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紫草宁生物合成途径中的代谢与调控

1.背景知识介绍

1.1 紫草及紫草宁

紫草（学名：Lithospermum erythrorhizon），为紫草科紫草属植物。又名山紫草、紫丹、紫草根，分布于日本、朝鲜以及中国大陆的辽宁、山西、湖南、甘肃、山东、湖北、广西、四川、陕西、贵州、江西、河北、河南等地，生长于海拔50米至2,500米的地区，多生长在山坡草地，目前尚未由人工引种栽培。紫草是一种重要的药用植物，其功效是凉血，活血，解毒透疹。用于血热毒盛，斑疹紫黑，麻疹不透，疮疡，湿疹，水火烫伤。紫草根部富含红色的萘醌类次生代谢产物——紫草宁及其衍生物。

紫草宁又称紫草素，英文名称：Shikalkin，英文别名：

5,8-Dihydroxy-2-(1-hydroxy-4-methylpent-3-enyl)naphthalene-1,4-dione，即5,8-二羟基-2-[(1R)-1-羟基-4-甲基戊-3-烯基]萘-1,4-二酮，结构式如下：

紫草宁为赤褐色针状晶体(由苯重结晶)。熔点149℃。旋光度-167°±10°(在苯中)。能溶于普通有机溶剂，以及甘油动植物油脂和碱性水溶液。难溶于碳酸氢碱溶液。与氢氧化碱金属作用显蓝色。

由于紫草素具有多种生物学活性，以紫草素为先导化合物开发抗炎、抗肿瘤、抗病毒新药的研究已成为热点课题，除此之外，紫草素还是良好的天然色素，已广泛用于食品、化妆品和印染工业中。

1.2紫草宁及其衍生物的药理作用

1.2.1 抗肿瘤活性

近年来，紫草次生代谢物的抗肿瘤活性倍受关注。紫草素能够抑制肝癌肿瘤细胞增殖[1]、诱导生殖系统肿瘤细胞凋亡[2]，并兼具调控机体免疫的功能。紫草素在体外一定浓度范围内能抑制人白血病Ｋ562细胞增殖，诱导其凋亡。甲基丙烯酰紫草素具有较好的体内外抗肿瘤作用，作用机制可能与诱导细胞凋亡和抑制NF-zB p50的活性有关[3]。乙酰紫草素可通过诱导细胞凋亡来抑制胃癌SGC-7901细胞在体内外的增殖[4]。

1.2.2 抗炎活性

紫草素能有效减轻由中波紫外线（UVB）引起的表皮角蛋白细胞炎症，起到保护皮肤的作用；还可以减弱小神经胶质细胞的炎症反应，达到保护神经系统的作用。

1.2.3 降胆固醇活性

研究发现，从硬紫草根部氯仿提取物中分离出的三种化合物—乙酰紫草素、异丁基紫草素和β-羟基异戊酰紫草素均具有抑制人类酰基辅酶Ａ-胆固醇酰基转移酶-1和人类酰基辅酶Ａ-胆固醇酰基转移酶-2的活性。酰基辅酶Ａ-胆固醇酰基转移酶是胆固醇生物合成途径的关键酶，乙酰紫草素、异丁基紫草素和β-羟基异戊酰紫草素通过抑制该酶的活性，从而达到降低胆固醇含量，防治动脉粥样化的目的。

紫草的药理作用除了上述内容之外，还有降血糖活性，抗生育、抗免疫缺陷、抗凝血、保肝护肝、抗前列腺素生物合成、抗菌及清除活性氧作用等。

1.3紫草及紫草宁的市场

紫草是我国传统中药材，多家中药饮片厂以紫草为主要原料研制开发生产了约500多种（规格）中成药、特药、新型中药，以及几十种中药饮片。这些产品投入市场后很受消费者欢迎，销量增加，对紫草的需求量也随之逐年大幅攀升。

据不完全统计，紫草需求量2000年为100吨，2002-2004年增长至200-500吨，2005-2007年增长至700-1000吨，2008-2009年又增长至1100-1300吨，2010年已增长至1400吨左右。2010年的市场用量是世纪初叶的14倍，创下历史新高。预测今年市场用量将超过1500吨。

然而市场提供的紫草几乎完全是野生品。由于大规模地滥采乱挖，已造成野生资源枯竭，从2001年起野生紫草资源呈逐年减少之势。据不完全统计，2001年野生紫草产量为3000-4000吨左右，2002-2003年下降至1000-1500吨左右，2 006年再降至800吨左右，2009-2010年已降至500吨左右。资源的匮乏抬高了紫草及其提取物的价值，在国际市场上，紫草提取物价格高达每公斤7000美元。

2.紫草宁的生物合成

2.1植物组织培养技术

植物组织培养概念又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。

组织培养能够快速繁殖某些稀有植物或有较大经济价值的植物，利用植物组织培养技术培养紫草细胞来得到紫草素，便是成功的例子。

2.2紫草宁的生物合成途径

紫草素及其衍生物的主要生物合成过程是先由两类重要的代谢，即苯丙素类代谢和甲羟戊酸代谢分别形成两个重要的中间前体—对羟基苯甲酸（PHB）和香叶基焦磷酸（GBB），然后由对羟基苯甲酸香叶基转移酶催化及其它代谢酶的级联反应合成的。该次生产物最初在内质网中形成，然后通过胞外分泌作用将紫草素微粒运输到细胞壁中[5]。两个前体物质—对羟基苯甲酸（PHB）和香叶基

焦磷酸（GBB ）的生物合成分别如下[6][7]：

苯丙氨酸

丙氨酸脱氨酶（PAL ）反式肉桂酸肉桂酸-4-羟化酶（C4H ）

4-香豆酸 4-香豆酸辅酶A 连接酶（4CL ）

4-香豆辅酶A

对羟基苯甲酸（PHB PHB-O-Glu

乙酰辅酶A

乙酰辅酶A 硫解酶（AACT ）+ HMG-CoA 合成酶（HMGS ） β-羟基，β-甲基戊二酰辅酶A （HMG-CoA ）

HMG-CoA 还原酶（HMGR ）

甲羟戊酸（MV A ）

焦磷酸化、脱羧 IPP

二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP ），焦磷酸香叶酯合成酶 GPP

在紫草宁的生物合成过程中，由对羟基苯甲酸香叶基转移酶作用，将甲羟戊

酸代谢途径形成的GPP的香叶酯基转移到来自丙氨酸代谢产物PHB上，形成香叶基-对羟基苯甲酸（GBA），该化合物是生成紫草宁及其衍生物的前几部反应中的重要前体，由它经过几步酶联反应便生成目标产物，其完整步骤整理如下（由文献整理所绘）：

3.紫草宁的代谢与调控

目前，不但基本清楚了紫草宁生物合成代谢的途径，而且还从紫草培养细胞中分离和鉴定了一些与紫草宁合成相关的代谢酶和基因，开展了紫草宁生物合成的毛状根转基因培养体系以及改变或修饰紫草宁生物合成代谢途径、代谢酶基因等的代谢工程研究。本文将结合这些研究成果，介绍一些与紫草宁生物合成相关

的代谢酶和基因的功能和表达特性，以及在实际生产中，是怎样对紫草宁及其次生药物进行生产调控的。

3.1 代谢工程概念

代谢工程是基因工程的一个重要分支，利用重组DNA为主的技术，操纵酶的转移和细胞调节功能，定向改造基因组结构，重新设计细胞的代谢系统，达到生物体内改变代谢流，扩展代谢途径和构建新的代谢途径的目的。

在植物次生代谢产物的代谢工程中以毛状根转化体系应用较多，离体培养的毛状根中代谢酶基因表达特性和次级产物代谢调控具有与培养细胞基本一致的特点。

毛状根培养系统的应用已非常广泛，如：培养长春花毛状根可以生产长春花碱；人参毛状根生产人参皂苷等，不仅如此，这种明显优于植物组织培养的技术也成功运用于紫草宁的生产，即利用紫草毛状根生产紫草宁[8]。通过Ri质粒的转化获得的紫草毛状根，与紫草植株的根一样能产生和分泌紫草宁色素，且与紫草细胞保持生产调控的一致性，故毛状根为紫草宁代谢工程及开展基因功能和其它分子生物学领域的研究奠定了基础。3.2毛状根

毛状根是指整体植株或某一器官、组织（包括愈伤组织）、单个细胞，甚至原生质体受到发根农杆菌的感染所产生的一种病理现象，是细胞中质粒的T-DNA插入寄主细胞核基因组而得到的表现型，主要是在感染部位上或附近能产生大量的副产物-毛状根。目前，它已广泛应用于植物基因工程、植物次生代谢产物生产、植物品种改良和植物栽培等领域。

在药用植物方面，以发根农杆菌m 质粒转化植物产生的毛状根建立离体培养系统，实现次生代谢物质的工业化生产，来解决中药资源的短缺问题，越来越受到人们的重视。相对于常规细胞培养和组织培养，毛状根培

养系统具有生长快速、不需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定，并能向培养液释放部分代谢产物等优点，通过改变培养条件，毛状根甚至可以合成比原来植物中高出数倍的活性物质，以及原来植物所不含有的活性成分。

3.3紫草宁生物合成关键的代谢酶

紫草宁生物合成代谢途经中的关键酶已用红笔标出（请见上图）。3.3.1 苯丙氨酸脱氨酶（PAL）

苯丙氨酸脱氨酶是苯丙素类代谢途径中的起始代谢酶，它将苯丙氨酸催化生成反式肉桂酸，PAL基因在植物中以基因家族形式存在，科学家从紫草培养细胞中分离到两个编码PAL的cDNA克隆。这两个基因主要在形成紫草宁的紫草植株的根部表达。光照和茉莉酸甲酯能促进紫草培养细胞中的PAL基因的表达[9]。

3.3.2 4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）

4-香豆酸辅酶A连接酶也是植物苯丙素类代谢中的重要酶。4CL 将4-香豆酸转换成4-香豆酸辅酶A,该化合物再经不同的代谢途径可以生成木质素、类黄酮和香豆素等酚类产物, 但在紫草细胞中则形成重要的中间产物PHB。

从紫草细胞中分离到该基因的两个cDNA克隆,LE4CL-1和LE4CL-2，光照能显著增加它们的表达水平[10]。

3.3.3 甲戊二羟酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）

紫草宁的部分碳骨架来自于异戊二烯代谢途径，而HMGR是代谢途径中起初的反应酶。该酶催化甲戊二羟酸单酰辅酶A还原为MVA，然后经反应生成另一重要的中间产物GPP（见生物合成途径）。该酶与紫草宁的形成密切相关，是一个重要的调节酶。光照强烈抑制HMGR基因在紫草培养细胞中

的表达，因此光照也强烈抑制紫草宁的形成[11]，可见HMGR基因的表达调控对紫草宁的形成具有重要的调节作用。

3.3.4 对羟基苯甲酸香叶基转移酶（PGT）

对羟基苯甲酸香叶基转移酶是紫草细胞培养紫草宁形成代谢中的一个至关重要的代谢酶，它将GPP的香叶基转移到PHB上而形成GBA，最终反应生成紫草宁及其衍生物，增加或是减少它的活性直接影响到紫草宁的生产，故在紫草宁形成的调控中起着重要的作用。科学家分离到两个PGT的cDNA 克隆，LePGT-1和LePGT-2，这两个基因只在紫草植株根中表达，而且特异地以GPP为代谢底物。寡糖和MeJA能增加培养基中紫草细胞PGT基因表达和PGT活性，而光照却强烈抑制该基因的表达和PGT活性[10]，以及紫草宁的形成，暗培养则显著增强他们的表达。在紫草培养细胞中, PGT基因的表达模式与其酶活性变化和紫草宁的形成具有高度的一致性，可见 PGT 基因的表达水平对紫草宁形成调控的重要性。

3.3.5 小结

以上四个酶是对紫草宁生物合成代谢影响最大的四个酶。前三个酶PAL、4CL和HMGR作用于两个组成单元（PHB、GBB）的形成，最后一个酶PGT作用于构建单位的连接。这四个酶的活性及其基因表达的强弱都受到光照的影响，我认为是这些基因在光照或避光条件下差异表达的结果。PAL和4CL两个酶在光照条件下能增加其表达水平，但是光照又会强烈抑制HMGR 和PGT的活性，如此情况下，采用光照或是遮光培养都会对紫草素的合成产生影响。

为研究光照对紫草宁形成的分子机理，科学家采用差减杂交基因克隆技术从紫草细胞中分离了在暗培养条件下优势表达的基因克隆，并证明HMGR和PGT基因的表达模式与其酶活性变化和紫草宁的形成具有高度的一致性，而 PAL和4CL基因的表达和它们酶活性的变化与紫草宁形成的关系

没有这样密切。即光照对紫草宁合成的消极作用程度远远大于光照的积极作用，因此应选择暗培养技术。

3.4紫草宁的调控策略

代谢工程可以通过调节或修饰代谢酶基因、改变代谢途径等方法来调控目的产物的生产。在植物培养细胞中，提高细胞中次级代谢产物的途径，与微生物次级代谢产物的调节有着诸多相似又不同的地方。在植物培养细胞中，主要的提高次级代谢产物含量的方法有：优化培养条件，选择最适的培养条件；增加前体和生物转化；添加诱导子；发状根培养；植物细胞固定化技术和筛选高产细胞系等方法[12]。下面将介绍在紫草宁的生产调控中，这些方法的具体应用。

3.4.1 诱导筛选紫草宁高产细胞系

植物细胞培养工业化应用的关键前提之一是必须有一个高产并稳定的细胞系。由于植物培养细胞具有高度的变异性及异质性，因此通过自然筛选或诱变筛选均有可能从中筛选到所需形状的细胞变异系。紫草宁是高品质的染料，颜色鲜亮，可以利用目视法直接从培养细胞中筛选到具高含量色素的细胞系，这是产色素细胞系筛选的独特优势。

文献报道的紫草宁细胞系的诱变方法主要有辐射诱变筛选[13]和农杆菌介导的株系筛选[8][14]。据文献记载，经γ-射线处理后的细胞系紫草素含量较对照组提高了144.6%，证明了射线处理的有效性。而利用发根农杆菌MSU440转化新疆紫草子叶外植体，获得了激素自主、快速生长、多分支、多根毛的毛状根株系，为今后应用生物反应器进行紫草规模化生产奠定了理论基础。

3.4.2 改良优化培养基及培养条件

3.4.2.1 无机元素的优化

在紫草素的合成培养基M9中添加镁、铜、钙、锌等无机元素，得到优

化后的培养基M10。M10培养基能够明显促进紫草素及其衍生物的合成和积累[15]。分析其原因，铜离子可能是紫草素合成途经中某些酶的活性必须；实验研究表明，在紫草细胞的悬浮培养基中，紫草宁的产量随着钙离子螯合剂EGTA浓度的增加而明显减少，6mMEGTA能完全抑制紫草宁的形成。分析原因—钙离子是植物细胞信号转导过程的重要的第二信使，紫草细胞中很可能存在一些依赖钙的调节蛋白和功能蛋白，增加钙的含量，使这些钙依赖蛋白的活性得到加强；锌是色氨酸合成酶的必要成份，缺锌时植物细胞不能合成色氨酸，而色氨酸是合成生长素的前体，因此培养过程中缺少锌离子时，可能导致培养基体系中生长素的缺乏，从而影响细胞正长的生理代谢。

除了镁离子的促进机制在文献中没有提及外，其他几种离子的作用都不会影响上文提及的紫草宁合成代谢中的几个关键酶基因的表达水平，而是通过自己独特的作用机制对紫草宁的合成产生影响，这是与其他的调控方式不同的地方。

3.4.2.2 激素的影响

研究发现，某些激素可以促进紫草素的合成。文献中记载的激素有水杨酸和油菜素内酯BR。

高浓度的水杨酸可以促进紫草素的合成，其机制为水杨酸可以显著提高PHB-香叶基转移酶的活性，同时显著降低PHB-葡萄糖基转移酶的活性。由此可以推断水杨酸可能通过调节紫草宁合成过程中的PHB-香叶基转移酶(PGT)的活性和PHB-葡萄糖基转移酶(PHBOGT)的活性来调控紫草素的生产[16]。

PHB-香叶基转移酶是紫草素合成的关键酶，它的调控作用重要性不言而喻。这里主要分析一下对PHB-葡萄糖基转移酶(PHBOGT)的调控。PHB-葡萄糖基转移酶(PHBOGT)将中间产物PHB反应生成对葡萄糖-氧-苯甲酸

（PHB-O-Glu）（见上PHB的生合成途径），降低了紫草宁合成单位PHB的含量，从而减少紫草宁的合成量。水杨酸能显著降低PHB-葡萄糖基转移酶的活性，维持了合成紫草素所需的PHB浓度，保证了生合成的正常进行。也有文献报道PHBOGT的活性直接受光照而不是内源PHB浓度的调控，白光能诱导增加该酶的活性[11]，这也说明了选择暗培养方式的正确性。

水杨酸处理还提高了苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性。这几个酶都是植物抗性反应的几个关键酶，与次生代谢的合成密切相关。水杨酸也可能是通过促进这几个酶活性的升高，从而促进紫草素合成。

BR的作用与水杨酸类似。它也可以显著提高PHB-香叶基转移酶的活性，同时显著降低PHB-葡糖基转移酶的活性。

3.4.2.3 外加物和外加条件的影响

文献记载，在培养基中加入一些其他外源物质，可以提高紫草宁的产量，这里称为外加物。他们包括：稀土混合物、乙烯前体、茉莉酮酸甲酯、低浓度多胺等[17]。这些物质的作用机理不甚清楚，推测为影响了PHB-香叶基转移酶的活性。

超声波能够引起新疆紫草细胞的应激反应，并且通过细胞丙氨酸转氨酶的酶活来强化紫草素的生物合成途径，显著提高了紫草素含量和产量[18]。

一定剂量的γ-射线照射紫草细胞，也可以提高细胞合成紫草素的能力，原因可能是提高了紫草素合成途径中 PHB-香叶基转移酶活性，导致了次生代谢物特别是紫草素的积累[19]，这也是γ-射线能够诱变紫草细胞产生高产细胞系的理论基础。

3.4.3 应用真菌诱导子

真菌诱导子是来源于真菌的一种确定的化学信号，是一类特殊的触发因子。在植物与真菌互作用中，它们可快速、高度专一和选择地诱导植物

特定此生产物的合成。

米曲霉诱导子是由一些结构相似的组分组成，共同作用促进紫草色素的合成[20]。一般认为特定结构的诱导子与植物细胞膜上特定受体类蛋白结合，快速并有选择性地诱导特定基因的表达。据文献报道，加入诱导子后，紫草素的含量比对照组增加了230个诱导子相对活性单位。

其他的真菌诱导子中，黑曲霉诱导子也可显著提高紫草宁的产量，并可加快胞内色素分泌到培养液中的速率和数量，加诱导子的培养组产紫草宁是对照组的2.24倍。

3.4.4 植物细胞固定化

近些年,通过固定化细胞培养的方法生产次生代谢物的研究也越来越多。固定化细胞培养加强了细胞之间的接触,有利于细胞进行次生代谢,从而提高产量;同时,固定化有可能使细胞保持休止状态,可以解决植物细胞在悬浮培养中容易变异的问题.用于植物细胞领域的固定化方法有凝胶包埋、吸附、泡沫固定及应用膜反应器等。

实验研究证明，对于紫草细胞，吸附固定化的产率结果高于普通悬浮培养3.92倍[21]。

3.4.5 通过基因工程调控紫草素及其衍生物的合成

3.4.5.1 改变代谢途径

在紫草细胞中, PHB 先由莽草酸和分枝酸途径合成苯丙氨酸, 再经脱氨、羟基化、偶合等苯丙素类代谢途径,约需10个代谢酶的连续催化反应才能形成（见上生物合成图）。然而, 大肠杆菌的ubiC 基因编码产物分枝酸丙酮基裂解酶( chorismate pyruvatelyase , CPL) 可以直接将分枝酸催化生成PHB,并在转 ubiC 基因烟草中表现出了很高的CPL活性[ 22]。在转ubiC 基因的紫草毛状根中, 同位素示踪和对其内源苯丙素类代谢途径的阻断实验显示了CPL活性并直接合成了PHB,而且也能大量形成紫草宁,从而

改变并缩短了紫草细胞中紫草宁形成的代谢途径。

分枝酸分枝酸

苯丙氨酸分枝酸丙酮基裂解酶

（CPL，大肠杆菌的ubiC 基因编码）反式肉桂酸

4-香豆酸对羟基苯甲酸（PHB）

4-香豆辅酶A

对羟基苯甲酸（PHB）

（原代谢途径）（新代谢途径）

3.4.5.2 调节或修饰代谢酶基因

大肠杆菌中的 ubiA 基因编码的产物具有PGT 相似的功能, 即催化GPP生成重要前体GBA。转 ubiA 基因紫草毛状根中, 表现出了很高的UbiA 代谢酶活性,合成的GBA 大约是对照的50倍,比对照平均增加了22%的紫草宁产量[ 23]。

此外, 采用强启动子在紫草细胞中分别强表达了来自大肠杆菌中由ubiC 基因和来自拟南芥的HMGR基因, 获得的转基因紫草毛状根中分别增加了CPL和HMGR的活性, 但都没有显著提高紫草宁次生产物产量[24]。

从紫草宁代谢工程的研究看来,在获得的转 ubiC、 ubiA 或者HMGR 基因紫草毛状根中,虽然分别增加了个别代谢酶的活性和代谢中间产物的含量, 但都没有显著提高紫草宁生产。可见,在复杂的次生代谢中单个代谢酶活性的改变难以显著提高目标产物的产量,有必要对代谢网络的结构、调控等进行系统研究,才能更好地开展代谢工程。

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关于生物化学脂类代谢习题答案

脂类代谢一、问答题 1、为什么摄入糖量过多容易长胖? 答：因为脂肪酸合成的起始原料乙酰CoA主要来自糖酵解产物丙酮酸，摄入糖量过多则糖酵解产生的丙酮酸也多，进而导致合成脂肪酸的起始原料乙酰CoA也多，原料多合成的脂肪酸自然就多了，所以摄入糖量过多容易长胖。 2、比较脂肪酸β—氧化和脂肪酸的合成有哪些不同点？答：①细胞中发生部位不同：合成发生在细胞质，氧化发生在线粒体；②酰基载体不同：合成所需载体为ACP—SH，氧化所需载体为乙酰CoA；③二碳片段的加入与裂解方式：合成是以丙二酰ACP加入二碳片段，氧化的裂解方式是乙酰CoA；④电子供体或受体：合成的供体是NADPH，氧化的受体是FAD、FAD＋；⑤酶系不同：合成需7种酶，氧化需4种酶；⑥原料转运方式：合成是柠檬酸转运系统，氧化是肉碱穿梭系统；⑦能量变化：合成耗能，氧化产能。 3、试计算1mol甘油彻底氧化成CO和HO可净生成多少molATP。22答：甘油氧化产生的乙酰CoA进入三羧酸循环彻底氧化。经过4次脱氢反应生成3molNADH+H+、1molFADH2、以及2molCO2，并发生一次底物水平磷酸化，生成1molGTP。依据生物氧化时每1molNADH+H+和1molFADH2 分别生成、的ATP，因此，1mol甘油彻底氧化成CO2和H2O生成ATP摩尔数为6×＋1×＋3－1=。

4、1mol硬脂酸(即18碳饱和脂肪酸)彻底氧化成CO和HO时净生成的ATP的22摩尔数。．答：1mol硬脂酸彻底氧化需经8次循环，产生9个乙酰CoA，每摩尔乙酰CoA进入三羧酸循环产生10molATP，这样共产生90molATP。8molFADH2进入电子传递链产生12molATP，8molNADH进入电子传递链共产生20molATP。脂肪酸的活化需消耗2个高能磷酸键，这样彻底氧化1mol硬脂酸净得120molATP。 5、胆固醇在体内可转变成哪些重要物质？合成胆固醇的基本原料和关键酶各是什么？答：转变成胆汁酸、甾类激素、维生素D；基本原料：二甲基丙烯焦磷酸酯（DPP）、异戊烯醇焦磷酸酯关键酶：羟甲基戊二酸单酰CoA还原酶（HMGCoA还原酶） 6、为什么在长期饥饿或糖尿病状态下，血液中酮体浓度会升高？答：由于糖供应不足或利用率降低，机体需动员大量的脂肪酸供能，同时生成大量的乙酰CoA。此时草酰乙酸进入糖异生途径，又得不到及时的回补而浓度降低，因此不能与乙酰CoA缩合成柠檬酸。在这种情况下，大量积累的乙酰CoA衍生为丙酮、乙酰乙酸、β—羟丁酸。 7、为什么在大多数情况下，真核生物仅限于合成软脂酸？答：因为在真核生物中，β—酮脂酞—ACP缩合酶对链长有专一性，它接受14碳酸基的活力最强，所以，在大多数情况下，仅限于合成软脂酸。另外，软脂酸CoA对脂肪酸合成的限速酶乙酰CoA羧化酶

常见微生物检验项目及临床意义

细菌培养与其它检验项目的临床意义卫生部规定接受抗菌药物治疗的住院患者微生物检验样本送检率不低于30%（卫办医政发〔2011〕56号）。特介绍微生物检验项目，方便统计与分析点评。细菌检验为感染性疾病诊断和治疗提供依据：目标性治疗：提高微生物的送检率与检出率，有利于诊断与使用抗菌药。经验治疗：根据本地区病原菌类型时间、区域、耐药谱等使用抗菌药。调整治疗方案针对性用药：获得准确病原菌和细菌药敏结果。细菌培养的临床意义细菌培养与其它检验项目不同，由于其样本采集易受杂菌的干扰和培养条件的限制，因而造成检测结果有时与临床不完全一致，故在分析细菌培养报告时应明白：细菌培养阴性不代表无细菌感染、细菌培养阳性不代表该菌一定是病原菌，应结合患者具体情况而定。 1、血液和骨髓培养目前血液培养仍然是菌血症和败血症的细菌学检验的基本方法，并且广泛地应用于伤寒、副伤寒及其它细菌引起的败血症的诊断。菌血症系病原菌一时性或间断地由局部进入血流，但并不在血中繁殖，无明显血液感染临床征象。常可发生在病灶感染或牙齿感染，尤以拔牙、扁桃体切除及脊髓炎手术后等多见。败血症是指病原菌侵入血流，并在其中大量生长繁殖，造成身体的严重损害，引起显著的全身症状（如不规则高热与全身中毒等症状），它多继发于组织器官感染，尤其是当机体免疫功能低下、广谱抗生素和激素的应用及烧伤等。单次的血培养结果，对临床无鉴别指导意义，应多次多部位采集血液进行培养，才可判定检出菌究竟是病原菌还是污染菌。抽血时应特别注意皮肤消毒和培养瓶口的灭菌。 2、脑脊液培养正常人的脑脊液是无菌的，故在脑脊液中检出细菌（排除操作中的污染）应视为病原菌。引起脑膜炎的细菌种类不同，化脓性脑膜炎病原菌多为脑膜炎奈瑟菌，除此之外尚有肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等。 3、尿液培养尿液细菌培养对于膀胱和肾脏感染的及早发现和病原学诊断很有价值，对于尿道、前列腺以及内外生殖器的炎症也有一定价值。尿液中出现细菌通常称为菌尿症，如果尿液本身澄清但培养出细菌，一般为标本采集时未彻底消毒尿道口引起。如果细菌培养阳性同时伴有脓尿出现，则提示有尿路感染的可能（需指出轻度感染时可无脓尿出现）。泌尿系感染常见菌为大肠埃希菌、葡萄球菌、链球菌、变形杆菌等，除结核分枝支杆菌外，这些细菌又是尿道口常驻菌，极易引起标本留样污染，应注意鉴别。某些真菌疾病，如曲菌病在播散时也可造成肾脏感染，且尿中也能检查到。

微生物遗传学习题及答案(第二章)

遗传的物质基础 1、解词多组分基因组（segmented genome）：在一些RNA病毒中，RNA分子的容量有限，如果要增加遗传信息量，则需将病毒的基因组分段保存在2个或多个RNA片段中，以在病毒粒子中形成2个或多个RNA分子，此类病毒中的这些遗传物质称为多组分基因组。多分体：在不同病毒粒子中含有不同的RNA片段，只有几种含有基因组中不同RNA 片段的病毒粒子同时存在时才能表现有效的侵染，在某些植物RNA病毒中存在这种多分体现象。类病毒：一种小分子单链环状RNA分子，无蛋白质外壳保护，结构和化学组成比普通病毒简单，不需要辅助病毒便可侵入敏感的宿主细胞内进行自我复制，并使宿主致病或死亡。朊病毒（Protein infection,Prion）：一类侵染动物并在寄主细胞内复制的小分子无免疫性的疏水蛋白质，这类蛋白质能与寄主脑组织中的核酸相互作用，使脑组织海绵状损伤，引起动物的亚急性海绵样脑病。重叠基因：具有部分公用核苷酸序列的基因，即同一段DNA携带了两种或两种以上不同蛋白质的编码信息。重叠的部分可在调控区或结构基因区，常见于病毒和噬菌体基因组中。串珠结构：60bp的间隔线状DNA双链作为连接丝，将许多核小体串联起来并盘绕形成的染色质纤维细丝，呈念珠状，即为染色质的串珠结构。核小体（nucleosome）：由H2A、H2B、H3、H4四种组蛋白各以两个分子组成的八聚体核心和一分子组蛋白H1以及大约200bp的DNA缠绕而组成，直径一般为10nm。2、问题 Ⅰ、简述病毒、原核生物和真核生物遗传物质的特点。病毒：核酸类型有DNA和RNA之分；核酸分子有单链和双链之分；空间结构有开放型和闭合型之分；基因组有多组份型和单组份型；有多分体现象；能够指导蛋白质合成；能够产生可遗传变异。原核生物：原核微生物遗传物质分子量较病毒大而比真核微生物小，DNA与微量的组蛋白相结合，形成超螺旋脚手架结构；某些细菌只有一条环状双链DNA，某些拥有两个环状DNA，有些则一条环状、一条线状DNA；能够指导蛋白质合成；能够产生可遗传变异；一般情况下，一个细菌细胞只有一套基因组，其DNA含量在细胞间期十分稳定；能够自我复制，使亲子代之间保持连续性；基因组在DNA上一般是连续排列。真核生物：真核微生物遗传物质主要存在于细胞核，细胞核有核膜包裹，核内存在多条线状dsDNA；DNA和组蛋白组成核小体，线状DNA双链缠绕在核小体上形成串珠状染色质；每一染色体只含有一条线状双链DNA；分子结构相对稳定，能够自我复制，使亲子代之间保持连续性；能够指导蛋白质合成；能够产生可遗传变异；基因组含有大量的重复序列。 Ⅱ、原核生物和真核生物染色体外遗传物质。答：染色体外遗传物质是细胞的非固定成分，也能影响细胞的代谢活动，但它们不是细胞生存必不可少的组成部分，包括附加体和共生体。含有DNA的细胞质颗粒，即附加体，既能以完全自主的状态存在，也能组入到染色体上，成为染色体的一部分。进入细胞，与细胞建立起特殊的共生关系的一类物质即共生体。原核生物的染色体外遗传物质：附加体如R质粒（抗性因子，使E. coli.抗一定浓度的抗菌素）、F因子（决定性别，有F因子的E. coli.为雄性------供体）等；共生体如

生物化学习题及答案_代谢调节

代谢调节（一）名词解释 1．诱导酶（Inducible enzyme） 2．标兵酶（Pacemaker enzyme） 3．操纵子（Operon） 4．衰减子（Attenuator） 5．阻遏物（Repressor） 6．辅阻遏物（Corepressor） 7．降解物基因活化蛋白（Catabolic gene activator protein） 8．腺苷酸环化酶（Adenylate cyclase） 9．共价修饰（Covalent modification） 10．级联系统（Cascade system） 11．反馈抑制（Feedback inhibition） 12．交叉调节（Cross regulation） 13．前馈激活（Feedforward activation） 14．钙调蛋白（Calmodulin）（二）英文缩写符号 1. CAP（Catabolic gene activator protein）： 2. PKA（Protein kinase）： 3. CaM（Calmkdulin）： 4. ORF（Open reading frame）：（三）填空题 1. 哺乳动物的代谢调节可以在、、和四个水平上进行。 2. 酶水平的调节包括、和。其中最灵敏的调节方式是。 3. 酶合成的调节分别在、和三个方面进行。

4. 合成诱导酶的调节基因产物是，它通过与结合起调节作用。 5. 在分解代谢阻遏中调节基因的产物是，它能与结合而被活化，帮助与启动子结合，促进转录进行。 6. 色氨酸是一种，能激活，抑制转录过程。 7. 乳糖操纵子的结构基因包括、和。 8. 在代谢网络中最关键的三个中间代谢物是、和。 9. 酶活性的调节包括、、、、和。 10.共价调节酶是由对酶分子进行，使其构象在和之间相互转变。 11.真核细胞中酶的共价修饰形式主要是，原核细胞中酶共价修饰形式主要是。（四）选择题 1. 利用操纵子控制酶的合成属于哪一种水平的调节： A．翻译后加工 B．翻译水平 C．转录后加工 D．转录水平 2. 色氨酸操纵子调节基因产物是： A．活性阻遏蛋白 B．失活阻遏蛋白 C．cAMP受体蛋白 D．无基因产物 3. 下述关于启动子的论述错误的是： A．能专一地与阻遏蛋白结合 B．是RNA聚合酶识别部位 C．没有基因产物 D．是RNA聚合酶结合部位 4. 在酶合成调节中阻遏蛋白作用于： A．结构基因 B．调节基因 C．操纵基因 D．RNA聚合酶 5. 酶合成的调节不包括下面哪一项： A．转录过程 B．RNA加工过程 C．mRNA翻译过程 D．酶的激活作用 6. 关于共价调节酶下面哪个说法是错误的：

第二章微生物的代谢调控机制

第二章微生物的代谢调控机制 ?通过代谢调节，微生物可最经济地利用其营养物，合成出能满足自己生长、繁殖所需要的一切中间代谢物，并做到既不缺乏也不剩余任何代谢物的高效“经济核算”。 ?微生物细胞具有高度严密的自我调节能力，这对于微生物在工业上的应用，则有利也有弊。 2.1 酶的调节机理 ?微生物的自我调节作用都是通过协调控制酶来实现的，酶的生物合成受基因和代谢物的双重控制。 2.1.1酶浓度的调控 2.1.1.1 酶的诱导合成 ?组成酶：细胞所固有的，经常存在于细胞内，以恒定速度和恒定数量生成，不随微生物的代谢状态而变化的一类酶。 ?诱导酶：在一般情况下细胞内不生成或数量很少，这些酶只有在底物或其结构类似物存在时才生成的一类酶。 ?组成酶和诱导酶是相对的概念。 ?酶的诱导合成现象是微生物普遍存在的，许多分解代谢的酶属于诱导酶类，有些合成酶（如细胞色素）也是诱导酶类。 ?酶合成的诱导对于微生物的意义：加强微生物对环境的适应能力。避免了生物合成的原料和能量的浪费。 2.1.1.2 酶合成的反馈阻遏 ?当代谢途径中某终产物过量时，或培养基中已提供了此产物时，就会阻遏自身合成途径中第一个酶或其他关键酶的进一步合成，从而控制代谢的进行，减少终产物的生成。这种效应称为反馈阻遏。 ?酶的阻遏在微生物中是很普遍的现象，常出现在与氨基酸、嘌呤、嘧啶的生物合成有关的酶中。 ?阻遏的类型主要有末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种。（1）末端产物阻遏指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。分支代谢途径 ?多价阻遏作用：每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的阻遏。 ?积累阻遏：每个分支合成途径的终产物仅部分地阻遏初始酶的合成，且各阻遏的百分数，不管第二个阻遏物存在与否，都是一样的。（2）分解代谢产物阻遏 ?二次生长现象 ?“葡萄糖效应”:葡萄糖干扰其他碳源利用的现象。 ?随后的研究表明，葡萄糖效应并非由葡萄糖直接造成，而是其某种分解代谢产物所引起的。 ?分解阻遏不仅仅限于葡萄糖，其他碳源和氮源也能起相同作用。 ?分解代谢物的阻遏作用：指代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象。 ?分解代谢物阻遏对微生物的意义：

生物化学作业

生物化学作业 1. 基因如何决定糖蛋白中寡糖链的结构信息。答：生物体内的糖链的合成大多需要酶的催化调节，并且糖链的结构受到某些蛋白所携带的信息的控制，而蛋白质的功能和其携带的信息取决于基因的控制，因此在由某些蛋白质和酶的协同作用下合成的糖链会由于基因中的不同信息的表达和控制而产生不同的结构。不同结构的糖链携带了不同的生物信息。 2. 组成生物膜的脂质分子主要有哪几类？分别简述其功能。答：组成生物膜的脂质分子主要有磷脂、糖脂、胆固醇。磷脂：主要包括甘油磷脂和鞘磷脂两大类。是重要的两亲物质，它们是生物膜的重要组分、乳化剂和表面活性剂。它是维持生命活动的基础物质，对活化细胞，维持新陈代谢，基础代谢及荷尔蒙的均衡分泌，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用。人体神经细胞和大脑细胞是由磷脂为主所构成的细胞薄膜包覆，磷脂不足会导致薄膜受损，造成智力减退，精神紧张。而磷脂中含的乙酰进入人体内与胆碱结合，构成乙酰胆碱。而乙酰胆碱恰恰是各种神经细胞和大脑细胞间传递信息的载体。磷脂是细胞膜的重要组成部分，肩负着细胞内外物质交换的重任。糖脂：包括鞘糖脂和甘油糖脂两大类。细胞膜上的鞘糖脂与细胞生理状况密切相关。鞘糖脂的疏水尾部深入膜的脂双层，极性糖基露在细胞表面，它们不仅是血型抗原而且与组织和器官的特异性，细胞-细胞识别有关。同一类细胞在不同的发育阶段,鞘糖脂的组成也不同。正因为某些类型鞘糖脂是某种细胞在某个发育阶段所特有的，所以糖脂常常被作为细胞表面标志物质。糖脂又是细胞表面抗原的重要组分，某些正常细胞癌化后，表面糖脂成分有明显变化。细胞表面的糖脂还是许多胞外生理活性物质的受体,参与细胞识别和信息传递过程。胆固醇：胆固醇的两亲性特点对生物膜中脂质的物理状态有一定的调节作用。在相变温度以上时，胆固醇阻扰脂分子脂酰链的旋转异构化运动，从而降低膜的流动性。在相变温度以下时，胆固醇的存在又会阻止磷脂脂酰链的有序排列，从而降低其相变温度，防止磷脂向凝胶态转化，保持了膜的流动性。胆固醇还是血中脂蛋白复合体的成分，是类固醇激素和胆汁酸的前体。 3.“超级氨基酸”海选开始了！请选出你最喜爱的三种氨基酸，并分别陈述理由。答：①甘氨酸：Glycine，是最简单的氨基酸，又名氨基乙酸，人体非必需的一种氨基酸，在分子中同时具有酸性和碱性官能团，在水溶液中为强电解质，在强极性溶剂中溶解度较大，基本不溶于非极性溶剂，而且具有较高的沸点和熔点，通过水溶液酸碱性的调节可以使甘氨酸呈现不同的分子形态。参与嘌呤类、卟啉类、肌酸和乙醛酸的合成，可与多种物质结合由胆汁或从尿中排出。作为营养增补剂广泛应用于医药、食品等领域。根据甘氨酸的制备工艺和产品的纯度可分为食品级、医药级、饲料级和工业级四种规格产品，可见甘氨酸的用途之广泛。 ②半胱氨酸cystein e：是人体常见的必需氨基酸，蛋白质中重要的“二硫键”多半出自它手。半胱氨酸是一种天然产生的氨基酸，在食品加工中具有许多用途，它主要用于焙烤制品，作为面团改良剂的必需成分。半胱氨酸是一种还原剂，它可以促进面筋的形成，减少混合所需的时间和所需药用的能量，半胱氨酸通过改变蛋白质分子之间和蛋白质分子内部的二硫键，减弱了蛋白质的结构，这样蛋白质就伸展开来。我们去美发店的烫发，那些好看的卷发也是半胱氨酸在特殊条件下改变二硫键而形成的！ ③苯丙氨酸：Phenylalanine，是人体的必需氨基酸之一。苯丙氨酸系统命名为“2-氨基苯丙酸”，是α-氨基酸的一种，L-苯丙氨酸可作为抗癌药物的载体将药物分子直接导入癌瘤区，其效果是其他氨基酸的3～5倍。这样既可以抑制癌瘤生长，又可以降低药物的毒副作用。

微生物的代谢与调控论文

链霉素的代谢调控机制与应用摘要：链霉菌在生产抗生素方面的特殊作用使它成为放线菌中遗传育种的核心，近年来的进展主要在于原生质体融合、脂质体的使用、质粒及其它载体的发现和克隆技术工业应用。本文综述了链霉素生物合成途径、代谢调节机制、链霉素发酵的代谢调控育种及其进展。关键词：链霉素代谢调节育种思路应用前言：链霉素是1944年从灰色链霉菌培养液中分离出来的一种碱性抗生素，分子式 C21H39N7O12.由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺组成的三糖苷，属于氨基糖苷类抗生素.由于链霉素肌肉注射的疼痛反应比较小，适宜临床使用，只要应用对象选择得当，剂量又比较合适，大部分病人可以长期注射（一般2个月左右）。所以，应用数十年来它仍是抗结核治疗中的主要用药。我国于1958年以来大量生产，目前已形成了相当大的生产规模与能力。链霉素发酵工业延续至今已有相当长的历史，和其它抗生素生产过程一样，它的菌体生长，产物形成等所涉及的一系列时刻变化着的生物化学和质量、能量传递过使链霉素发酵表现出相当程度的不确定性。同时又由于反应机理复杂，无合适的模型用以描述过程，使人们在其发酵操作上依赖经验甚于理论。这给链霉素生产水平的提高带来了一定的困难，但同时又给基于理论分析提高生产提供了可能。 1 链霉素生物合成的途径及代谢调节机制 1.1 链霉素的生物合成途径由D-葡萄糖和NH3合成链霉素的大致途径如图1所示[2]

从图l可看出，每生成1个链霉素分子都需消耗3个葡萄糖分子、7个HN 3 分子、 2个CO 2分子和l个甲硫氨酸分子。其中，有3个NH 3 分子是通过转氨基反应，分别把氨基供体—谷氨酰氨、丙氨酸和谷氨酸的氨基结合到链霉胍上和L-葡萄糖胺的氨基上，另外4个NH 3 分子是通过鸟氨酸环供给的，其中2个分子又由氨甲酰磷酸酯，另外2分子由天冬氨酸引入，最后转变为精氨酸的脒基，再转移到链霉胺衍生物上。2个CO 2 也是通过鸟氨酸循环固定的。 1.2 链霉素生物合成的调节机制在链霉素生物合成中的调节机制主要有发酵阶段的转变、分解产物的调节以及无机磷的反馈抑制等方面。 1.2.1 发酵阶段的转变催化链霉胍的2个转脒基反应的酶，在合成阶段开始时的突然出现是由于新的蛋白质的合成，而不是蛋白质的激活。 1.2.2 分解代谢产物的调节对大多数微生物来说，甘露糖链霉素的生物活性只有链霉素的20%-25%。直到发酵后期才产生水解甘露糖链霉素的α-D-甘露糖苷酶，能迅速把甘露糖链霉素水解成链霉素和甘露糖，反应如下：甘露糖苷酶链霉素-甘露糖链霉素+甘露糖 1.2.3 无机磷的反馈抑制正常生长所需的无机磷浓度抑制链霉素的形成。磷酸盐与链霉素的生物合成过程有密切关系，在链霉素生物合成中有几步磷酸酯酶所催化的去磷酸化反应。过量的磷酸盐会产生反馈抑制，阻抑这几步的一个或多个磷酸酯酶的活性或形成，因而抑制链霉素的合成，因此磷酸酯酶的活力与链霉素的形成有密切关系。此外磷酸盐还能调节链霉胍合成的关键酶——脒基转移酶的形成，高浓度磷酸盐严重阻遏该酶的形成。 2 代谢控制发酵育种的基本思想根据代谢控制机制的研究表明，酶的生物合成受基因和代谢物的双重控制。一方面，从DNA 的分子水平上阐明了酶生物合成的控制机制，酶的合成受基因的控制，有基因决定形成酶的分子化学结构；另一方面，从酶学的角度探讨，仅仅有某种基因，并不能保证大量产生某种酶。酶的合成还受代谢物(酶反应的底物、产物及其类似物)的控制和调节。最有效的方法就是造就从遗传角度解除了微生物正常代谢控制机制的突变株。突破微生物的自我调节控制机制，而使代谢产物大量积累的有效措施如下： (1)应用营养缺陷型菌株。在这些缺陷型菌株中，由于合成途径中某一步骤发生缺陷，终产物不能积累，这样就解除了终产物的反馈调节，使之间产物积累或另一分支途径的末端产物得以积累。 (2)选育抗反馈调节的突变株。由于这样的突变株不再手正常反馈调节作用的影响，使终产物得以积累。 (3)选育细胞膜通透性突变株，以便使终产物在细胞内不能积累到引起反馈调节的浓度。 (4)利用营养缺陷型回复突变株或条件突变株的方法，解除终产物对关键酶的调节。 (5)应用遗传工程技术，创造理想的超微生物(即构建目的工程菌株)。此外，发酵的环境条件，如pH值、NH 的供应、溶氧水平、营养浓度控制表

常见微生物检验项目与临床意义

微生物检验项目与临床意义卫生部规定接受抗菌药物治疗的住院患者微生物检验样本送检率不低于30%（卫办医政发〔2011〕56号）。特介绍微生物检验项目，方便统计与分析点评。细菌检验为感染性疾病诊断和治疗提供依据：目标性治疗：提高微生物的送检率与检出率，有利于诊断与使用抗菌药。经验治疗：根据本地区病原菌类型时间、区域、耐药谱等使用抗菌药。调整治疗方案针对性用药：获得准确病原菌和细菌药敏结果。细菌培养的临床意义细菌培养与其它检验项目不同，由于其样本采集易受杂菌的干扰和培养条件的限制，因而造成检测结果有时与临床不完全一致，故在分析细菌培养报告时应明白：细菌培养阴性不代表无细菌感染、细菌培养阳性不代表该菌一定是病原菌，应结合患者具体情况而定。 1、血液和骨髓培养目前血液培养仍然是菌血症和败血症的细菌学检验的基本方法，并且广泛地应用于伤寒、副伤寒及其它细菌引起的败血症的诊断。菌血症系病原菌一时性或间断地由局部进入血流，但并不在血中繁殖，无明显血液感染临床征象。常可发生在病灶感染或牙齿感染，尤以拔牙、扁桃体切除及脊髓炎手术后等多见。败血症是指病原菌侵入血流，并在其中大量生长繁殖，造成身体的严重损害，引起显著的全身症状（如不规则高热与全身中毒等症状），它多继发于组织器官感染，尤其是当机体免疫功能低下、广谱抗生素和激素的应用及烧伤等。单次的血培养结果，对临床无鉴别指导意义，应多次多部位采集血液进行培养，才可判定检出菌究竟是病原菌还是污染菌。抽血时应特别注意皮肤消毒和培养瓶口的灭菌。 2、脑脊液培养正常人的脑脊液是无菌的，故在脑脊液中检出细菌（排除操作中的污染）应视为病原菌。引起脑膜炎的细菌种类不同，化脓性脑膜炎病原菌多为脑膜炎奈瑟菌，除此之外尚有肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等。 3、尿液培养尿液细菌培养对于膀胱和肾脏感染的及早发现和病原学诊断很有价值，对于尿道、前列腺以及内外生殖器的炎症也有一定价值。尿液中出现细菌通常称为菌尿症，如果尿液本身澄清但培养出细菌，一般为标本采集时未彻底消毒尿道口引起。如果细菌培养阳性同时伴有脓尿出现，则提示有尿路感染的可能（需指出轻度感染时可无脓尿出现）。泌尿系感染常见菌为大肠埃希菌、葡萄球菌、链球菌、变形杆菌等，除结核分枝支杆菌外，这些细菌又是尿道口常驻菌，极易引起标本留样污染，应注意鉴别。某些真菌疾病，如曲菌病在播散时也可造成肾脏感染，且尿中也能检查到。尿液的细菌学培养具有重要的诊断意义，但培养阴性并不能否定泌尿道感染，一般应注意病程、采样的时机、方法以及其它原因的影响。尿道口的消毒是中段尿细菌培养的关键步骤，是引起假阳性的最主要因素，故尿液细菌培养阳性要注意排除留样污染，如果检出菌的数量大于10万CFU/ml,则基本可认为是病原菌。 4、痰液和咽拭子标本的培养痰液及支气管分泌物的细菌学检验对于呼吸道疾病的诊断、治疗具有一定的意义。对无法咳痰的患者，用咳嗽后的咽拭子做培养检查，仍是发现致病菌的主要依据。

微生物生理学实验指导圈起来的不做

微生物生理学实验 ―――铜绿假单胞菌fabI基因的克隆及功能鉴定目录实验〇铜绿假单胞菌fabI基因鉴定的原理实验一细菌总DNA的提取与检测实验二铜绿假单胞菌fabI基因PCR扩增实验三铜绿假单胞菌pafabI基因表达载体构建实验四质粒的提取与检测实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA转化实验六遗传互补大肠杆菌fabI温度敏感突变菌株实验七铜绿假单胞菌烯酯酰ACP还原酶的原核表达实验八铜绿假单胞菌烯酯酰ACP还原酶纯化实验九体外鉴定烯酯酰ACP还原酶的酶活性实验十构建铜绿假单胞菌fabI突变菌株实验十一菌落PCR筛选重组子实验十二铜绿假单胞菌脂肪酸合成分析实验报告

实验〇铜绿假单胞菌fabI基因鉴定的原理脂肪酸的生物合成是一种细胞生物体重要的基础代谢。生物体脂肪酸合成系统（FAS）为磷脂和类脂等生物质膜组分提供重要的前体物质，同时生物体内一些重要的化合物如硫辛酸、生物素以及细菌群体感应的信号分子等也都需要以脂肪酸合成代谢中的中间产物为前体物质合成。在不同生物体内，脂肪酸的生物合成过程的基本原理是相似的，但是催化反应的蛋白序列和结构则有着很大的差异。根据合成酶系统的这种差异，人们将脂肪酸生物合成系统分为I型脂肪酸合成酶系（FASI）和II型脂肪酸合成酶系（FAS II）(Cronan, 2006)。I型脂肪酸合成酶系主要分布在哺乳动物和真菌等生物中，该种脂肪酸合成由一个（或两个）分子量较大的多功能酶蛋白催化。这种多功能酶蛋白有多个不同功能的结构域，脂肪酸延伸循环中的各个反应分别在酶蛋白的不同结构域进行(Heath et al, 2002a; White et al, 2005)。II型脂肪酸合成酶系主要分布在细菌，植物和原生动物中，该类生物的脂肪酸合成由一组独立存在的酶催化完成，该系统中各个独立的酶蛋白分别行使一种功能(Cronan, 2006; White et al, 2005)。细菌脂肪酸的合成过程中，酰基链通过硫脂键连接在酰基载体蛋白（ACP）上。ACP是一种小分子量蛋白，一般由70-80个氨基酸残基组成，是FAS II的核心成员之一。以大肠杆菌为例，说明脂肪酸合成的路径。 1. 脂肪酸合成的起始：脂肪酸合成的起始反应是以细菌体内的乙酰辅酶A 合成起初的四碳的短链脂肪酸的过程，该四碳的短链脂肪酸（acyl-CoA）及CO 2 产物是酰基链延长反应的基础(Revill et al, 2001; White et al, 2005)。此过程通过羧化、转移、缩合三步来完成：第一步，羧化：乙酰CoA在乙酰辅酶A 羧化酶（ACC）作用下转化为丙二酸单酰辅酶A（Mal-CoA）。ACC有4个独立的蛋白构成（AccA，AccB，AccC，AccD），其中AccB的行使功能需要生物素作为共价结合的辅因子(Cronan et al, 2002)。第二步，转移：Mal-CoA在丙二酰转酰基酶（FabD）的作用下将丙二酸单酰基团转移至ACP上，形成Mal –ACP(Jackowski et al, 1987)。第三步，缩合：在β酮脂酰ACP合成酶III（KAS III，FabH）的作用下将乙酰CoA所携带的酰基链合缩合到Mal-ACP上，生成β酮丁酰ACP，起始新的酰基链的生成(Revill et al, 2001)。

生物化学下册作业

第八和九章．DNA和RNA的生物合成练习题一、名词解释 1.DNA半保留半连续复制 2. 前导链、滞后链、岗崎片断 3. 中心法则 4. 复制叉与复制子 5. 限制性核酸内切酶 6.模板链(或反义链即负链)与编码链(或有义链即正链) 7. 转录、逆转录、不对称转录8. 外显子与内含子 9. 单顺反子与多顺反子10. 基因、结构基因、调节基因 11. 操纵子11. 启动子、终止子、转录因子 13. 顺式作用元件与反式作用元件14. 衰减子与增强子 15. RNA加工与RNA剪切16. 光复活二、问答题 1.试述DNA的半保留半连续的复制过程。(以原核生物为例) 2.试述逆转录病毒的逆转录过程。 3.试述原核生物DNA的转录过程。 4.试述四类RNA病毒的复制过程。 5.简述复制叉上进行的基本活动及参与的酶（以原核生物为例说明）。 6.由RNA聚合酶Ⅱ合成的初始转录物(mRNA前体)需经过哪些加工过程才能成为成熟的mRNA. 第十章．蛋白质的生物合成练习题一、名词解释 1. 密码子与反密码子 2. 翻译与翻译后加工 3. 多聚核糖体

二、问答题 1.三种RNA在蛋白质生物合成中的作用? 2.以原核生物为例说明蛋白质的生物合成过程? 3.何谓‘‘转译后加工”，蛋白质生物合成的加工修饰方式有哪些?(以真核生物为例)。 4.保证准确翻译的关键是什么? 5.图示并简述中心法则。三、计算题 DNA的MW(分子量)=1.3×108（双链)。(注：DNA分子中脱氧核苷酸1. 噬菌体T 4 对的平均分子量是640，核苷酸残基平均分子量为320) 可为多少个AA编码? 1)T 4 2)T DNA可为多少MW=55000的蛋白质编码?(注：多肽链中平均每个AA残 4 基的分子量为110) 2.合成一个九肽需要多少个ATP?如果这个九肽含有起止AA残基(Met)至少需要多少个ATP? 3. 按下列DNA单链 5’ TCGTCGACGATGATCATCGGCTACTCG 3’ 试写出： 1) DNA复制时另一条单链的序列。 2) 以此链为摸板转录的mRNA的序列。 3) 合成的多肽的序列。 (注：三题答案均须注明方向。) 四、论述题 1.围绕中心法则论述遗传的稳定性（注：DNA、RNA复制）以及基因表达中如何实现遗信息碱基序列到蛋白质AA序列的转变?

微生物的代谢及其调控

1微生物的代谢微生物代谢包括微生物物质代谢和能量代谢。 1.1微生物物质代谢微生物物质代谢是指发生在微生物活细胞中的各种分解代谢与合成代谢的总和。 1.1.1分解代谢分解代谢是指细胞将大分子物质降解成小分子物质，并在这个过程中产生能量。—般可将分解代谢分为TP。三个阶段：第一阶段是将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质降解成氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质；第二阶段是将第一阶段产物进一步降解成更为简单的乙酰辅酶A、丙酮酸以及能进入三羧酸循环的某些中间产物，在这个阶段会产生一些ATP、NADH及FADH2；第三阶段是通过三羧酸循环将第二阶段产物完全降解生成CO2，并产生ATP、NADH 及FADH2。第二和第三阶段产生的ATP、NADH及FADH2通过电子传递链被氧化，可产生大量的ATP。 1.1.1.1大分子有机物的分解（1）淀粉的分解淀粉是许多种微生物用作碳源的原料。它是葡萄糖的多聚物，有直链淀粉和支链淀粉之分。一般天然淀粉中，直链淀粉约占20％，支链淀粉约占80％。直链淀粉为α一l、4糖苷键组成的直链分子；支链淀粉只是在支点处由α—1、6糖苷键连接而成。微生物对淀粉的分解是由微生物分泌的淀粉酶催化进行的。淀粉酶是一类水解淀粉糖苷键酶的总称。它的种类很多，作用方式及产物也不尽相同，主要有液化型淀粉酶、糖化型淀粉酶（包括β—淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶）。以液化型淀粉酶为例，这种酶可以任意分解淀粉的。α-l、4糖苷键，而不能分解α-1、6糖苷键。淀粉经该酶作用以后，黏度很快下降，液化后变为糊精，最终产物为糊精、麦芽糖和少量葡萄糖。由于这种酶能使淀粉表现为液化，淀

赵立平和他的肠道微生物

赵立平：我和我的肠道菌群 1987 年，赵立平跟刘英结婚。两年不到，他们有了一个女儿，赵立平还完成了他的博士学位。新的压力加上美食——藉刘英做得一手好菜——我们的微生物学家长胖了。到 1990 年，体重从60 公斤增至 80 公斤。后来，在美国康乃尔大学读博士后期间，他又长胖了 10 公斤。1995 年腰围量110 厘米，整个人的健康状况也极为糟糕。赵立平认为，调节肠道菌群是他减肥成功的关键。进入平台期的科研转机2004 年，他读到一篇论文。论文的主要作者戈登，是美国华盛顿大学医学院的微生物学家。用实验表明，肥胖症和小鼠肠道中的菌群存有关联。 2006 年，他开始了一种饮食疗法，食谱中包括山药和苦瓜，同时对自己的体重以及肠道中的菌群进行监测。山药和苦瓜里面含有益生元，可以被肠道细菌发酵利用，据说有调节人体肠道菌群生长的功效。再加上以粗粮为主的饮食，在两年内减掉了 20 公斤。他的血压、心率和胆固醇水平也都降了下来。抗炎细菌Faecalibacterium prausnitzii的数量大幅增加，从最开始根本检测不到，到后来增加为他肠道细菌总量的 14.5％。这些变化使赵立平决定，集中研究微生物在他身体状况转变中所发挥的影响。从小鼠身上做起的实验，赵立平把它扩展到了人的身上。寻找新的启发有一天，一位兽医学的同事问他要一些芽孢杆菌的菌株，说是这种细菌能缓解猪和鸡的腹泻。赵立平意识到，自己研究的菌株里面，很可能就有能抗植物感染，甚至抗人类感染功效的。 20 世纪 90 年代，赵立平涉足猪的微生物研究，试图探究用菌株来控制猪身上的感染这一设想，但无法获得资金。在此期间，他家人的健康状况每况愈下。本来就偏胖的父亲胆固醇水平激增，还得遭遇了两次中风。赵立平的两个弟弟也都成了大胖子。几年后，赵立平看到了戈登的论文，对他来说，这是“肠道菌群可以调节宿主的基因的首个证据”。于是，赵立平拿自己当小白鼠，试图找出体重增加可能跟哪些微生物有关。要从生活在人体肠道内上百种不同的微生物中，找出让体重增加的那一种，确实是个棘手的大难。低热量饮食结合剧烈运动的减肥方法，在他看来完全说不通。“从营养上讲，你的身体是在压力状态下的，”赵立平说，“然后你再加上生理上的压力。也许这样你是能减肥，但同时也减掉了你的健康。” 腰围变小之后，他开始在动物身上进行实验，试图筛选出与肥胖有关的细菌。今年 4 月，赵立平《国际微生物生态学会会刊》上发表了一项研究，他们将小鼠从正常饮食转换到高脂肪饮食，然后再换回到正常饮食上来，期间每两周监测一

生物化学(14.5)--作业基因表达调控(附答案)

第十三章基因表达调控名词解释基因组基因表达管家基因组成性表达启动子顺式作用元件沉默子反式作用因子操纵子锌指结构：单顺反子增强子沉默子问答题 1. 简述乳糖操纵子结构及调控机理。 2. 简述原核基因表达调控的特点 3. 简述真核基因组结构特点 4. 简述真核生物基因表达调控的特点？参考答案：名词解释基因组 [答案]来自一个遗传体系的一整套遗传信息。基因表达 [答案]基因转录和翻译的过程。管家基因 [答案]在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因。组成性表达 [答案]管家基因的表达水平受外界环境影响较小，在生物体各个生长阶段的大多数组织中持续表达，这类基因的表达称为组成性表达

启动子 [答案]RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件。顺式作用元件 [答案]指具有的可影响基因表达活性的真核各种组分（DNA序列），包括启动子、增强子和沉默子。反式作用因子 [答案]一些转录调节因子，通过与特异的顺式作用元件的识别、结合，反式作用另一基因的转录，称为反式作用因子。操纵子 [答案]原核生物中，基因按功能相关性成簇地串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位，称为操纵子。常包括：一个启动序列及数个可转录的编码基因。锌指结构： [答案]最早发生于结合GC盒的SP1转录因子，由30个氨基酸残基组成，其中有2个Cys和2个His，4个氨基酸残基分别位于正四面体的顶角，与四面体中心的锌离子配价结合，稳定锌指结构。在Cys和His之间有12个氨基酸残基，其中数个为保守的碱性残基。单顺反子 [答案]一个编码基因转录生成一个mRNA分子、经翻译成一条多肽链。增强子 [答案]远离转录起始点决定基因的时间空间特异性增强转录活性的DNA序列。沉默子 [答案]一些特异的DNA序列，结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。问答题简述乳糖操纵子结构及调控机理。 [答案]乳糖操纵子的结构：E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵子序列O、一个启动子P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一分解代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成l a c操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调调节。乳糖操纵子工作原理：（1）阻遏蛋白的负性调节：在没有乳糖存在时，l a c操纵子处于阻遏状态。此时，I序列表达的l a c阻遏蛋白与O 序列结合，阻遏RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，l a c操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，

生物化学习题——代谢调节

代谢调节一、填空题 1．酶促化学修饰的特点有：（1）除黄嘌呤氧化酶外，属于这类调节方式的酶都有（）两种形式。（2）化学修饰会引起酶分子（）的变化。而且，其是酶促反应，故有（）效应。（3）（）是最常见的酶促化学修饰反应，一般是耗能的。 2．1961年Monod和Jocob首次提出了大肠杆菌乳糖（）模型。 3．细胞内酶的数量取决于（）和（）。 4．许多代谢途径的第一个酶是限速酶，终产物多是它的（），对它进行（），底物多为其（）。 5．原核细胞酶的合成速率主要在（）水平进行调节。 6．乳糖操纵子的诱导物是（），色氨酸操纵子的辅阻遏物是（）。 7．分支代谢途径中的终产物分别抑制其分支上的限速酶，分支点共同的中间产物抑制前面的限速酶，称为（）。 8．G蛋白具有（）酶的活性；负责调节激素对（）酶的影响 9．作为信号跨膜传递的第二信使的物质有cAMP、（）、（）和（）等10．调节酶类主要分为两大类（）和（）。 11．真核生物基因表达的调节有两种类型的调控，一种是（）的调控；另一种是（）。 12．真核细胞中酶的共价修饰是（）；原核细胞中酶的共价修饰主要形式（）。二、选择题 1．各种分解途径中，放能最多的途径是： A、糖酵解 B、三羧酸循环 C、 —氧化 D、氧化脱氨基 2．操纵子调节系统属于哪一种水平的调节？ A、复制水平的调节 B、转录水平的调节 C、转录后加工的调节 D、翻译水平的调节 3．下列关于操纵基因的论述哪个是正确的？ A、能专一性地与阻遏蛋白结合 B、是RNA聚合酶识别和结合的部位 C、是诱导物和辅阻遏物的结合部位 D、能于结构基因一起转录但未被翻译 4．下列有关调节基因的论述，哪个是对的？ A、调节基因是操纵子的组成部分 B、是编码调节蛋白的基因 C、各种操纵子的调节基因都与启动基因相邻 D、调节基因的表达受操纵子的控制 5．以下有关阻遏蛋白的论述哪个是正确的？ A、阻遏蛋白是调节基因表达的产物 B、阻遏蛋白妨碍RNA聚合酶与启动子结合 C、阻遏蛋白RNA聚合酶结合而抑制转录 D、阻遏蛋白与启动子结合而阻碍转录的启动 6．下面关于共价修饰调节酶的说法哪个是错误的？ A、共价修饰调节酶以活性和无活性两种形式存在 B、两种形式之间由酶催化共价修饰反应相互转化 C、经常受激素调节、伴有级联放大效应 D、是高等生物独有的调节形式

微生物代谢与调控

一、金属离子或镁离子的意义无机盐是微生物生长必不可少的一类营养物。它们为机体提供必需的金属元素。这些金属元素在机体中的生理作用：参与酶的组成、调节酶的活性、维持细胞结构的稳定性、调节与维持细胞的渗透压平衡、控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等。 ①镁离子可以抵消磷酸链上的负电作用，减少了酶和多磷酸核苷链的作用；②磷酸基上镁离子和氧原子的相互作用，可以保证核苷酸的构造，确保其与酶的特异性结合；③镁离子可以在 ATP-Mg复合体和酶之间提供额外的作用位点，从而提高结合力。二、生长曲线是指细菌等单细胞微生物，以细胞增长数的对数值为纵坐标，以培养时间为横坐标作图时，可以绘出一个曲线，此曲线称为生长曲线。比生长速率μ：每小时单位质量的菌体所增加的菌体量称为菌体比生长速率。它是表征微生物生长速率的一个参数，也是发酵动力学中的一个重要参数。推算过程假定在任何时间（t），微生物细胞数目的增长速率（dN/dt）正比于已经存在的总细胞数目（N），则得：dN/dt=μN。经积分得：lnNt-lnN0=μt，对于一倍增时间，t=td ，Nt=2N0 的培养物：ln2N0-lnN0=μtd。易得：μ=l n2/td 。参数含义

μ——比生长速率，单位h-1 t——时间，单位h N——任何时间处微生物细胞量Nt——开始培养t时间过后生物细胞量N0——开始时微生物细胞量td——倍增时间，即为微生物细胞量变为原来的两倍所需的时间意义：比生长速率就是菌体生长速率与培养基中菌体浓度之比，它与微生物的生命活动有关，特别是在抗生素合成阶段，比生长速率过大，菌体量增加过多，代谢向菌体合成的方向发展，不利于合成抗生素。因此，必须将菌体比生长速率控制在一定范围内，以便使抗生素的生产速率维持在较高的水平。实际上比生长速率是生长与死亡速率平衡的综合反映。（μ=1/N*dN/dt）在对数生长期，μ是一个常数，这时 ln(N2/N1)=μt 代时generation time；doubling time，又称世代时间。当微生物处于生长曲线的指数期(对数期)时，细胞分裂一次所需平均时间，也等于群体中的个体数或其生物量增加一倍所需的平均时间。三、周质空间细菌细胞周质又称膜间质，指位于大肠杆菌( Escher ichia col i ) 等革兰氏阴性细菌细胞内膜和外膜之间的夹层空间，其大小随环境与胞质间渗透压的变化而改变，约占整个细胞体积的24% -40%。外膜上存在较多非特异性的孔道蛋白( porins) ，能够允