cDNA文库建库流程

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一. Total RNA 的提取................................................2 二. mRNA 的分离......................................................5 三．cDNA 双链合成.....................................................7 四．载体制备..............................................................10 五. cDNA 双链和载体的连接..................................12 六．电转化流程..........................................................13 七．快速鉴定、菌落 PCR.........................................15 八．pBlueScript cDNA 库扩增. (17)

一.Total RNA 的提取

1.试剂配制

准备工作：

1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂 瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤 6小时。

2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用 0.1‰DEPC 水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压 灭菌。

3、 电泳槽及电泳托、梳子用 3%双氧水处理。

4、常用试剂及其配方：

▲DEPC 水：在 1000ml去离子水中加入 100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。

▲0.78M 柠檬酸纳：PH=4~5

三水合柠檬酸纳 22.94g

加 DEPC 水定容至 100ml，室温放置备用。

▲10%肌氨酸钠：

肌氨酸钠 10g

加 DEPC 水定容至 100ml，室温放置备用。

▲变性裂解液：

0.78M 柠檬酸钠 8.25ml

10%肌氨酸钠 12.375ml

异硫氰酸胍 118.05g

加 DEPC 水定容至 250ml，室温放置备用

临用前加 β-巯基乙醇使其终浓度为 1%（v/v）

▲ 2M 醋酸钠 PH=4.5

NaAc?3H2O 13.6g

加 DEPC 水定容至 50ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲3M 醋酸钠 PH=5

NaAc?3H2O 20.4g

加 DEPC 水定容至 50ml,高压灭菌，室温放置备用▲ 4M LiCL:

LiCL 24.164g

加 DEPC水定容至 100ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲0.5M EDTA PH=8.0

EDTA 18.61g

用 NaOH调 PH值至 8.0，定容到 100ml，高压灭菌，室温放置备用 ▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):

MOPS 41.86g

NaAC?3H2O 4.10g

0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml

用 NaOH调 PH值 6.5 , DEPC 水定容到 1L，室温避光放置备用。

▲ 1x MOPS:

10x MOPS 30ml

加 DEPC水 270ml，用时现配。

▲4x RNA Loading buffer:

10x MOPS 400ul

甘油（高压过） 200UL

溴酚兰 10ul

甲醛(37%) 72ul

去离子甲酰氨 310ul

EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul

ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul

在 4℃ 可保持 3个月

▲ 10x PBS

pH=7.4

NaCl 80g

KCl 2g

Na2HPO4 14.4g

KH2PO4 2.4g

定容至 1000ml

▲变性电泳胶：

称取 0.5g琼脂糖，加入 47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至 50℃左右， 加入 2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。

▲变性电泳缓冲液：

在 250ml容量瓶内加入 5ml甲醛，用 1x MOPS 定容至 250ml

2.动物组织 total RNA 的提取

1． 根据表 1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量， 将变性裂解液分装到 RNase-free 的 50ml无菌离心管中，冰浴 5分钟。

2． 将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆 15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎 片。

3． 根据表 1加入适量 2M 的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀 4-5次。

4． 根据表 1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合 4-5次，再摇动 10秒钟。

5． 冰浴 10 分钟。

6． 4°C，12000g离心 20分钟。

7． 小心转移上层水相于另一个 RNase-free 的无菌离心管中，内含所需的 RNA。蛋白质 和 DNA分别留在了有机相和中间层。

8． 加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀 30分钟以上。

9． 4°C，12000g离心 20分钟。

10． 根据表 1加入适量的变性裂解液重新溶解 RNA。

11． 加等体积的氯仿，加盖颠倒混合 4-5 次，再摇动 10秒钟。

12． 4°C，12000g离心 20分钟。

13． 小心转移上层水相于另一个 RNase-free 的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20°C 沉淀至少 30分钟。

14． 4°C，12000g离心 20分钟。

15． 弃上清，加 1ml75%的乙醇漂洗 RNA 沉淀。4°C，12000g离心 10分钟。

16． 弃上清，空气中干燥 RNA沉淀，直至没有乙醇气味。用适量 DEPC 水充分溶解 RNA 沉淀。

17． 取少量 RNA用于测定 OD值及电泳，其余置－80°C冰箱中保存。

表 1

Mg# of tissue 500 800 1000

变性裂解液(ml) 5 8 10

2M NaOAC pH 4 (ml) 0.5 0.8 1

水饱和酚 (mL) 5 8 10

氯仿 (mL) 1 1.6 2

异丙醇(mL) 4 6 8

变性裂解液 (mL) 0.5 0.8 1

异丙醇(mL) 0.5 0.8 1

75% 乙醇(mL) 1 1 1

DEPC-treated H20 (mL) 0.5 0.8 1

3.植物组织 total RNA 的提取

1. 先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将 1g样品在液氮中研磨成粉末状。

2. 将粉末倒入盛有 3ml变性裂解液的 50ml离心管中，充分匀浆。（1g样品加入 3ml变性

裂解液）。

3. 加入 0.3ml（1/10 体积）2M 的 NaAc（ph4－5）颠倒混匀。

4. 加入 3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入 1ml（1/3）的氯仿，振荡。

5. 冰浴 10min。4℃，12000g离心 10min

6. 小心转移上清于另一离心管中，加入 2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少 1小时。

7. 4℃，12000g离心 20min。

8. 去上清，取沉淀。加 1ml 4M 的 LiCl 溶解沉淀（1mlLiCl/g 组织），并转入 1.5ml离心

管中。

9. 4℃，13000rpm离心 15min。

10.用 0.4ml DEPC 水溶解沉淀，加 1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。

11.4℃，13000rpm离心 10min。

12.取上清，加 1/10 体积的 3MNaAc（ph5）和 2 倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀 30min

以上。

13.4℃，13000rpm离心 15min。

14.弃上清，用 1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm离心 10min。

15.弃上清，取沉淀，空气中干燥 RNA沉淀，直至无乙醇味。

16.用 40－60ul DEPC 水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。

17.取少量 RNA用于测定 OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。

4. TRIzol Reagent 提取 total RNA(GIBCO)

1． 查表 2 根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入 50ml RNase-free 离心管中， 注意样品体积不能超过 TRIzol Reagent 体积的 10%。

2． 将组织样品放入 TRIzol Reagent 中，高速下匀浆 15-30秒/次，直至看不见组织和细胞 碎片。

3．室温温育 10分钟 。

4． 据表 2 加入适量体积的氯仿，剧烈震荡 15秒钟，然后室温下温育 3分钟。

5． 4oC，12000g 离心 15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相 约占 TRIzol体积的 60%。

6． 转移上清于另一个 Rnase-free 的 50ml离心管中。根据表 2加入适量异丙醇，-20oC沉 淀 1小时以上。

7． 4oC,12000g离心 10分钟。

8． 去上清，据表 2加入适量体积的 75%的乙醇混匀。

9． 4oC，7500g 离心 5分钟。

10． 去上清，空气中干燥或真空抽干 RNA 沉淀，但不要太干。加入适量体积的 DEPC-WATER,溶解沉淀。

11． 取少量 RNA用于测定其 OD值和电泳，其余置-80oC冰箱中保存。

表 2

组织量 TRIzol Reagent 氯仿 异丙醇 75%乙醇

50~100mg 1ml 0.2ml 1ml 1ml

二.mRNA 的分离

1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法

准备工作：

1.将 Oligotex Suspension 置于 37℃水浴中，旋转混匀，溶解 Oligotex.,然后置于室温。

2.将 OBB Buffer置于 37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。

3.将 OEB Buffer 置于 70℃水浴中，待用。

试验步骤：

表 3：加入试剂量据此表

Total RNA RNase-free

Water to: Buffer OBB

(ul)

Oligotex

Suspension

(ul)

Prep size

<=0.25mg 250ul 250ul 15 Mini

0.25-0.5mg 500ul 500ul 30 Midi

0.5-0.75mg 500ul 500ul 45 Midi

0.75-1.00mg 500ul 500ul 55 Midi

1. Total RNA 量不要多于 1mg，用移液器取出所需 RNA 量到 1.5ml 离心管中，加

RNase-free water 补足到 500ul

2. 根据表 3加入适当体积的 OBB Buffer和 Oligotex Suspension，轻弹 1.5ml离心管

彻底混匀

3. 置于 70℃水浴中 3min

4. 取出置于室温（20℃－30℃）10min

5. 13000rpm 室温离心 2min，用移液器吸出上清到一个新的 1.5ml 离心管中，保留

上清直到 polyA 被结合上。

6. 用移液器取 400ul OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到 Spin Column 中，

RT ，13000rpm，离心 1min

7. 将 Spin Column 转移到一个新的 1.5ml 离心管中，加 400ul OW2，RT，

13000rpm，离心 1min

℃到

8. 将 Spin Column 转移到一个新的 1.5ml 管中，取出 25ulOER Buffer(70)

Column 中，用移液器吹打 3－4次树脂，室温 13000rpm，离心 1min。

℃到 Column 中，用移液器吹打 3－4 次树脂，室温

9. 取出 25ul OER Buffer(70)

13000rpm，离心 1min。

10.测 OD,并电泳定量。

2.磁珠法分离 mRNA

1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为 500ul.

2. 65oC加热 10分钟。

3. 加入 3ul生物素标记的 Oligo(dT)和 13ul20×SSC于 RNA 中，轻轻混合，室温放置逐渐 冷去至室温，一般需 10 分钟左右。

4. 同时配 0.5×SSC 1.2ml和 0.1×SSC 1.4ml.

5. 将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使 SA-PMPs 集中于管的一侧（约 30sec）， 小心去上清， 切不可离心。 用 0.3ml 0.5×ssc 漂洗 SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠， 去除上清，重复 3 次。

6. 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内 使用。

7. 将（3）中的 oligo(dT)/mRNA 退火反应物全部加入含漂洗好的 SA—PMPs 管中，轻轻 摇匀，室温下放 10 分钟。

8. 用磁性分离架捕获 SA-PMPs,小心去上清，但不要弃去。

9. 用 0.1×SSC,每次 0.3ml洗 3次，每次都晃至 SA-PMPs 悬浮，最后一次漂洗后尽可能多

的吸取水相，而不损坏 SA-PMPs.

10.将 SA-PMPs 重新悬浮在 0.1ml RNase-free 水中，反复颠倒，使 SA-PMPs 散开，洗脱

mRNA。

11.用磁性分离架捕获 SA-PMPs,将洗脱的 mRNA 吸入另一个新的 Eppendorf管中。

12.将 SA-PMPs 再悬浮于 0.15ml RNase-free 的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。

13.将得到的 mRNA溶液取几微升跑电泳，若 mRNA 浓度不足以进行下一步的反转录，则

需将得到的 mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见 14-18）。

14.加 0.1体积的 3mol/l NaAc 和 1.0 体积的异丙醇于洗脱液中，-20oC沉淀过夜。

15.4oC，13000g离心 60 分钟。去上清，加入 500ul 70%乙醇混匀。

16.4oC，7500g 离心 10 分钟。

17.去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量 RNase-free 水溶解。

18.重复步骤 5-12，将步骤 8保留下的样品重新上柱

注意事项：

1．所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行

2．如果 total RNA 质量高，杂质少，就选择 Oligotex的方法分离 mRNA，相反则可以用 磁珠法。

3．mRNA 的电泳图是 smear。

三．cDNA双链合成

1. Superscipt II—RT 合成第一链:

1. 在一 RNase-free 的 0.2ml PCR 管中,加入

xul mRNA(大约 500ng)

1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)

(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)

11-x ul RNase-free water

（大于 500ng mRNA 分 n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将 n管合成 一管进行第二链合成.）

2. 混匀后,70℃反应 10分钟?

3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上 5min?

4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:

4ul 5×first strand buffer

2ul 0.1M DTT

1ul 10mM dNTP(自己配制)

5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置 2分钟?

6. 反应完成,趁热加入 1 ul Superscipt II—RT,混匀?

℃分钟灭活反转录酶.

7. 42℃反应 50 分钟,然后 70,15

2. cDNA 第二链的合成:

1. 第一链反应完成后,取 2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并， 混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):

20ul 10×DNA Polymerase I buffer

6ul 10mM dNTP(自己配制)

xul dd H2O

1ul RNase H(2U/ul)

10ul DNA Polymerase I(10U/ul)

总体系为 200ul?

2. 混匀后,16℃反应 2.5小时?

3. 70℃灭活 10 分钟?

4. 反应完成后,得到 200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上?

5．取 2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上 1kb ladder，确定双链的大 小范围。

注：一链，二链的电泳图是 smear，且二链稍比一链大一些。

3. 双链 cDNA末端补平:

1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):

6ul 10mM dNTP

2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)

2ul BSA(10mg/ml)

2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少 30分钟,然后 75℃灭活 10分钟?

3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下 13000g离心 5分钟?

4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温 下 13000g离心 5分钟?

5. 吸取上清至另一 eppendof 管,加入 1/10V3M NaAc(PH5.2)和 2.5V 预冷的无水乙醇,混 匀,-20℃放置过夜以沉淀双链 cDNA?

℃离心 60分钟以充分沉淀双链 cDNA?

6. 第二日,将昨日沉淀物在 4,13000g

7.离心完毕,弃上清,加入 1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下 13000g离心 5分钟?

8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.

注：第 3，第 4步可以用 PCR 纯化试剂盒代替。

PCR 纯化试剂盒操作流程：

1．溶液 PE 使用前应加入适量体积 95％－100％的乙醇，混匀。

2．向 200ul二链补平产物中加入 5倍体积的 buffer PB，混匀。

3．加入 spin column 中，13000rpm离心 1min。

4．加入 0.75ml buffer PE，13000rpm离心 1min。

5．13000rpm，再离心 1min。

6．将 spin column 放入一新的离心管中，加入 50ul buffer EB，静置 10min。

7．13000rpm离心 2min。

8．加入 30ul buffer EB，静置 10min。

9．13000rpm离心 2min。

10．加入 1/10体积 3M 的 NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。

4 EcoR I adaptor 加接:

1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解 cDNA 沉淀?

2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:

1.2ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)

3. 混匀后,4℃连接 3days,或者 8℃过夜连接?

5 双链 cDNA 末端的磷酸化及 Xho I 酶切:

1. 连接反应完成后,将反应体系 70℃放置 15 分钟灭活 T4 DNA Ligase?

2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置 5 分钟,然后加入下列试剂:

1ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

6ul dd H2O

1ul T4 PNK(10U/ul)

3. 37℃反应 30 分钟,然后 70℃灭活 15分钟?

4. 稍微离心使反应物集中至管底?

5. 室温放置 5 分钟?然后加入下列试剂:

4ul Xho 10×Buffer

2ul BSA

5ul ddH2O

8ul Xho I (10U/ul)

6. 37℃反应 1.5小时,然后 65℃灭活酶 10 分钟?

7. 反应完成,双链 cDNA合成完毕。置于 4℃准备回收。

6.胶回收 cDNA(QIAEXII GEL Extraction Kit 回收试剂盒)

1． 配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶

2． 取 4℃保存样品上样，40ul/孔。

3．电泳 50V；1hr

4．紫外灯下分别切下 500~1kb、1.0-2.0kb及 2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的 1.5ml离心管中。

5． 称取胶重，加入三倍体积 buffer QXI（例如，100mg 胶中加入 300ul buffer QXI） 6． 50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入 5ul QIAEXII

7． 50℃ 水浴 10min，每隔 2min 取出颠倒混匀数次，使 QIAEX II 保持悬浮

8． 4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）

9． 加入 500ul buffer QXI，轻弹管底使 QIAEX II 重悬

10． 离心并去上清（同操作 8）

11． 加入 500ul buffer PE，重悬 QIAEX II，离心 30sec，去上清

12． 再加入 500ul buffer PE，重悬 QIAEX II，离心 30sec，弃上清，离心机中甩一下， 吸去上清

13． 超净台上吹干 （至无乙醇味）， 加入 10ul elution buffer， 重悬 QIAEX II， 静置 5min， 13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。

14． 取 1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及 DNA含量标准（10ng， 20ng）作对照。

15． 将收回的 cDNA 置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量 DNA 进行连接。

注意事项：

1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用 1％的 HCl浸泡过夜。

2．胶回收时电压要稳定。

四．载体制备

1．pBlueScriptII 的提取

1．取 1ul商品的 pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取 5ul转化产物均匀涂布在含 AMP的 LB 平板上，37℃培养过夜。

2．第二天取一只无菌的 50ml离心管，加入 10ml AMP抗性的 LB 液体培养基，挑单克隆

于离心管中，37℃，250rpm，培养过夜。

3． 第三天取 200μl小摇后的菌液接种于 250ml 含 AMP的 LB液体培养基中， 37℃， 250rpm 培养 6 hr左右，使 OD值达到 0.6-0.8。

4．将菌液移入 250ml离心管中， 4℃，3000rpm，离心 15min。取出离心管，菌团朝上倒 掉上清，将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。（注意离心前需配平）

5．加入 10ml溶液Ⅰ（50mM Glucose ， 25mM Tris-HCl，10mM EDTA， pH8．0），加 入 RNase至终浓度 100μg/ml，晃动摇菌，使菌体充分悬浮，静置 10min。

6．按 NaOH（0.4N）：SDS（2%）--1：1的比例新鲜配制溶液Ⅱ，加入 20ml溶液Ⅱ，静 置 3-5min。

注： 静置时间勿超过 5min，提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。

7．加入 15ml冰浴的溶液Ⅲ，冰浴 15-30min。

8．4℃，5000rpm，离心 15min。

9．取上清于两个 50ml离心管中，弃去原离心管中的沉淀。

10．每管加入 0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，室温下放置 10min。

11. 20℃，12000g，离心 20min 回收质粒沉淀。

12．弃上清，用 70％的乙醇洗 2次。

13．弃上清，倒扣于吸水纸上，尽量空干液体。

14．用 3ml TE（pH8.0）溶解沉淀，移入 1.5ml Eppendorf离心管中。

15．电泳检查 DNA质量并定量。（必要的话，可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行 双酶切。）

2．pBlueScriptII 的双酶切消化

1．以如下体系进行 EcoRI 酶切：

pBSK(+) X μl（6μg）

ddH2O 174-X μl

10×Buffer E 20 μl

混匀，加入限制性内切酶：

EcoRI （10U/ μl） 6 μl

总体积为 200 μl。

2．轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

3．37℃，水浴 1hr。

4．加入 200ul 1:1 的酚/氯仿，混匀。4℃，13000rpm，离心 15min。

5．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心 10min。

6．取上清，加入 0.1倍体积的 NaAC和 2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀 30min。 7. 4℃，13000rpm，离心 10min，弃上清，取沉淀。

8．加入 200ul 70％的乙醇洗沉淀。

9．4℃，13000rpm，离心 10min，弃上清，取沉淀。

10．自然风干沉淀，至无乙醇味，加入 100ul ddH2O充分溶解沉淀。

11．加入以下试剂进行 XhoI 酶切：

ddH2O 74 μl

10×Buffer D 20 μl

混匀，加入限制性内切酶 XhoI：

XhoI （10U/ μl） 6 μl

总体积为 200 μl。

12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下

13.37℃，水浴 1.5hr。

14．加入 200ul 1:1 的酚/氯仿，混匀。

15．4℃，13000rpm，离心 15min。

16．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心 10min。

17．取上清，加入 0.1倍体积的 NaAC和 2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀 30min。

18. 4℃，13000rpm，离心 10min，弃上清，取沉淀。

19．加入 200ul 70％的乙醇洗沉淀。

20．4℃，13000rpm，离心 10min，弃上清，取沉淀。

21．自然风干沉淀至无乙醇味，加入 40ulddH2O 充分溶解沉淀，得到双酶切载体。 3．载体去磷酸化

1．在 40ul双酶切载体中加入以下试剂：

6ul 10×buffer

6ul CIAP（0.01U/ul）

8ul ddH2O

总体积 60ul。

2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

3.37℃，水浴 1hr。

4．70℃，15min，灭活酶。

5．电泳分离，胶回收双酶切载体，定量。

4．载体效率检测

1． 按以下所示作 4个连接反应：

DNA 连接酶

1 pBlueScriptII/E/X /CIAP - 检测酶切效率

2 pBlueScriptII/E/X /CIAP + 检测脱磷效率，载体自连效率

3 商品Vector加标准Insert + 对照

4 自制Vector加标准Insert + 检测载体效率

14℃连接过夜。

2． 各取 1ul连接产物作电转化（具体流程见电转化）

3． 计算克隆数，计算载体相对脱磷效率及连接效率。

五.cDNA双链和载体的连接：

1.连接：

根据载体和 cDNA的电泳定量结果，每个样品设置 3 个比例的连接，

即：insert/vector=1/3 incert/vector=1/1 insert/vector=3/1

按以下体系依次加入：

ddH2O xul

T4 ligase 10x buffer 1ul

PBK(E/X)vector(20ng/ul) 1ul

cDNA (由浓度及连接比例而定)

T4 DNA ligase(3U/ul) 1ul

Total 10ul

14℃，连接过夜

2．检测：（PCR 方法）

取适量 PCR 薄壁管，置于冰上，按以下体系依次加入：

连接产物 insert vector 阳性对照 阴性对照（H20）

模板： 1 1 1 1 1

10xbuffer 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

Mgcl2(25mM) 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8

DNTP(2.5mM) 1 1 1 1 1

T3 引物（10pmol） 1 1 1 1 1

T7 引物（10pmol） 1 1 1 1 1

Taq 酶 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

ddH20 16.3 16.3 16.3 16.3 16.3

total 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul

各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于 PCR 仪上

℃分钟

反应程序： 94 4

94 20

℃秒

℃秒 35个循环

53.6 20

72℃ 4分钟

72 10

℃分钟

℃小时

4 24

待 PCR反应进入 4℃后，取下 PCR薄壁管，取 7ulPCR 产物加入 3ul溴芬兰跑电泳，同时 上 1Kb DNA ladder

半小时后照相，观察胶图：insert、vector、阴性三个样品除了有少量引物带（大约在 200bp 左右）外，均无其他带形。阳性带形清晰。好的连接产物应在 500

至 4、5Kb大小之内形成一条清晰的 smear。

六．电转化流程

1．电转化感受态细胞的制备

1. 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有 10ml LB 液体培养基的 50ml离心管中。（同时做培 养基和枪头的空白对照）

2. 37℃，220rpm，培养 14-16个小时。

3. 第二天， 以 1： 100的比例将这 10ml菌液倒入 1000ml LB 液体培养基中， 37度， 220rpm， 振摇 2-3小时，每半小时测一次 OD，当 OD值达到 0.3-0.4时，停止培养。

4. 将菌液在冰上预冷 30分钟， 随后将菌液分装到 500ml 预冷的离心杯中， 4℃， 2500rpm 离心 10 分钟。

5. 弃上清， 离心杯中加入少量 ddH2O， 使沉淀悬浮后， 再将水注满离心杯， 4℃， 4000rpm 离心 10 分钟。

6. 弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心 10min。

℃ 7. 弃上清， 往离心杯中加入少量 10%甘油(灭菌， 预冷)， 重悬菌体， 再加满 10%甘油, 4, 4000rpm, 离心 10min。

8. 弃上清，每个离心杯中加入 5ml10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以 300ul/管分装于 1.5ml的离心管中，-80℃冰箱中保存。同时取 100 μl感受态加 0.01ng puc18 直接电穿孔 转化，检测转化效率。

9. 次日观察转化子生长情况，并记录。

2．连接产物纯化

1．将连接产物转移至一 1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂:

10ul of ddH2O

2ul of 3M NaAC（PH5.2）

50ul of 无水乙醇

轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置 1小时以上；

2.4℃，top Speed 离心 30分钟；

3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；

4.加入 500ul70％的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；

5.4℃，top Speed离心 5 分钟；

6.小心移去上清，将此 Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味；

7.加入 10ulddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用；

3.电转化

1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；

2. 取 1 μl 纯化后的质粒于一 1.5ml的离心管中， 将其和 0.1CM 的电极杯一起置于冰上预 冷。

3. 将 40～100ul 解冻的感受态细胞转移至此 1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置 10min。

4. 打开电转仪，调至 Manual，调节电压为 2.1KV。

5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底 部；

6. 将电极杯推入电转化仪，按一下 pulse 键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入 1000μl 的 SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到 1.5ml的离心管中。

7．37℃，220－250rpm复苏 1小时。

8. 取 20ul 转化产物加 160ulSOC 涂板，放于 37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。 其余菌液加 1：1的 30％的甘油后混匀－80℃保存。

注：每块加有 Amp的平板上均匀涂有 X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。

4.电击杯清洗流程

1． 用清水将电击杯稍冲一下。

2． 向电击杯中加入的 75%酒精浸泡 2hr。

3． 弃去酒精，再用蒸馏水冲洗 2~3遍，然后用 1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯 10遍 以上。

4． 加入无水乙醇 2ml于电击杯中，浸泡 30 分钟。

5． 弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。

6． 将清洗好的电击杯放入-20℃冰箱内待用。

注：1．不同样品使用的电机杯应分开；

2．每周用 1％酒精浸泡 30分钟。

七．快速鉴定、菌落 PCR

1．质粒快速鉴定

试剂：

Protoplasting buffer:

30mM Tris-HCl, pH8.0 0.33ml/1.0M

5mM EDTA 0.1ml/0.5M

50mM NaCl 0.1ml/5.0M

20% Sucrose 5ml/40%

50μg/ml RNAseI 50ul/10mg/ml

50μg/ml lysozyme 50ul/10mg/ml

补水至 10ml，-20℃分装保存。

Lysis buffer:

89mM Tris-HCl, pH8.0

89mM boric acid 2ml of 5×TBE

2.5mM EDTA

2% SDS 2ml of 10%

5% sucrose 1.25ml of 40%

0.04% bromphenol blue 4mg

补水至 10ml，-20℃分装保存。

步骤：

1．将转化后的菌液铺平板，37℃过夜培养。

2．配制 0 .6--0 .7%的琼脂糖 TBE 胶。

3．用连续加样枪在 96孔板中每孔加入 10 μl Photoplasting Buffer。

4．用灭过菌的 10ul小枪头挑取单克隆白斑至含有 Photoplasting Buffer 的 96孔板中，振 荡混匀。

5．用连续加样枪将 Lysis Buffer上样于凝胶中，每孔 4 μl，用排枪将细胞与 Protoplasting buffer混合液上样于凝胶中（细胞在 Protoplasting buffer中不宜超过 30-40 min），并点上 Marker。

6．调节电压为 20V（小槽）或 40V（大槽），电泳 15min，使细胞充分裂解，将电压调高 到 200V，继续电泳 1hr，照相。

7．根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。

2．菌落 PCR

1．取适量 PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入 17.3ul的灭菌水。

2．用灭过菌的 10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。

3．依次加入：

10xbuffer 2.5

Mgcl2(25mM) 1.8

DNTP(2.5mM) 1

T3 引物（10pmol） 1

T7 引物（10pmol） 1

Taq 酶 0.4

total 25ul

各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于 PCR 仪上

4．94℃，2min。

5． 94 4

℃分钟

℃秒

94 40

℃秒 35个循环

53.6 40

℃分钟

72 4

℃分钟

72 10

℃小时

4 24

6．待 PCR 反应进入 4℃后，取下 PCR 薄壁管，取 7ulPCR 产物加入 3ul溴芬兰跑电泳， 同时上 1Kb DNA ladder。半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及 小片段率。

7．将快速鉴定和菌落 PCR 检测合格的文库送检。

八．pBlueScript cDNA 库扩增

1．试剂及配方：

2 x LB （1升）：

20g 氯化钠

20g 蛋白提取物

10g 酵母提取物

加入蒸馏水至 1升，用 NaOH调 pH值至 7.0，高压灭菌

2 x LB－甘油（12.5%）（200ml）

175ml 2 x LB 液体

25ml 甘油（100％）

加入蒸馏水至 200ml，压灭菌，置于 4℃备用

2．步骤

1． 将 cDNA文库转入大肠杆菌，如 DH5a(DH10B)后，取少量菌液涂布氨苄平 板，以推算克隆总量。

2． 取一大小合适的三角瓶,根据克隆总量配制 2 x LB 液体， 每 500ml 2 x LB 液 体可扩增 5x105 个克隆，可以适当增加 2 x LB 液体的量，但不能少于此比例

3． 按每 100ml加 0.3g的比例在 2 x LB 液体中加入 SeaPrep agarose

4． 70℃加热搅拌至琼脂糖溶解,高压灭菌后再 70℃搅拌 30 分钟.

5． 37℃放置 1 小时

6． 加入适量安苄青霉素,使之终浓度为 50ug/ml

7． 加入全部菌液,并轻柔旋转使之混匀,避免振荡

8． 将三角瓶置于冰水中 1小时,水面必须没过三角瓶内液面

9． 轻轻取出三角瓶,30℃培养 40-45小时

10.将三角瓶内容物全部转入离心管中,离心 10,000g ,20分钟,必须室温

11.弃上清,每 100ml培养基离心得到的沉淀用 10ml 2x LB－甘油（12.5%）重悬.

12.将重悬液留下 10ul检测滴度,其余分装于 1.5ml离心管,-80℃冰箱内保存

13.取 1ul扩增后菌液倍比稀释.

14.各取10ul 稀释为10-5和10-6的菌液涂布于含安苄青霉素的LB固体平板上,37℃过夜培 养,次日计算其克隆数以及扩增后总克隆数.