用于识字教学中，充分发挥学生的自主性，调动学生的多种感官参与学习，达到识字的目的。 ⑴本课题的研究是在以往不同识字教学方法的基础上潜心研究，把以往分散的识字方法进行归类、整理、分析并逐步改进、总结出“灵活多变、科学有效”的识字方法、来激发学生学习兴趣，使学生掌握多样的识字方法，促进学生识记效果的提高，让他们真正享受到语言文字带来的快乐。 ⑵在前人研究的基础上创新识字方法，采用多元化识字教学，激发学生的识字兴趣，从而实现识字教学的情趣化。 以上观点正是我们选择此课题的意义所在。 三、研究这一小课题要达到的目标 ⑴激发学生识字的兴趣，让学生在游戏中学、活动中

小学六年级奥数：比较分数的大小汇编

小学六年级奥数：比较分数大小的方法 对于两个不同的分数，有分母相同，分子相同以及分子、分母都不相同三种情况，其中前两种情况判别大小的方法是： 分母相同的两个分数，分子大的那个分数比较大； 分子相同的两个分数，分母大的那个分数比较小。 第三种情况，即分子、分母都不同的两个分数，通常是采用通分的方法，使它们的分母相同，化为第一种情况，再比较大小。 由于要比较的分数千差万别，所以通分的方法不一定是最简捷的。下面我们介绍另外几种方法。 一“通分子”。 当两个已知分数的分母的最小公倍数比较大，而分子的最小公倍数比较小时，可以把它们化成同分子的分数，再比较大小，这种方法比通分的方法简便。 如果我们把课本里的通分称为“通分母”，那么这里讲的方法可以称为“通分子”。 二万能方法.化为小数。 三.先约分，后比较。 有时已知分数不是最简分数，可以先约分。 四.根据倒数比较大小。倒数大的原分数小。

五.若两个真分数的分母与分子的差相等、则分母（子）大的分数较大；若两个假分数的分子与分母的差相等，则分母（子）小的分数较大。， 六.借助第三个数进行比较。有以下几种情况： （1）对于分数m和n，若m＞k，k＞n，则m＞n。 （2）对于分数m和n，若m-k＞n-k，则m＞n。 前一个差比较小，所以m＜n。 （3）对于分数m和n，若k-m＜k-n，则m＞n。 注意，（2）与（3）的差别在于，（2）中借助的数k小于原来的两个分数m和n；（3）中借助的数k大于原来的两个分数m和n。 （4）把两个已知分数的分母、分子分别相加，得到一个新分数。新分数一定介于两个已知分数之间，即比其中一个分数大，比另一个分数小。

运用多种识字方法 提高自主识字能力

运用多种识字方法提高自主识字能力 《语文课程标准》指出，低年级段要求学生喜欢学习汉字，有主动识字的愿望。然而识字过程又是一件十分枯燥的工作，我根据课程标准对识字的要求和新教材的特点，结合儿童的身心发展和认知规律，在识字教学过程中，针对不同类型，不同特征的生字，探索运用了多种识字方法，激发了学生的识字兴趣，拓展了识字途径，提高了识字效率，培养了学生自主识字的习惯。我认为可采用以下几种行之有效的方法。 一、体态演示法。活泼好动是孩子的天性。有时候，用肢体动作演示不仅能使孩子理解字义，还能帮助他们记住字形。如学习“看”时，可以一边请学生上台表演孙悟空往远处看的动作，一边引导学生观察他是怎么看的。通过观察让学生一下子明白了“把手搭在眼睛上就表示看”。“看”是由“手”的变形和“目”组成的。又如学习“打、拔、拍、跳、跑”时，如果仅让学生知道这些字与手、脚的动作有关，显然是很不够的，如果让学生动手、动脚做一做动作，让学生在运动中认记这些字。这样学生通过自己动手演示，不但让学生记清了字形，而且还加深了学生对字义和用法的理解。 二、动作表演法。还可以利用孩子活泼、好动的天性，

识字时安排学生演一演，也能达到意想不到的效果。如：在学习“鸡、鸭、鹅、羊、猫、狗”等动物的时，让学生戴上动物的头饰演一演，让学生尽量地把这些小动物的外形特征、动作、叫声给表演出来。这样，识字教学既给学生创造了展示才华的机会，又加深了学生对这些小动物外形特征、生活习性的了解。 三、实物演示法。通过实物演示，也可以给学生留下深刻印象，达到轻松掌握汉字形、义的目的。如学习“笔”时，可以出示一支毛笔，让学生观察得出毛笔的上面（笔杆）是竹子做的，下面（笔尖）是动物的毛做的，因此“笔”的上面是“竹字头”，下面是“毛”字。又如学习“灭”字时，可以用一块玻璃把燃烧的火盖住，火即灭，这样学生很快便记住了“灭”字。再如学习“尖”字时，出示一支削好的铅笔，学生一看便知：一头粗，一头细就是“尖”。 四、笔画加减法。为汉字做加减法。即让学生把算术中学到的加减法迁移到认字中来，对已学过的熟字进行加减得出要学的生字。这种识字方法很让孩子们喜欢。如在学习“人、大、太、天”时，要将“人”作为字根，用添加笔画的方法记住“大”和“太”“天”。又如“香、星、早、圆、秋、种”等合体字时，可以引导学生用部件相加的方法来识记字形：“禾加日是香”“日加生是星”“日加十是早”“不正歪”“三人众”“三日晶”等。再如，学习“巴、也、毛、卖”

三年级-比较简单的分数大小

比较简单分数的大小 教学内容：青岛版小学数学三年级上册95--97页信息窗2 教学目标 1. 探究和掌握比较简单分数大小的方法，熟练地进行比较简单分数的大小。 2. 通过观察、比较、分析、归纳、推理总结等活动，加深学生对分数意义的理解；培养学生的观察比较和归纳总结的能力。 3. 培养学生小组合作意识和自主探索精神，训练思维的灵活性，体会数学与生活的紧密联系。 教学重难点 教学重点：同分母分数和分子是1的异分母分数大小的比较方法。 教学难点：分子是1的异分母分数大小的比较方法。 教具、学具 教师准备：多媒体课件、长方形、正方形、圆、三角形纸片等。 学生准备：直尺、水彩笔、剪刀、长方形、正方形、圆、三角形纸片等。 教学过程 一、创设情境，提出问题 知识再现： 1.回顾分数的意义。 同学们，在数学世界里，我们结识了很多好朋友。我们刚刚认识了分数，也帮助了小朋友们平均分了大饼和蛋糕（课件出示图片）你们看到了哪些分数，谁能说说各分数表示的意义？ 学生说分数时要求说出各分数表示的意义，明确把物体平均分成几份（强调平均分），其中的1份就是这个物体的几分之一，几份就是这个物体的几分之几，进一步理解分数的意义。 2. 现在啊有两个小朋友小东和小利，他们正在吃橙子，（课件出示信息窗2） 看了情境图你能提出什么问题？ 板书：小东：3 8 小利： 5 8

理解3 8 、 5 8 表示的意义。 启发学生比较：小东和小利谁吃的多？ 3.寻找发现、5 8 的异同点。 仔细观察这两个分数，有什么相同点和不同点？ 【预设】：（1）3 8 、 5 8 合起来是 8 8 。 （2）我发现分子都比分母小。 （3）分母一样，都是8。 …… 4.提出疑问，导入新课。 你们感觉这两个分数谁大谁小呢？这节课我们就来研究关于分数大小比较方面的问题。（板书课题：比较简单分数的大小） 二、自主学习，小组探究 探究3 8 、 5 8 的大小比较方法。 1.初步感知。 师：你们能说出3 8 、 5 8 的大小关系吗？ 预设：5 8 ﹥ 3 8 。 2.质疑探索。 师质疑：为什么？说说你的理由。 师引导学生利用手中的工具进行说明。【温馨提示1】： ⑴想一想，如何利用手中两个等长的条形纸片表示出3 8 、 5 8 呢？两个圆形 纸片呢？两条等长的线段图呢？两个大小相等的正方形纸片呢？

几种育种的方法比较

育种的方法与应用 生物育种就是一门很复杂的技术,针对不同的生物应采用不同的育种方式,要对各种育种方式进行比较,选择简易、可操作的方式。同一种育种方式应用于不同的生物也会有不尽相同的育种过程,所以我们无论在生产实践中还就是有关习题训练中都应灵活应用。 一、几种育种的方法的比较 在高中阶段所介绍的育种方法主要有:诱变育种、杂交育种、多倍体育种、单倍体育种、细胞工程育种(组织培养育种)、基因工程育种(转基因育种)、植物激素育种等。 1、杂交育种 (1)原理:基因重组。 (2)方法:连续自交,不断选种。(不同个体间杂交产生后代,然后连续自交,筛选所需纯合子) (3)发生时期:有性生殖的减数分裂第一次分裂后期或四分体时期, (4)优点:使同种生物的不同优良性状集中于同一个个体,具有预见性。’ (5)缺点:育种年限长,需连续自交才能选育出需要的优良性状。 (6)举例:矮茎抗锈病小麦等。 2、诱变育种 (1)原理:基因突变。 (2)方法:用物理因素(如x射线、1射线等)、化学因素(如亚硝酸、秋水仙素等各种化学药剂)、生物因素或空间诱变育种(用宇宙强辐射、微重力等条件)来处理生物。 (3)发生时期:有丝分裂间期或减数分裂第一次分裂间期(DNA分子复制的时候)。 (4)优点:能提高变异频率,加速育种进程,可大幅度改良某些性状,创造人类需要的变异类型,从中选择培育出优良的生物品种;变异范围广。 (5)缺点:有利变异少,须大量处理材料;诱变的方向与性质不能控制;改良数量性状效果较差,具有盲目性。 (6)举例:青霉素高产菌株、太空椒、高产小麦、“彩色小麦”等。 3、多倍体育种 (1)原理:染色体变异。 (2)方法:秋水仙素处理萌发的种子或幼苗(秋水仙素能抑制细胞有丝分裂过程中纺锤体的形成)。 (3)优点:可培育出自然界中没有的新品种,且培育出的植物器官大,产量高,营养丰富。 (4)缺点:结实率低,发育延迟。 (5)举例:三倍体无子西瓜、八倍体小黑麦。 4、单倍体育种 (1)原理:染色体变异。 (2)方法:花药离体培养获得单倍体植株,再用秋水仙素等诱导剂人工诱导染色体数目加倍。 (3)优点:自交后代不发生性状分离,能明显缩短育种年限,加速育种进程。 (4)缺点:技术相当复杂,需与杂交育种结合,其中的花药离体培养过程需要组织培养技术手段的支持,多限于植物。 (5)举例:“京花一号”小麦。 5、细胞工程育种 (1)方式: 植物组织培养植物体细胞杂交细胞核移植 (2)原理: 植物细胞的全能性植物细胞膜的流动性动物细胞核的全能性 (3)方法: 离体的植物器官、组织或细胞→愈伤组织→根、芽→植物体去掉细胞壁→诱导原生质体融合→组织培养核移植→胚胎移植

(完整版)比较分数大小的十种方法

比较分数大小的十种方法 江苏省泗阳县李口中学沈正中 比较分数的大小，可根据要比较分数的特点，选择适当的方法进行比较，下面介绍几种比较分数大小的方法。 一、“化为同分母”法 先把分母不同的两个分数化成分母相同的两个分数，然后再根据“分母相同的两个分数，分子大的分数比较大”进行比较。 【题1】.比较的大小。 【分析与解答】：把原来两个分数的分母12和9的最小公倍数36作为两个新分数的分子，根据分数的基本性质可得：，，因为，所以。 二、“化为同分子”法 先把分子不同的两个分数化成分子相同的两个分数，然后再根据“分子相同的两个分数，分母小的分数比较大”进行比较。 【题2】.比较和的大小。 【分析与解答】：把原来两个分数的分子3和5的最小公倍数15作为两个新分数的分子，根据分数的基本性质可得：，，因为，所以。 三、“比较倒数”法 通过比较两个分数倒数的大小来比较两个分数的大小。倒数较小的分数，原分数较大；倒数较大的分数，原分数较小。 【题3】.比较和的大小。 【分析与解答】：的倒数是，的倒数是 。因为，所以。

四、“相除”法 用第一个分数除以第二个分数，若商小于1，则第一个分数小；若商大于1，则第一个分数大；若商等于1，则两个分数相等。 【题4】.比较和的大小。 【分析与解答】：因为，而，所以。 五、“约分”法 在比较两个分数之前，先将两个分数约分，然后再进行比较两个分数的大小。 【题5】.比较和的大小。 【分析与解答】：将的分子、分母同时除以它们的公约数101得；将的分子、分母同时除以它们的公约数10101得，所以。 。 六、“化为小数”法 先根据分数与除法的关系，把这两个分数化成小数，再比较两个小数的大小，然后再确定原分数的大小。 【题6】.比较和的大小。 【分析与解答】：，……，因为 0.375＜0.388……，所以。 七、“中间分数”法 在要比较的两个分数之间，找一个中间分数，根据这两个分数和中间分数的大小关系，比较这两个分数的大小。 【题7】.比较和的大小。 【分析与解答】：根据两个分数的分子和分母的大小关系，把作为中间分数。可以很容易看出：，，所以。 八、“差等”法 根据“分子与分母的差相等的两个真分数，分子与分母和较大的分数比较

六种识字方法

介绍中国大陆几种成功的识字教学方法 中国课程教材研究所崔峦 汉字是中华文化的载体。对于中国人来说，掌握汉字是学习语文的起点，也是学习其他课程和日后发展的基础。 在中国历史上，自从有了汉字，便有了识字教育。识字教育和中华文明史同步地走过了漫长的道路。中国传统的语文教育十分重视识字教育。早在纪元前，西汉的史游就编撰了《急就篇》，这大概是成书较早、流传最久的识字教材。之后，主要用“三百千”，即《三字经》《百家姓》《千字文》这些识字教材，对蒙童进行识字教育。古代蒙学识字，主要有三个方面的特点：集中识字为主要形式，文以载道为一贯传统，背诵识记为基本方法。 新中国成立后，教育事业发展迅速。到2000年底，中国大陆基本上普及了九年义务教育。其间，识字教育在不断改革、不断发展，以适应教育的发展和提升民族素质的需要。 随着教育的发展和社会的进步，识字教育研究的问题也不断深入。本世纪五十年代末六十年代初，是识字教学研究的一个活跃期。那时思考和研究的主要问题是，由于小学低年级单纯识字，且识字速度慢（每课书只学三至五个字，当时称之为“三五”观点），对刚入学的儿童来说，这样识字既枯燥，又中断了语言的发展。1958年出现的集中识字和分散识字，旨在解决上述问题。七八十年代，是识字

教学研究的又一个活跃期。1982年出现的注音识字，也是为了解决上述问题。进入九十年代，随着计算机的普及和信息化社会的到来，识字教学思考的问题不仅是识得快，还有如何把识字和普及信息技术结合起来，如何借助多种媒体识字的问题，于是，计算机辅助识字等应运而生。据不完全统计，到目前为止，在中国大陆有一定影响的识字教学方法有二三十种。其中，侧重从字形入手的有集中识字、部件识字等，侧重从字义入手的有分散识字等，侧重从字音入手的有注音识字、汉字标音识字等，从形义结合入手的有字理识字等，从音义结合入手的有听读识字、炳人识字等，从形音义联系入手的有字族文识字、韵语识字等，此外，还有计算机辅助识字。下面就几种有代表性的、效果较好、影响较大的识字教学方法，逐一进行简单介绍。 一、集中识字 1958年由辽宁省黑山北关实验学校首创，1960年北京景山学校加入，文革后中央教育科学研究所投入研究。形成“两山”一所的集中识字教学流派。集中识字直接承继蒙学识字教育的经验，旨在通过一二年级快速大量识字，使学生尽早做到能大量阅读，来解决识汉字和学汉语的矛盾。基本做法是一二年级的四册教材每册都分作几个部分，在每部分中先归类识字，再读若干篇课文，“识字──阅读”不断循环编排。在归类识字中，基本字带字是最主要的识字方法。如，由基本字“青”，带出“清、蜻、情、晴、请、睛”；由基本字“方”带出“房、访、放”。这里的基本字，是指在字形相近的一组字中共