植物体内游离脯氨酸含量的测定
植物体内游离脯氨酸含量的测定
一,原理
当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加.植株体内脯氨酸含量在—定程度上反映了植株体内的水分情况,因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标.
用人造沸石在pH 1~7 范围内振荡溶液,可除去干扰的氨基酸或使不与茚三酮反应(如甘氨酸,谷氨酸,天冬氨酸,丙氨酸,缬氨酸,胱氨酸,苯丙氨酸,精氨酸等),脯氨酸与茚三酮试剂呈显色反应,其含量与颜色深浅成正相关,可用分光光度计测定.此法有专一性.
二,实验材料,试剂与仪器设备
(一)实验材料
植物叶片.
（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。
（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。
三、实验步骤
1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，
2.0，2.5及
3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。
2. 样品的测定（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm 下离心5min。（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。
四、结果计算
根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：
脯氨酸含量（μg/g）＝[X×5/2]/样重（g）。
PSCS提取与活性测定
样品加3倍体积提取缓冲液(W/V)于冰浴中研磨，提取缓冲液为0．1 mol／L 的Tris-HC1(pH7.5)、内台巯基乙醇10 mmol／L，Mgc12 10mmoL／L、PMSF 1 mmol／1 提取液10 000 g离心15 min，取I5％-35％饱和度(NH4)2SO4沉淀，溶解于提取缓冲液中，透析后用于测酶活性。反应混合液为50 mmol／L的Tris-HC1，内含MgCl2 2mmol／L，ATP 10mmol／L，NADPH 1 mmo1／L，Glu 50 mmoI／L，加入0 5 ml酶液，调pH 至7～7．5．35℃下反应30 mln，TGA终止反应。上清液加等体积邻氨基苯甲醛试剂，35℃染色1 h，435 nm比色，以0．5△d435 g-1FW h -1为一个酶活力单位(1 u)。
ADC和ODC的提取与活性测定
酶液提取和部分纯化见赵福庚等(1996)。反应混合液为100 mmol／L的Tris HC1(pH 7．5)，内含EDTA 5 mmoI／L、磷酸吡哆醛40 pmol／L．DTF 5 mmol／L．0 3 ml酶提取液。测ADC和ODC活性时
分别加入底物0．2 rrd 25 mnml／L的Arg或Om，
37 下反应60min，加入高氯酸至终浓度5％，离心
取上清液，加入2倍体积2 mol／L的NaOH，混合后
加人10“l苯甲酰氯，涡悬后室温下放置60 min，
加人2 ml饱和NaC1，混合后加入2 ml乙醚．收集1
ml醚相于5o 蒸干，溶于3 ml重蒸甲醇中，254 nm
比色，以I~Azsa g 阿h 为一个酶活力单位(1
U)。