聚合酶链反应
核酸扩增
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)由美国Centus公司的Kary Mullis发明，于1985年由Saiki等在Science杂志上首次报道，是近年来开发的体外快速扩增DNA的技术。通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中以体外扩增的方式获得大量特定的核酸，并且有很高的灵敏度和特异性，可在动物检
疫中用于微量样品的检测。
1. PCR的基本原理和过程PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸存在的条件下依赖于耐高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR以欲扩增的DNA做为模板，以和模板正链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸做为引物，经过模板DNA变性、模板引物复性结合、并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。模板DNA变性、引物结合(退火)、引物延伸合成 DNA这三步构成一个PCR循环。每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板 DNA。这样，目的的DNA的数量将以2n -2n的形式累积，在2小时内可扩增30(n)个循环， DNA量达原来的上百万倍。PCR三步反应中，变性反应在高温中进行，目的是通过加热使DNA双链解离形成单链；第二步反应又称退火反应，在较低温度中进行，它使引物与模板上互补的序列形成杂交链而结合上模板；第三步为延伸反应，是在4种dNTP底物和Mg2+ 存在的条件下，由DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链的延伸反应。通过高温变性、低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。对扩增产物可通过凝胶电泳、
Southern杂交或DNA序列分析进行检测。
反应条件和反应系统的组成
(1) 反应条件PCR反应通过三种温度的交替循环来进行，一般94℃变性30秒，55℃退火 30秒，70-72℃延伸30-60秒，依此条件进行30次左右的循环。(2) PCR反应系统的组成标准的PCR反应体系一般选用50-100μl体积，其中含有：50mmol/L KCl，10mmol/L (室温，，L MgCl2明胶或牛血清白蛋白(BSA)，2种引物，各(mol/L，4种脱氧核糖核苷酸底物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)各200( mol/L，模板 DNA (g，TaqDNA聚合酶。
基本操作一个典型的PCR反应可按以下步骤进行:
(2) 置94℃加热5分钟；
(3) 将μl Taq DNA聚合酶(5iu/μl)加入反应混合液中；
(4) 将100μl轻矿物油加入混合液表面，以防水分蒸发；
(5) 按所设定的反应条件进行循环反应（在PCR仪上进行）；
(6) 反应终止后，取样品进行凝胶电泳，Southern杂交或DNA序列分析以鉴定是否得到特异的扩增产物。
衍生技术PCR可扩增双链DNA和单链DNA，并能以RNA为模板，进行反转录PCR 以扩增cDNA。经不断发展和完善，已有多种衍生PCR技术。除反转录PCR外，尚有不对称PCR、反向PCR、锚定PCR、多重PCR、着色互补PCR、免疫PCR和套式PCR等。
(1) 反转录PCR(reverse transcription PCR，RT－PCR) RT－PCR用于扩增RNA 样品。在PCR体系中先引入反转录酶，将RNA反转录获得cDNA，再以cDNA做为PCR的模板，加入引物和Taq DNA聚合酶按正常PCR方式扩增 cDNA。这一技术广泛应用于RNA和RNA病毒的检测。
(2) 锚定PCR(Anchored PCR) 通常进行的PCR试验必须知道欲扩增DNA或RNA 片段两侧的序列，并以此为依据设计引物进行PCR。当欲扩增的片段序列未知时，可通过锚定PCR进行扩增。其基本方法是分离细胞总RNA或mRNA并经反转录合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA 3’端加上同源多聚物poly(dG)尾，通过与其互补的锚定引物poly(dC)来保证扩增反应的特异性。
(3) 反向PCR(Inverse PCR) 常规PCR是扩增两个已知序列之间的DNA片段，反向PCR则用于扩增位于已知序列两侧的一段未知序列。方法是使含已知序列和未知序列的DNA片段环化，再用限制性内切酶切开已知序列，这样线性化后原位于已知序列两侧的未知序列变为位于已知序列之间，再经常规PCR操作就可大量扩增未知序列。
(4) 不对称PCR(Asymmetric PCR) 不对称PCR又称单链扩增PCR。一般PCR反应中两种引物的量是相等的，不对称PCR中，两种引物的量相差悬殊，一般为50:1-100:1，这样在生成一定数量的双链产物后，较少的引物就会被用完，大量生成一条单链的DNA，分离单链即可直接进行序列分析等研究。
(5) 多重PCR(Multiplex PCR) 应用PCR技术可检测特定序列的存在或缺失。某些疾病的基因片段较长，且常有多处发生缺失或突变，用一对引物进行PCR 检测时，扩增不到目的片段，此时就须使用多重PCR技术。在同一反应管中加入多对引物，扩增同一模板的多个区域。如果某一片段缺失，或扩增该片段的引物与被检核酸同源性太低，则在相应的电泳图谱上就无相应的正常片段出现，但可保证其他特异片段出现。目前报道的多重PCR反应，最多可同时扩增12条区带。当然，也可设计两对引物，分两次进行常规PCR。
(6) 着色互补PCR(Colour complementation assay) 着色互补PCR又称荧光PCR(Fluroscent PCR)。其原理是用不同的荧光染料分别标记不同的寡核苷酸引物，通过多重PCR同时扩增多个DNA片段。反应结束后除去多余引物，扩增产物在紫外线照射下能显示某一种或几种荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色。通过颜色的有无及其组合可很快诊断基因的缺失、有较大变异或发现某些感染的病毒基因等。这一技术为PCR技术的临诊自动化诊断打下了基础。
(7) 免疫PCR 免疫PCR即免疫多聚酶链反应(Immuno－PCR)，它是将高度灵敏的PCR技术与特异的免疫学方法相结合的一种新型的诊断技术，是目前最有希望的诊断方法。它的原理是通过应用一个对DNA和抗体具有双重结合活性的联接分子使二者联接起来，这样就可以使作为指示系统的DNA分子通过抗体而特异性地结合到抗原上，从而形成一种特异性“抗原－抗体－DNA复合物”，再通过对其中已知片段DNA的PCR扩增，即可证明抗原存在与否。这种方法的特点在于：① 通过免疫捕获作用纯化检测对象；② 用于检测的微生物无需事先明确其核酸序列；③ 该方法也适用于微生物以外的抗原检测，其前提条件是被检测对象具有良好的抗原性，并且备有其相对应的抗体；④ 无需根据不同对象设计不同的引
物。被联接的已知片段DNA相当于指示剂，无论检测对象是什么，只需合成针对这段DNA的引物即可；⑤ 省去了普通PCR实验检测RNA病毒的反转录过程，即增加了灵敏度又降低了实验成本。这项技术的发明者Sano，T.(1992)等的试验表明，免疫PCR的灵敏度比ELISA方法高10万倍，足以检测出单个抗原分子。
(8) 套式PCR(Nested PCR) 普通PCR的产物DNA往往需要再扩增，以便对之进行进一步鉴定、分子克隆或用作其他用途。此时，由于DNA产物的末端效应，用原来的那对引物难以实现再扩增的目的。如果在原来的引物内侧重新设计一对引物，再进行新一轮PCR，则很容易获得更大量的DNA产物。如果需要，还可再进一步扩增，但每次需要在上一次产物的内侧重新设计引物。这种采用多对成套引物，逐步扩增DNA内侧片段的PCR就称为套式PCR。目前很多分子生物学实验室为了各自的研究需要都在应用这一技术。
技术的用途
(1) 传染病的早期诊断和不完整病原检疫在早期诊断和不完整病原检疫方面，应用常规技术难于得到确切结果，甚至漏检，而用PCR技术可使未形成病毒颗粒的DNA或RNA或样品中病原体破坏后残留核酸分子迅速扩增而测定，且只需提取微量DNA分子就可以得出结果。
(2) 快速、准确、安全检测病原体用PCR技术不需经过分离培养和富集病原体，一个 PCR反应一般只需几十分钟至2小时就可完成。从样品处理到产物检测，一天之内可得出结果。由于PCR对检测的核酸有扩增作用，理论上既使仅有一个分子的模板，也可进行特异性扩增，故特异性和灵敏度都很高，远远超过常规的检测技术，包括核酸杂交技术。PCR可检出 fg水平的DNA，而杂交技术一般在pg水平。PCR技术适用于检测慢性感染、隐性感染，对于难于培养的病毒的检测尤其适用。由于PCR操作的每一步都不需活的病原体，不会造成病原体逃逸，在传染病防疫意义上是安全的。
(3) 制备探针和标记探针PCR可为核酸杂交提供探针和标记探针。方法是：① 用PCR直接扩增某特异的核酸片段，经分离提取后用同位素或非同位素标记制得探针。② 在反应液中加入标记的dNTP，经PCR将标记物掺入到新合成的DNA链
中，从而制得放射性和非放射性标记探针。
(4) 在病原体分类和鉴别中的应用用PCR技术可准确鉴别某些比较近似的病原体，如蓝舌病病毒与流行性出血热病毒，牛巴贝斯虫，二联巴贝斯虫等。PCR 结合其它核酸分析技术，在精确区分病毒不同型、不同株、不同分离物的相关性方面具有独特的优势，可从分子水平上区分不同的毒株并解释它们之间的差异。此外，PCR技术还广泛应用于分子克隆、基因突变、核酸序列分析、癌基因和抗癌基因以及抗病毒药物等研究中。
技术应用概况从诞生至今约十年的时间里，PCR技术已在生物学研究领域得到广泛的应用。将PCR技术用于动物传染病的检疫研究也日趋广泛。例如，新西兰农渔部质量管理机构所属动物健康实验室(AHLS)负责对各种外来病的疫情监测诊断，该室在1992年建立了几项PCR检测技术，包括从结核病病灶中快速检测牛分枝杆菌；快速检测患病牛羊中副结核分枝杆菌；检测恶性卡它热和新城疫等。自1990年始，将PCR应用于动物传染病的诊断等研究的报道，可归纳如下: (1) 快速诊断各类病毒病用PCR成功进行检测的动物传染病病毒有：蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛白血病病毒、马鼻肺炎病毒、恶性卡他热病毒、伪狂犬病病毒、狂犬病病毒。非洲猪瘟病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马传染性肺炎病毒、马立克氏病毒、牛冠状病毒、鱼传染性造血器官坏死病病毒、轮状病毒、水道猫鱼病病毒、水貂阿留申病病毒、山羊关节－脑炎病毒、梅迪－维斯纳病毒、猪细小病毒等。
(2) 由其它病原体引起的传染性疾病的研究目前已报道的有致病性大肠杆菌毒素基因、牛胎儿弯曲杆菌、牛分枝杆菌、炭疽杆菌芽孢、钩端螺旋体、牛巴贝斯虫和弓形虫等的PCR检测研究。在食品微生物的检测中，PCR技术的应用也日趋广泛。
Hornes等(1991)采用一种固相比色PCR技术成功检测了大肠杆菌热稳定肠毒素(STs)Ia(STIa)和Ib(STIb)基因。
(二) 连接酶链反应在连接酶的作用下两段寡核苷酸能通过形成磷酸二酯键而连接形成较长的核酸片段。连接酶链反应(Ligase Chain Reaction，LCR)技术基
于如下原理：在65℃，由于热稳定连接酶的作用，两段与模板正确杂交的寡核苷酸能连接形成新的较长的核酸片段。通过高温变性、适温退火和连接三步一循环的反应，新形成的靶核酸片段成为下一循环的模板而使反应延续，这样，扩增产物将象PCR一样呈指数递增。
LCR反应体系需采用4个寡聚核苷酸引物，其中两个与模板正链结合，另两个与负链相结合。引物长约15－20bp，故LCR扩增产物长约30－40bp。由于扩增产物较短，循环反应中的变性温度一般应比常规PCR要低。
热稳定连接酶分离自嗜热细菌，它能精确识别与模板正确杂交的寡核苷酸引物。由于碱基误配而杂交上模板的非特异引物将不能起连接反应。与PCR相比较，LCR 中非特异性扩增产物产生的几率很低，有资料表明，经过50－70个LCR循环，非特异性扩增产物未有明显增长，这样，可保证反应的高度敏感性和特异性。LCR已应用于检测人乳头瘤病毒、结核分枝杆菌等病原体。目前，LCR的应用范围远不如 PCR广泛，但LCR与PCR相结合，可有效解决分子生物学研究领域的一些问题，如启动子等小片段核酸的克隆等。
(三) Qβ复制酶技术Qβ复制酶是Qβ噬菌体产生的一种依赖于RNA的RNA 聚合酶。该酶于1963年由 Haruna和Weissmann等人发现并命名。Qβ复制酶能以某些单链RNA为模板，在体外大量复制单链RNA。该酶有严格的模板特异性，能在体外充当Qβ复制酶模板的所有RNA分子均含大量的二级结构，且模板和产物RNA必须能在复制过程中形成稳定的分子内二级结构。
Lizardi及其合作者(1988)发现，在Qβ复制酶的天然模板MDV-1 RNA中插入一段疟原虫(Plasmodium falciparum)的特异序列后，所形成的重组RNA片段仍可做为模板被Qβ复制酶大量扩增。经37℃反应半小时，可在模板含量最低的反应体系(约含1 000个分子)检测到 129ng的重组RNA分子，相当于1亿倍扩增。Qβ复制酶能扩增经过修饰的RNA片段，因此可应用于诊断和检测单链RNA或DNA 序列。
据1992年发表的有关资料介绍，Gene Trak Systems的科研工作者已在用Qβ复制酶开发传染病诊断的技术。其技术要点如下：先用硫氰酸胍处理生物材料(如
血、尿、脑脊髓液)，使 RNA释放出来。由于Qβ复制酶通常不复制欲扩增的特异RNA序列，如HIV－1 RNA；因此，待检材料须再做如下处理，先用一捕获探针(捕获探针与一种磁性小球偶联)通过杂交反应将HIV-1 RNA“钓”出来，随后洗脱其它未结合的RNA分子；将捕获探针和HIV-1 RNA的复合体与插入另一段HIV-1 RNA序列的重组MDV-1 RNA进行温育，重复洗涤除去未与复合体结合的重组MDV-1 RNA，最后加入Qβ复制酶进行扩增反应。Qβ复制酶将只扩增与捕获探针和HIV-1 RNA所形成的复合体相结合的重组MDV-1 RNA，30分钟可扩增106 -107倍。
这一技术不直接扩增欲检测的特异序列，而通过扩增与欲检测RNA分子相结合的MDV-1 RNA来显示前者的存在。因此，它与PCR不同，需先“钓出”欲扩增的特异序列，这样虽增加了处理步骤，但可大大减少非特异性扩增产物。
Qβ复制酶技术尚待完善，但做为一项核酸扩增技术，亦具备可观的应用潜力。
聚合酶链式反应
实验9 聚合酶链式反应（PCR）技术 【实验目的】 掌握PCR反应的原理及操作技术。 【实验原理】 PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。 【器材与试剂】 1．器材 DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统 2．材料 模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。 3．试剂 (1) 10×PCR 缓冲液 (2) MgCl2 15mmol/L (3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L (4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl (5) 引物1和引物2：2 μmol/L (6) 琼脂糖凝胶电泳试剂 【操作步骤】 1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。
ddH2O 7.8 μl 10×PCR 缓冲液 2 μl MgCl2（15mmol/L） 2 μl dNTP（2.5mmol/L） 2 μl 引物1 (2μmol/L) 2 μl 引物2 (2μmol/L) 2 μl 模板DNA 2 μl Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl 总体积20 μl 2．按下述循环程序进行扩增 程序阶段程序名称温度时间循环数 1 预变性94℃ 3 min 1 变性94℃30 sec 2 退火52℃30 sec 30 延伸72℃30 sec 3 保温4℃∞ 1 3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。 【要点提示】 1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95℃下30~60sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。 2．退火温度一般在45~55℃。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。。 3．延伸温度一般在70~75℃。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。
聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用
聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用 聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的发明，并和定点突变的发明者一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。 一、PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 ?C ~95 ?C 退火（annealing）:40 ?C ~70 ?C 延伸（extension）:72 ?C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。 二、PCR的反应体系和反应条件 （一）PCR反应体系 参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。 1 模板 包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。RNA作为模板时，须先将RNA 逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板。模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng? 2、引物（Primers） 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段。引物的 合成可以采用化学方法。引物设计时必须遵循一些原则。 设计引物的原则： 1）二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补 2）长度为18 ~ 25个核苷酸 3）二条引物之间避免形成引物二聚体 4）引物的碱基组成应平衡 5）引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+（C+G）
6）引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记） 3、脱氧核苷三磷酸（dNTP） 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致，浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加 dNTP浓度：20 ~ 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。 4、DNA聚合酶 从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。 Taq 酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。 最适酶量：（酶量过多，导致非特异性扩增） Taq DNA聚合酶复制的保真性，Taq DNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。 耐热的 DNA多聚酶有Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2 ~ 10倍。 5、镁离子浓度 镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响。虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。 当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为L较宜。 6、其它反应因素 pH：调节至酶反应所需的最适pH（ pH =左右） 盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交 基质：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性） （二）PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸）
聚合酶链式反应技术
聚合酶链式反应技术 引言：聚合酶链式反应（PCR）是20世纪80年代后期由K.Mullis 等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术。PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。由于反应循环可进行一定次数，所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。PCR技术具有灵敏度高、特异性性强、操作简便等特点。虽然PCR技术也存在出错倾向高、产物大小受到限制和必须预先有目标DNA序列等缺点，但仍被誉为20世纪分子生物学研究领域最重大的发明之一。Mullis也因贡献卓著而获得1993年度诺贝尔奖。目前，PCR技术已广泛应用于分子生物学的各个领域，在分子克隆、法医学鉴定、DNA序列分析、致病基因的检测及考古学等方面都发挥着重要作用。 操作过程： 聚合酶链式反应用于扩增一小段已知的DNA片断，可能是单个基因，或者仅仅是某个基因的一部分。与活体生物不同的是，PCR 只能复制很短的DNA片断，通常不超过10kbp。DNA是双链分子，因此用互补DNA双链的构造单位（核苷酸）来度量其大小，单位为碱基对（base pair, bp）。某些特定的方法可以扩增40kbp左右的片断，但是这种大小与真核细胞的染色体DNA相比仍然是很少的。例如，人的体细胞DNA含有大约30亿个碱基对。目前应用的聚合酶链式反应需要几个基本组成： 1、DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片断。
2、2个引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。（见下面引物一节） 3、DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。 4、脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于构造新的互补链。 5、缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。 聚合酶链式反应在热循环设备中进行。PCR仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。为防止反应体系中液体产生蒸气，通常在反应管上加盖加热的盖子（比加热板温度来的高），或者在反应体系表面加入一层石蜡油。 引物 特定的引物决定了所扩增的DNA片断。引物是人工合成的短DNA片断，一般不超过50个碱基（通常18－25个），它们与所要扩增的DNA片断的起始和终止区域完全互补。在“黏合”时引物结合于DNA模板的起始和终止点，DNA聚合酶结合到这两个位置，开始合成新的DNA链。 选择引物的长度和熔点（Tm）要考虑许多条件。引物的熔点与聚合酶链式反应第一步中DNA的熔点不同，是指50％的引物与模板结合的温度，高于这个温度引物与模板就不能有效结合。这个温度随着引物长度的增加而升高。如果引物长度太短，就有可能与DNA模板的几个位置结合，造成非特异性复制。另一方面，引物长度也受限于Tm。如果Tm太高，即高于80℃，也会导致问题，因为DNA聚合酶在此温度下活性较低。引物最优长度通常为20到40个碱基，熔
聚合酶链式反应PCR实验报告
实验二聚合酶链式反应（PCR） 一、实验原理 聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物。 二、器材与试剂 1.器材：移液器，EP管，热盖PCR仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫外照色仪 2.试剂：引物，模板，Taq DNA聚合酶，原料（dNTPs），缓冲液与Mg2+，H2O, 2*PCRmix 溶液，DNA染料 三、实验步骤 PCR反应体系的建立 取离心管，依次加入试剂混匀 1．H2O 12μl 2．模板 1μl 3．引物T7 1μl 4．引物 sp6 1μl 5．2*PCRmix 15μl PCR仪的热循环反应 把离心管放入PCR仪中，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成 1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链 或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至56℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3.引物的延伸：经加热至72℃左右DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的 作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复该循环30次，每次需要2-3分钟。 电泳检测结果 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透射，电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示加入的为1号样，出现在500bp左右条带，而预算结果为扩增出492bp条带，故实验成功。
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。 PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物和单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参和下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶--Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于和靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它和引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA和引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物和模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对和半保留复制原理，合成一条新的和模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 反应准备 聚合酶链式反应PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl P-F 0.5ul 4种dNTP混合物（终浓度）各100～250μmol/L P-R 0.5ul 引物（终浓度）各5～20μmol/L Go Taq 酶5ul 模板DNA0.1～2μg模板DNA 0.5ul Taq DNA聚合酶5～10 U H2O 3.5ul Mg2+（终浓度）1～3mmol/L 补加双蒸水100 μl 其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整。 PCR反应五要素： 引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。 PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。 模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制
高中生物聚合酶链式反应技术
高中生物聚合酶链式反应技术2019年3月21日 （考试总分：100 分考试时长： 120 分钟） 一、单选题（本题共计 20 小题，共计 100 分） 1、（5分）下列对于相关实验共性的叙述，错误的是 A．“分离绿叶中的色素”和“胡萝卜素粗品的鉴定”都要用到纸层析法 B．“分离土壤中分解尿素的细菌”和“菊花的组织培养”都要使用琼脂 C．“果酒制作”和“探究酵母菌细胞呼吸方式”都用重铬酸钾检测酒精 D．“分离纯化大肠杆菌”和“分离纯化血红蛋白”都要使用差速离心法 2、（5分）下列关于生物技术应用的叙述，正确的是 A．从酶的固定方式看，物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小 B．作为消化酶使用时，蛋白酶制剂只能以注射的方式给药 C．加酶洗衣粉中酶制剂可以被重复利用，提高了酶的利用率 D．将海藻酸钠凝胶珠用自来水冲洗，可洗去多余的CaCl2和杂菌 3、（5分）下列关于PCR技术的叙述，错误 ．．的是 A．PCR技术的基本原理是DNA双链复制 B．每次循环可分为变性、复性和延伸三步 C．参与PCR的物质有引物、酶、脱氧核糖、模板等 D．一个模板DNA分子第n次循环需要2n-1对引物 4、（5分）平板划线法和稀释涂布平板法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是 A．采用平板计数法获得的菌落数往往多于实际的活菌数 B．平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环连续划在固体培养基表面 C．稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基中进行培养 D．与平板划线法相比，稀释涂布平板法形成单菌落的效果更好 5、（5分）关于电泳的说法不．正确的是 A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C．蛋白质在醋酸纤维薄膜上的移动速度取决于它所带净电荷的多少 D．电泳后需经染色、漂洗和脱色，才可长期保存 6、（5分）下列关于“DNA粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是 A．酵母菌、菜花和猪的成熟红细胞都可作为提取DNA的材料 B．在酒精溶液中，某些蛋白质的溶解度比DNA大 C．在研磨植物细胞时加入洗涤剂是为了溶解DNA D．在50～60 ℃的水浴中，DNA遇二苯胺试剂后即呈蓝色 7、（5分）PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，如图表示合成过程。下列说法错误的是 A．甲过程高温使DNA变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用 B．丙过程用到的酶在高温下失活，因此在PCR扩增时需要再添加 C．如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，循环3次后，在形成的子代DNA 中含有15N标记的DNA占25% D．PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变 8、（5分）下列哪些是进行PCR扩增所必需的条件 A．限制酶 B．DNA连接酶 C．Taq酶 D．解旋酶 9、（5分）下列关于生物工程中常见的几种酶的叙述，正确的是 A．DNA连接酶可把目的基因与载体的黏性末端的碱基黏合，形成重组DNA B．纤维素酶是细胞工程中常用的工具酶，可获得单个动物细胞 C．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA聚合酶 D．纤维素酶和果胶酶处理植物细胞获得原生质体，便于植物杂交育种 10、（5分）“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在P CR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个： A．2 B．4 C．6 D．8 11、（5分）生物产品的分离、纯化是现代生物技术中一种常见的技术。下列关于物质提取、纯化原理的叙述中，不正确的是 A．采用凝胶色谱法分离果胶酶的原理是蛋白质分子的相对分子质量不同，在色谱柱中的移动速度不同B．使用透析法可以去除样品中相对分子质量较大的杂质 C．电泳法是利用样品中各种分子带电性质和数量以及样品分子大小不同，产生的迁移速度不同而实现样品中各种分子的分离 D．离心法分离蛋白质的依据是不同大小的分子离心时沉降速度不同 12、（5分）要将菊花茎段细胞培养成完整的植株，无需 A．选用生长旺盛的嫩枝 B．离体状态并且具有完整细胞核的细胞 C．导入外源基因
临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用 Guidelines for use of polymerase chain reaction (PCR) technique in clinical diagnosis 1范围 本标准规定了临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用准则。 本标准适用于各级，各类的医疗、卫生、保健机构应用PCR技术进行临床诊断。 2定义 本标准采用下列定义。 2.1引物primer 与待扩增靶DNA片段两端互补的寡核昔酸，其本质是单链DNA(ssDNA)，在DNA聚合酶的作用下能进行延伸，从而合成新的互补链。 2.2模板template 待扩增的靶DNA或RNA链，包括人类基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、eDNA和mRNA、 扩增后的DNA产物等几乎所有形式的DNA或RNA。 2.3变性denaturation DNA或RNA由双链转变为单链状态，加热、提高pH或加入甲酰胺、脲等试剂都可使双链DNA或RNA发生变性。 2.4 退火annealing 引物与互补的核苷酸序列在合适的温度下通过氢键形式相互结合的过程。 2.5 延伸 extension 在合适的条件下，由DNA聚合酶（如：Taq酶）催化引导引物DNA链延伸的合成过程。 2.6 污染 contamination 由来源子非待测样品的核酸所引起的一个样品、一系列样品或试剂的非特异性扩增或扩增后在产物分析过程中造成的样品之间的污染，污染通常引起假阳性结果。 2.7 遗留污染 carry-over contamination 同一类靶序列上一次PCR扩增产物对以后扩增反应的后续污染。 2.8 内对照 internal control 在同一反应混合物体系中与待测靶核酸同时进行扩增反应的已知对照物。 2.9 Taq DNA聚合酶 Taq DNA polymerase