里氏木霉木聚糖酶基因XYN2的克隆与表达

第29卷第5期2007年9月

南　京　工　业　大　学　学　报

JOURNAL OF NANJ I N G UN I V ERSI TY OF TECHNOLOGY

Vol.29No.5

Sep.2007

里氏木霉木聚糖酶基因XY N2的克隆与表达

王向明1,欧阳嘉2,严　明1,许　琳1

(1.南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京210009;

2.南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037)

摘　要:采用RT2PCR(reverse2transcri p ti on PCR assay)技术,从里氏木霉QM9414mRNA中扩增出木聚糖酶基因XYN2,并与质粒pYX212相连,构建了组成型表达载体pYX212/XYN2.将此重组质粒转化入酿酒酵母菌株YPH499进行表达.分析了不同碳源、温度、摇瓶转速、初始pH对其产酶的影响.实验结果表明,最佳碳源是葡萄糖,最佳转速是260r/m in,最佳初始pH是610.优化重组菌的发酵条件后得到的最大酶活为0155I U/mL.

关键词:RT2PCR;Trichoder m a reesei XYN2基因;酿酒酵母;克隆;表达3

中图分类号: 文献标识码:A 文章编号:1671-7627(2007)05-0082-06

C lon i n g and expressi on of the T.reesei xyl ana se gene XY N2

WANG Xiang2m ing1,OUY ANG J ia2,Y AN M ing1,XU L in1

(1.College of L ife Science and Phar maceutical Engineering,Nanjing University of Technol ogy,Nanjing210009,China;

2.College of Che m ical Engineering,Nanjing Forestry University,Nanjing210037,China)

Abstract:X YN2gene frag ments were successfully a mp lified fr om Trichoder m a reesei strain QM9414mRNA by RT2 PCR(reverse2transcri p ti on PCR assay)technol ogy and were ligated t o pYX212vect or as the exp ressi on vect or pYX212/X YN2.Saccharo m yces cerevisia YPH499competent cells were transf or med with the recombinant p las m id and began ex p ressing.The effects of different carbon s ources,te mperature,r otary s peed and initial pH on xylanase p r oducti on of the recombinant were invrstigated.The result indicats that the op ti m al carbon s ource is glucose,the op ti m al te mperature is30℃,the op ti m al r otary s peed is260r/m in,and the op ti m al initial pH is610.The maxi2 mum xylanase activity of the recombinant is0155I U/mL after op ti m izing the fer mentati on conditi on.

Key words:RT2PCR;Trichoder m a reesei X YN2gene;S accharo m yces cerevisia;cl one;exp ressi on

为了应对全球化的能源危机,人们正在寻找新的替代能源.与石油能源相比较,生物乙醇由于具有环保、其生产原料可再生等特点,因此,国内外研发生物乙醇已成为当今的热点[1].半纤维素作为生物乙醇可再生原料的主要成分,占自然界中植物碳水化合物总量的1/3,而木聚糖(xylan)是植物半纤维素(he m icellulase)的主要成分,其占单叶和阔叶植物干质量的35%[2].因此,研究可降解植物半纤维素的木聚糖酶对充分利用自然界的可再生资源生产乙醇具有重要意义.

木聚糖酶(xylanases)(EC3.2.1.8)是木聚糖水解酶系中最关键的酶,可水解木聚糖主链骨架的β21,4木糖苷键.该酶可由以微生物为主的多种生物合成,包括细菌、黑曲霉、木霉等,其水解产物主要为低聚木糖(xyl o2oligosaccharides)、少量的木糖和阿拉伯糖[2].la Grange等[3]研究了组成型PGK启动子

3收稿日期:2007203220

基金项目:国家重点基础研究发展计划(“973”计划)资助项目(2003CB615701);国家自然科学基金资助项目(20336010)作者简介:王向明(1980—),男,江苏连云港人,硕士生,主要研究方向为分子生物学;

严　明(联系人),教授,E2mail:yanm ing@https://www.wendangku.net/doc/9a13616864.html,.

(磷酸甘油激酶启动子)引导下的里氏木霉木聚糖酶基因X YN2在酿酒酵母中的表达,酶活为9.58 I U/mL.我国没有里氏木霉木聚糖酶基因X YN2在其他宿主菌中克隆表达研究的报道.尽管我国在木聚糖酶研究方面仍落后于国际水平,但在食品与饲料等领域的研究有一定的基础和经验[4],对木聚糖酶基因的研究也在快速发展[3,5].

本文克隆出里氏木霉木聚糖酶基因X YN2的DNA片段,构建了具有组成型TP I(磷酸丙糖异构酶)启动子的穿梭质粒,转化入酿酒酵母YPH499菌株后,以6种不同碳源进行组成型表达.本课题对可降解木聚糖的重组酵母在不同碳源下的发酵进行了研究,为进一步开发出能高效利用木聚糖生产乙醇的优质菌种奠定了基础.

1　材料与方法

111　材　料

11111　质粒与菌株

质粒pYX212(江南大学),T2vect or(美国Pr o2 mega公司),大肠杆菌菌株DH5α、酿酒酵母菌株YPH499,为本实验室保存.

T.r eesei Q M9414(AT CC26921)培养于Volgel’s[6]液体培养基中,静置27℃培养8d后进行总RNA提取. 11112　酶与试剂

T R I Z OL试剂(美国invitr ogen公司),DEPC试剂(加拿大B i o Basic公司),限制性内切酶(美国纽英伦公司),T4DNA连接酶、低熔点琼脂糖(美国Pr omega 公司),PCR反应试剂、Taq DNA聚合酶及DNA Mark2 er(大连宝生物公司),氨苄青霉素(北京博大泰克公司),酵母提取物、胰蛋白胨(英国OX O I D公司),桦木木聚糖(美国Sig ma公司),3,52二硝基水杨酸(上海国药集团),其余试剂为国产分析纯.

11113　培养基

大肠杆菌完全培养基为LB(Luria2Bertani)培养基[7](筛选培养基含75μg/mL氨苄青霉素):蛋白胨2g/L、酵母提取物1g/L、氯化钠2g/L.质粒转化大肠杆菌克隆所用培养基为S OC培养基[7]:蛋白胨2g/L、酵母提取物015g/L、氯化钠0105g/L、氯化钾01186 g/L、硫酸镁112g/L、葡萄糖31963g/L.培养酿酒酵母的YP AD(Yeast Extract/Pep t one/Adenine/Dextr ose)培养基(AT CC109):葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母提取物1g/L、腺嘌呤半硫酸盐010075g/L.转化酿酒酵母用LTE(L i O Ac/Tris/E DT A)buffer:醋酸锂011mol/L、Tris2HCl0101mol/L、E DT A01001mol/L.

112　实验方法

11211　基因的获得

用Trizol试剂从里氏木霉中提取总RNA,采用RT2PCR(reverse2transcri p ti on PCR assay)方法得到cDNA,参照由Genebank数据库中查到的里氏木霉X YN2基因序列设计PCR引物.正向引物为5′2 CGG AATTCATGGTCTCCCTCACCT23′,反向引物为5′2CCCAAGCTTTT AGCTG ACG GTG AT23′(上海申能博彩公司合成).引物分别含有限制性内切酶EcoRⅠ、H indⅢ的酶切位点.以c DNA为模板,PCR 扩增木聚糖酶基因X YN2.PCR循环参数:94℃, 1m in;58℃,50s;72℃,1m in,共进行30个循环. 11212　酵母表达载体的构建

用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pY X212质粒与基因XY N2的PCR扩增产物,用TaKaRa连接试剂盒把质粒和载体连接起来,构建成酿酒酵母表达载体pY X212/ XY N2.重组质粒转化入大肠杆菌DH5α菌株克隆后保存.质粒提取采用上海申能博彩公司的质粒小提试剂盒;酶切按照美国NE B公司内切酶说明书进行;连接采用美国Pr o mega公司的T4连接酶试剂盒;细菌感受态制备和转化等基本基因操作技术参照文献[8];经琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段回收采用德国宝灵曼公司的DNA回收试剂盒回收纯化.

11213　重组质粒转化酿酒酵母

通过醋酸锂法制备酿酒酵母感受态:将YPH499空菌接入YP AD培养基,待其生长至OD

600

达到110时取25mL菌液集菌,加入5mL LTE buffer,混匀,弃上清液,再加0125mL LTE buffer.涂尿嘧啶缺陷型平板培养,30℃培养至转化子出现.

11214　木聚糖酶的表达及活性检测

木聚糖酶的酶活检测采用DNS法[9]:取100μL 粗酶液与200μL用0105mol/L柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液(pH=610)配成的质量分数为1%的桦木木聚糖溶液混合,50℃反应30m in,加入016mL DNS试剂,煮沸5m in,定容至5mL后用紫外分光光度计测550n m光吸收值[10].

2　结果与讨论

211　总RNA的提取

提取的总RNA通过琼脂糖电泳鉴定,结果见图1.图1中明亮的条带说明RNA被成功地提取出来.相对而言,泳道1的RNA的第3条带最暗,说明被降解的

38

　第5期王向明等:里氏木霉木聚糖酶基因X YN2的克隆与表达

RNA 最少,选择1号试样作为进一步研究的对象

.

1～4—泳道,电泳检测从里氏木霉中提取出的总RNA

图1　里氏木霉总RNA 电泳图

Fig .1　Total RNA electr ophoresis pattens of Trichoder m a reesei

212　RT 2PCR

RT 2PCR 产物在0.8%琼脂糖凝胶上的电泳结

果见图2.图2中显示片段大小约为672bp,经测序后分析,与Genbank 数据库中的基因X YN 2除了有5个碱基不同(第10个碱基由T 变成了C,编码的氨基酸由苯丙氨酸变成了亮氨酸;第79个碱基由C 变成了T,编码的氨基酸由脯氨酸变成了丝氨酸;第142个碱基由C 变成了T,编码的氨基酸由组氨酸

变成了酪氨酸;第371个碱基由G 变成了A,编码的

氨基酸由甘氨酸变成了谷氨酸;第566个碱基由T

变成了C,编码的氨基酸由苯丙氨酸变成了丝氨酸)外其余序列一致,近似率为9913%,基本可以断定

该条带即为目的基因X YN 2

.

M —DNA 标准品;L —基因XYN 2的PCR 扩增产物

图2　XYN 2基因片段的RT 2PCR 扩增电泳图

Fig .2　RT 2PCR p r oduct of X YN 2gene

213　载体的构建

21311　X YN 2基因表达载体的构建

把用RT 2PCR 方法得到的基因X YN 2与表达载体pYX212相连,构建成组成型表达质粒pYX212/X YN 2,构建过程见图3

.

图3　重组质粒pYX212/XYN 2的构建

Fig .3　Constructi on of the recombinant p las m id pYX212/XYN 2

48南　京　工　业　大　学　学　报　第29卷　

21312　表达载体的鉴定

用质粒提取试剂盒(上海申能博彩公司)把重组

质粒从大肠杆菌DH5α提取出来做EcoR Ⅰ与H ind Ⅲ

双酶切鉴定,结果见图4.图4中在500～750bp 间出现1条条带表明XYN 2基因成功构建入表达载体上

.

L —重组质粒pYX212/X YN 2的酶切产物;

M —DNA 标准品DL 2000

图4　重组质粒的酶切鉴定

Fig .4　EcoR Ⅰand H ind Ⅲdigest of recombinant p las m id

214　重组酵母的筛选与鉴定

将重组质粒转化入酿酒酵母尿嘧啶缺陷型菌株YPH499后,与原始菌、空质粒菌同时涂布尿嘧啶缺

陷型平板,重组菌生长而原始菌没有生长的事实和

重组菌与空质粒菌菌落PCR 的结果(图5)证明重组菌构建成功

.

1—空菌的PCR 扩增结果;2～4—重组菌的PCR 扩增结果;M —DNA 标准品DL2000

图5　重组菌的菌落PCR

Fig .5　Conolies PCR of Sacchoram yces cerevisiae recombinant

215　发酵条件的优化

21511　重组菌在不同碳源中的产酶情况

保持YP AD 培养基中其他成分不变,把碳源分

别替换为50g/L 葡萄糖、50g/L 蔗糖、50g/L 甘露

糖、50g/L 甘油、30g/L 甘油+20g/L 乙醇[11]

、20g/L 甘油+30g/L 乙醇进行发酵,其他发酵条件

为:发酵温度30℃,摇瓶转速200r/m in,初始pH 710.碳源对重组菌的生长的影响见图6.从图6可

以看出,分别以葡萄糖、蔗糖、甘露糖、甘油作为碳源时重组菌的生长曲线差别不明显,说明这4种碳源对该重组菌的生长影响不大.稳定期重组菌的OD 600值都在55100左右,其中能使重组菌生长得最好的碳源是蔗糖与甘油,最高OD 600值分别达到了60120与58186.在甘油与乙醇的混合碳源条件下,从第5d 开始,重组菌的生长量与在以上4种碳源情况下的生长量相差无几,从而进一步说明不同碳源对该重组菌生长的较小影响程度,而在最初几天中重组菌生长得较慢的可能原因是由于最初几天培养基中的较浓乙醇对酿酒酵母的生长具有抑制作用,而随着乙醇的消耗或挥发,乙醇浓度降至酿酒酵母耐受性范围内,使得此时的生长曲线与无乙醇培养基中酵母的生长曲线逐渐吻合

.

图6　重组酵母的生长与时间的关系

Fig .6　The relati on bet w een gr owth and ti m e of the t w o S.cerevisiae

transfor mants

由于重组基因是在组成型启动子下进行表达

的,重组菌在生长的同时也在不断地分泌木聚糖酶.不同碳源中单位菌量随时间的产酶情况见图7.由图7可知,以葡萄糖为碳源时重组菌的生长速度最快(在第4d 即达到稳定期),最大相对酶活(单位菌量产生的酶的活性)最高(在第8d 达到最高值),此时的实测酶活是01515I U /mL.

21512　重组菌在不同发酵温度下的产酶情况

在YP AD 培养基中,其他发酵条件不变(见2.5.1),考察了5种发酵温度对重组菌产生的相对木聚糖酶酶活的影响,结果见图8.图8显示重组菌在30℃时产生的相对酶活最高.

5

8　第5期王向明等:里氏木霉木聚糖酶基因X YN 2的克隆与表达

图7　重组酵母分泌木聚糖酶随时间的改变

Fig .7　The xylanase exp ressi on of the S.cerevisiae transf or mants

changed with ti m

e

图8　发酵温度对木聚糖酶相对活力的影响

Fig .8　Effect of fer mentati on te mperature on the relative activity

of xylanase

21513　重组菌在不同转速下的产酶情况

在YP AD 培养基中,其他发酵条件不变(见

2.5.1),考察了5种摇瓶转速对重组菌产生的相对木聚糖酶酶活的影响,结果见图9.图9显示重组菌在260r/m in 的转速下产生的相对酶活最高(由于条件有限,260r/m in 以上的转速条件没有考察).21514　不同初始pH 下重组菌的产酶情况

在YP AD 培养基中,其他发酵条件不变(见2.5.1),考察了6种初始pH 对重组菌产生的相对木聚糖酶酶活的影响,结果见图10.图10显示重组菌在初始pH 为610的条件下产生的相对酶活最高. 经过研究,重组酵母发酵产酶的最佳碳源为葡萄糖,最佳培养温度为30℃,最佳转速为260r/m in,最佳初始pH 为610.经过发酵条件优化的重组酵母

在组成型启动子下产生的木聚糖酶酶活最高值达到

图9　发酵转速对木聚糖酶相对活力的影响

Fig .9　Effect of fer mentati on r otary s peed on the relative activity of

xylanase

图10　发酵pH 对木聚糖酶相对活力的影响

Fig .10　Effect of fer mentati on pH on the relative activity of xylanase

0155I U /mL.

本文的实验结果与文献[3]报道的9.58I U /mL 的酶活有较大的差距,原因可能是由于在这2种重组菌中木聚糖酶基因的转录程度不同.文献[3]中转录基因的是PGK 启动子,而本文中引导基因转录的是TP I 启动子.启动子对基因表达的程度有着很大的影响,可能是本实验所用的酿酒酵母宿主YPH499表达系统中对TP I 与PGK 2种基因的本底表达程度不一样,导致2种基因中启动子的转录程度不一样,从而使重组质粒上受这2种启动子引导的木聚糖酶基因的表达程度不同.进一步可构建带有PGK 启动子的重组质粒来比较这2种启动子的转录强度,对本文的结论作出验证.

3　结　论

研究了将里氏木霉木聚糖酶基因引入酿酒酵母,在TP I 启动子与转录中止信号的调控下获得表达.在本身信号肽的引导下,表达产物被分泌至胞外.并对构建的酿酒酵母工程菌进行了发酵条件优

68南　京　工　业　大　学　学　报　第29卷　

化,得到了优化后木聚糖酶粗酶液的最大酶活.

通过发酵条件优化得出结论,本文构建的重组酿酒酵母分泌木聚糖酶的最佳碳源是葡萄糖,最佳温度是30℃,最佳转速是250r/m in,最佳初始pH 是610.

在构建表达载体pYX212/X YN2时,里氏木霉木聚糖酶基因的信号肽序列未被除去,所以表达的木聚糖酶是在自身的信号肽的作用下被引导至宿主菌的细胞壁上再分泌至胞外的.里氏木霉木聚糖酶的信号肽与酿酒酵母的信号肽序列不同,但在酵母中能得到高效的分泌,原因有待于进一步研究.

参考文献:

[1]　Kulkarni N,Shendye A,Rao M.Molecular and bi otechnol ogical

as pects of xylanases[J].FE MSM icr obi ol ogy Reviews.1999,23

(4):411-456.

[2]　李海燕,毛爱军,何永志,等.黑曲霉糖化酶和木聚糖酶基因

在工业用酿酒酵母中的共表达[J].菌物学报,2004,23

(4):494-501.

[3]　la Grange D C,Pret orius I S,van ZylW H.Exp ressi on of a Tri2

choder m a reeseiβ2xylanase gene(XYN2)in Saccharo m yces cerevi2

sae[J].App lied and Envir onmental M icr obi ol ogy,1996,62

(3):1036-1044.

[4]　刘亮伟,王明道,高玉千,等.木聚糖酶研究进展[J].河南农

业科学,2006(6):14-18.

[5]　汪浩,汪天虹.瑞氏木霉木聚糖酶Ⅰ基因的克隆、序列分析及

在酵母中的表达[J].山东轻工业学院学报,2002,16(3):

13-16.

[6]　Sandhu D K,Kalra M K.Pr oducti on of cellulase,xylanase and

pectinase by Trichoder m a longibrachitum on different substrates

[J].Trans B rMycol Soc,1983,19:409-413.

[7]　萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].黄培

堂,译.北京:科学出版社,2002.

[8]　Sa mbr ook J,RusselD W.Molecular Cl oning:a laborat orymanu2

al[M].Ne w York:Cold Sp ring Harbor Laborat ory Press,2001.

[9]　SomogyiM.Notes on sugar deter m inati on[J].The Journal of B i2

ol ogical Che m istry,1969,244:406-412.

[10]　Traff2B jerre K L,Jepp ss on M,Hahn2Hagerdal B,et al.Endoge2

nous NADPH2dependent aldose reductase activity influences

p r oduct f or mati on during xyl ose consump ti on in recombinant Sac2

charo m yces cerevisiae[J].Yeast,2004,21:141-150.

[11]　Burgers P M,Percival K J.Transfor mati on of yeast s pher op lasts

without cell fusi on[J].Analytical B i ochem,1987,163:

391-397.

78

　第5期王向明等:里氏木霉木聚糖酶基因X YN2的克隆与表达

木聚糖酶的基因克隆及表达

木聚糖酶的基因克隆及表达 木聚糖酶（xylanase）主要包括β-1，4-木聚糖酶、β-1，4-木聚糖内切酶等，是指能够将木聚糖降解为低聚木糖或单糖的一组酶的总称。木聚糖是植物半纤维素的主要成分，约占植物总糖的1／3，是自然界中除纤维素外含量最丰富的再生生物资源［1］。木聚糖酶在饲料、造纸、食品、医药、能源等领域应用较广。木聚糖酶广泛存于微生物中，目前已从不同来源的微生物中分离得到上百种木聚糖酶。在自然界中，绝大多数野生型木聚糖酶的最适温度为40～60℃，酶活性不高，热稳定性较差［2］。因此，研究者把研究重点放在了利用分子生物学手段对原始菌株的木聚糖酶基因进行克隆上，并对其进行表达，以期获得使用更加方便、特性更加优异的工程菌株。本文对聚糖酶特性等进行了回顾，对其基因克隆和表达作一综述，并对分子生物学技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。1木聚糖酶的研究现状国外对木聚糖酶的研究开始较早，生产技术及应用已趋于成熟。研究者对细菌、真菌和放线菌木聚糖酶的研究更加深入和广泛，早在1992年就已经实现了木聚糖酶的工业化生产。国内对木聚糖酶的研究起步较晚，但发展迅速。20世纪80年代初期，中国科学院微生物所张树政院士首先从海枣曲霉（Aspergillusphoenicis）中纯化得到了木聚糖酶Ⅰ~Ⅳ，并深入研究了活力较高的组分酶Ⅲ的酶学性质。目前，由于从这些野生型菌株中获得的木聚糖酶活性并不高，并且受到酶稳定性和底物特异性等方面的限制［2］，使研究者们将对木聚糖酶的研究重点放在了木聚糖酶基因克隆、表达和重组上，并在分子水平上对木聚糖酶进行改造。木聚糖酶基因克隆和表达的研究进展王丹丹1，2 综述，周晨妍1，付冠华1审校1.新乡医学院生命科学技术学院河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地，河南新乡453003；2.新乡医学院三全学院，河南新乡453003 摘要：半纤维素分解微生物在自然界的物质循环过程中起着重要作用，半纤维素是植物多糖的重要成分之一，而木聚糖则是半纤维素的主要成分。木聚糖酶（xylanase）可催化木聚糖的水解，在各种生物体内均发现木聚糖酶。在过去几十年中，已有上百种木聚糖酶基因被克隆至同源或异源宿主内来表达木聚糖酶，以期改变宿主特性并适于商业应用。本文综述了木聚糖酶基因的克隆和表达，并对基因工程技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。关键词：木聚糖酶；克隆；基因表达2木聚糖酶基因的克隆木聚糖水解酶系是一种复杂的复合酶系统，广泛分布于自然界的真菌和细菌中。已经报道的有细菌、真菌、酵母和放线菌等。在国内外研究最多的还是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。到目前为止，已经有上百种来自细菌和真菌等微生物中的木聚糖酶基因被克隆，并在不同的表达系统中成功表达。从近几年克隆和表达出的木聚糖酶基因主要来自细菌、真菌、酵母和放线菌等，而研究最多的是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。从这些野生菌种克隆出的木聚糖酶基因在不同宿主菌中已成功实现了异源表达。 木聚糖酶基因的表达3.1木聚糖酶基因在原核细胞内的表达木聚糖酶基因在原核细胞内的表达以大肠埃希菌的研究为热点。大肠埃希菌繁殖速度较快，是相对较理想的宿主细胞。将克隆得到的目的基因和原核载体经双酶切，胶回收产物与重组质粒经连接酶连接，转化合适的大肠埃希菌，选择培养基筛选阳性克隆子，并进行诱导表达。多数情况下，大肠埃希菌不但表达出目的蛋白，并且酶活力也有较大提高。见表2。 3.2木聚糖酶基因在真核细胞中的表达大肠埃希菌虽然繁殖速度较快，但由于其为原核生物，细胞外有一层厚厚的细胞壁，必须先破碎细胞壁，才能将目的蛋白释放出来，而真核细胞克服了原核细胞的这个缺点，可将表达的目的蛋白分泌到细胞外,便于分离纯化。能够表达木聚糖酶的真核细胞以酿酒酵母和毕赤酵母为代表，如水稻等真核细胞同样能够表达木聚糖酶，并且酶活也有一定程度的提高

食用菌木霉的危害症状及防治方法

食用菌木霉的危害症状及防治方法 木霉俗称绿霉。属于真菌门，半知菌亚门。在自然界中分布极广，对各种食用菌的致病力强，不仅危害菌丝体生长阶段，也危害食用菌子实体，它是生产中发生最普遍、危害性最严重的杂菌之一，不论制种还是栽培，也不论生料、熟料、发酵料、发菌期间均可发生，甚至在出菇阶段也有发生，个别品种如草菇的菌种在完成发菌后亦可发生该种杂菌，并且发生的温度范围也越来越广，不少地区的银耳、香菇，近年的平菇、鸡腿菇等生产中曾发生毁灭性的污染，木霉就是主要杂菌之一。 危害症状木霉的主要生物特征为其菌丝成熟期很短，往往在一周内即可达到生理成熟，然后即生出绿色霉层，即其孢子层。当基料被侵染后，菌丝阶段不易察觉，直到出现霉层时才能引起注意；起初只是点状或斑块状，当条件合适或食用菌菌丝不很健壮时，很快发展为片状，直至污染整个菌袋或料床，若不及时采取措施，菇棚内短时间即可成一片绿色，其孢子飞扬，周边棚墙上也将附着大量木霉孢子，给以后的生产留下严重隐患。 发生规律木霉主要生存在朽木、枯枝落叶、土壤、有机肥、植物残体上和空气中。许多栽培的老菇房，带菌的菇具和场所是主要的初侵染源，已发病所产生的分生孢子，可多次重复侵染更为频繁。木霉发病率的高低与环境条件的关系较大，木霉孢子在15-30`C下萌发

率较高，菌丝体在4-42`C的温度下均能生长，在25-30`C生长最快。孢子在空气相对湿度95%的条件下，萌发最快，相对湿度低于85%较难萌发。因此，在高温、高湿、通气不良和培养料呈偏酸性时，很容易滋生木霉。木霉侵染寄主后，与寄主争夺养分和空间，同时还分泌毒素杀伤、杀死寄主，把寄主的菌丝缠绕、切断。 防治措施（1）制种或熟料栽培拌料时按比例加入1：1000倍疣霉净，并严格灭菌，以彻底杀死其孢子。 （2）科学调配基料组分，使营养全面、均衡，以保证食用菌菌丝的健康和抗性，可对霉菌形成拮抗或抑制。实践证明，生产中按比例加入天天菇耳壮即可。 （3）发酵栽培时，加入疣霉净后，基料仍要发酵均匀，尽可能多的杀死或抑制其孢子。 （4）接种操作要严格、规范，不使霉菌孢子落于料中。研究发现，接种时，开启食用菌接种净化机5min后再进行操作，生产效果与常规甲醛熏蒸相仿，并且，杜绝了甲醛对人体的刺激，避免了甲醛残留的可能。 （5）菌种或菌袋发菌以及出菇期间，每5天左右对菇棚空闲处

里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展_覃玲灵

综述与专论 生物技术通报 BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N 2011年第5期 里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展 覃玲灵 何钢 陈介南 (中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙410004) 摘 要: 随着纤维素在能源、材料及化工等领域的广泛开发和应用,里氏木霉作为一种重要的产纤维素酶工业用菌种,越来越受到人们的广泛关注。为了提高其酶活,人们做了大量的工作,获得了一些相当好的突变株。对里氏木霉及其突变株的基因组进行研究,有助于人们理解其高效产酶的机制,同时也有利于构建其基因工程菌。介绍里氏木霉T r ichoderma reesei 的背景及其部分高产纤维素酶突变株,并阐述近些年来对其突变株的基因组的研究进展。 关键词: 里氏木霉 纤维素酶 突变株 基因组 SNV Research Develop m ent of Trichoder ma reesei and Its Cell ulase Hyperproduction Strai ns Q in L i ng ling H e G ang Chen Jienan (Instit ute of B i o l og ic al an d Environ ment al Science&T echnology,Ce ntral South University of Forest ry and Tec hnology,Changsha 410004) Abstrac:t A s w i de l y deve lop m ent and utilization of ce llulose i n the fi e l d of energy ,m ate rials and chem istry i ndustry,T r ichoderma reesei has been caught m ore and m ore attenti on for its be i ng a k i nd of i m portant ce ll u l ase stra i n for i ndustry .Fo r enhanc i ng i ts cell u l ase product ,peop l e hav e done a lot of work on it ,and ob tained seve ra l cons i derably good mutant strai ns .T o learn the genom e o f T r ichoderma reesei and its mu tant strains is he l p f u l to us understand its syste m o f ce llulase hype rproduction ,also he l p f u l to people construct its g enet ic eng i neering stra i n i n the f uture .T h i s article i ntroduced t he background o f T richoderma reesei and part of its hyperce llulase product stra i ns ,a l so elabo rated the research deve l op m ent of its m utan t strains geno m e i n t he recent yea rs . K ey words : T richoderma reesei Cell u l ase M u tant stra i n G enom e SNV 收稿日期:2010 11 24 基金项目:国家林业局 948 项目(2006 4 123) 作者简介:覃玲灵,女,硕士研究生,研究方向:生物质能源;E m ai:l canaceili ng @163.co m 通讯作者:何钢,男,教授,从事生物技术教学和科研;E m a i :l hegong262@yahoo .co https://www.wendangku.net/doc/9a13616864.html, 1 背景 随着人口不断增长,以及现有的煤、天然气和石 油存储量的减少,发展新能源成为实现经济社会可持续发展的必经之路。以纤维素、半纤维素和木质素形式存在的生物质收集并且存储了大量太阳能,是一种重要的能源和物质资源[1] 。地球上最主要的生物质来自绿色植物,每年光合作用的生物质净产量约为1800亿t [2] 。生物质中含量最多的是纤维素,其由成百上千个葡萄糖分子聚合而成,是地球上存在最丰富的有机大分子,储量约为850亿t [3] ;其次是半纤维素,储量约为500亿;t 第三类是木质素,由结构复杂的含芳香环的有机分子聚合而成,约 占20%,即350亿t [4] 。这些生物质大多以农业和林业废弃物的形式存在,并且每年都在大量积累,这不仅会导致环境的恶化,而且会导致这种可利用资源的流失[1] 。因此如何充分利用这些资源成为迫 在眉睫的问题,在对生物质的开发利用中,一个重要瓶颈就是如何高效利用微生物进行酶催化水解将生物质降解为单糖[5] 。 自然界中能降解和利用纤维素的微生物种类很多,许多细菌可分解纤维素,而且产生的纤维素酶具有高度专一性,但是它们生长速度慢,需要厌氧的生长条件[6],这些都限制了其应用。真菌所产生的纤维素酶多是胞外酶,便于分离和提取,且

小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性

植物学通报 2005, 22 (3): 313￣319①国家重点基础研究发展规划项目(G1998010100)资助。 ②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zouqi@https://www.wendangku.net/doc/9a13616864.html, 收稿日期: 2004-02-17 接受日期: 2004-09-20 责任编辑: 孙冬花 小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性① 　张 国 李 滨 邹 琦② (山东农业大学生命科学学院植物系 泰安 271018) 摘要 Rubisco 活化酶是广泛存在于光合生物中调节Rubisco 活性的酶, 我们利用PCR 技术, 从小麦(Triticum aestivum )叶片cDNA 文库中克隆得到Rubisco 活化酶基因cDNA 片段, 该片段长度为850 bp, 编码201个氨基酸。Northern blot 表明, 小麦叶片在暗诱导衰老的条件下, 叶片中活化酶基因表达水平逐渐下降; 同时, 小麦叶片的光合特性、叶绿素含量和Rubisco 活性呈现下降趋势。这些结果表明, 衰老时小麦叶片Rubisco 活化酶基因表达水平下降与光合速率下降密切相关。关键词 Rubisco 活化酶, 小麦, 衰老 Cloning and Expression of Rubisco Activase Gene in Wheat ZHANG Guo LI Bin ZOU Qi ② (Department of Botany, College of Life Science, Shandong Agricultural University , Tai’an 271018) Abstract Rubisco activase is an ubiquitous enzyme for the activation of Rubisco in photosynthetic autotrophs. A cDNA fragment of Rubisco activase gene was cloned from wheat (Triticum aestivum ). Northern blot showed that expression of the gene was down-regu-lated in dark-induced senescence leaves, where photosynthetic rate, chlorophyll content and Rubisco activity also showed obvious decline. The results suggest that the decreased expres-sion level of the gene was related to the decline in photosynthetic rate.Key words Rubisco activase, Wheat, Senescence Rubisco 是光合生物进行光合碳同化关键的双功能酶, 它催化RuBP 的羧化-加氧反应,但效率很低。因为加氧反应除了消耗能量,还损失了羧化反应中固定的25%的有机碳; 同时, 各种磷酸糖类能抑制Rubisco 的活性, 如:底物RuBP 本身就是Rubisco 的强烈抑制剂, 且活化态Rubisco 易于脱氨甲酰化而失活, 这些因素使Rubisco 成为光合速率的限制因子, 因 而也成为提高作物光合效率的研究目标。 Salvucci 等(1985)发现了Rubisco 活化酶(Rubisco activase, RCA), 它能够活化Rubisco,同时具有ATPase 活性; 也有人认为RCA 是一种分子伴侣(Spreitzer and Salvucci, 2002)。植物中Rubisco 的活化状态实际是Rubisco 的失活速率和RCA 活化Rubisco 速率间的平衡状态(Crafts-Brandner and Salvucci, 2000)。人

灵芝栽培中木霉的预防和治疗

灵芝栽培中木霉的预防和治疗 灵芝是一种名贵的中药材，近年来灵芝的生产发展很快，但在灵芝栽培中常因杂菌的污染造成不同程度的损失，其中绿色木霉是发生频率和危害程度最高的，在灵芝栽培的各个阶段均可发生。 灵芝是一种名贵的中药材，近年来灵芝的生产发展很快，但在灵芝栽培中常因杂菌的污染造成不同程度的损失，其中绿色木霉是发生频率和危害程度最高的，在灵芝栽培的各个阶段均可发生。绿色木霉广泛存在于自然界的各种有机物质和土壤中，还常以分生孢子的形式漂浮在空气中，它适应性强，特别是在营养丰富的基质上生长迅速，传播蔓延快，既可以和栽培的灵芝菌丝竞争养料，消耗养分，也可以分泌毒素破坏灵芝菌丝的细胞质，抑制灵芝菌丝的生长，严重影响着灵芝的产量和质量，是灵芝栽培中病害防治的重点。在近几年的栽培中我们采取了以预防为主、并辅助治疗的措施，取得了较好的效果。 1、选用抗杂性好、菌丝生长势强的灵芝品种。选用优质的灵芝品种是栽培成功的关键。抗病能力好、生长势强的品种不易被绿色木霉菌感染。 2、严格挑选栽培用种。所选菌种要求种性纯正，菌丝生活力强，菌丝洁白、浓密、健壮、菌龄适宜，防止菌种带入绿色木霉。 3、搞好栽培环境的清洁卫生。菇房内要清除菌渣、垃圾，彻底清洗栽培用架，并进行空间消毒，消灭杂菌隐匿场所，以减少传播媒介。搞好环境卫生对防止污染能起到事半功倍的效果。 4、严格选料。培养料要求新鲜、无霉变，用前要曝晒数天，培

养料配方要求合理，主料和辅料要充分拌匀，含水量控制在60%-70%左右，装量合适、松紧适度，装好后立即进行高压或常压灭菌，以防培养基的酸化。灭菌要求彻底。 5、接种中树立严格的无菌观念。由于空气中到处漂浮有绿色木霉的孢子，操作时不能因为肉眼看不见而麻痹大意，操作人员的双手、衣物和所用接种工具、材料须严格消毒，如选用接种室接种的操作人员应戴上帽子，以防头发上落有绿色木霉的孢子。接种动作要尽量快捷、熟练，防止接种过程中带入杂菌、杂菌孢子，对灭菌过程中破损的袋子用胶布封好，并在封口处用75%酒精消毒。 6、适当加大接种量，可使灵芝菌丝以绝对优势迅速占领地盘，减少杂菌的污染，起到以菇抑菌的作用。 7、保证培养室内具有适宜的小气候，把好菌丝培养关。控制25℃左右的温度、60%-70%的湿度，注意通风换气，严防高温高湿，创造灵芝菌丝生长的最适宜环境条件，促进灵芝菌丝快速生长，迅速占领整个料面。 8、认真抓好出芝阶段的培养管理工作。浙江一带灵芝栽培一般选在春季进行，出芝时正好是6、7月份的高温季节，子实体生长阶段由于需要较高的湿度，因此是防治绿色木霉污染的重要时期。灵芝原基长出后，要及时拔去棉塞或开袋，以免原基损坏而感染绿色木霉菌。做好保温保湿工作，同时加强通风和给予一定的光照，促使原基健康地长成子实体，子实体成熟后及时采摘。 9、加强早期防治。定期检查生长情况，一旦发现污染，应采取

绿色木霉

绿色木霉 木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌。 绿色木霉（Trichoderma viride）在自然界分布广泛，常腐生于木材、种子及植物残体上。绿色木霉能产生多种具有生物活性的酶系，如：纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等。在植物病理生物防治中具有重要的作用 绿色木霉是所产纤维素酶活性最高的菌株之一，所产生的纤维素酶对作物有降解作用，效果非常好，绿色木霉又是一种资源丰富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用。具有保护和治疗双重功效，可有效防治土传性病害。 使用方法 可直接加入腐熟剂、有机肥料、生物菌剂等肥料中，在分解纤维、病理防治中有重要作用。 1.1 形态学特征木霉的菌落生长迅速，呈不定型棉絮状或致密丛束状，其表面的颜色多呈绿色。菌丝有隔分枝，厚垣孢子有或无。分生孢子梗是菌丝的短侧枝，侧枝上对称或互生分枝，形成二级和三级分枝，分枝角度为锐角或近于直角，在分枝末端形成瓶状小梗。分生孢子多为卵圆形，无色或绿色，簇生于小梗顶端。 1.2 生态学特性 1.2.1 生长发育的物理条件 1.2.1.1 温、湿度生长适温为20－28℃，在6℃或32℃仍生长良好，它是一种嗜温真菌，在37℃条件下能生长，但在48℃条件下不能生长；木霉的生长要求较高湿度，其营养生长的相对湿度要求92%以上，孢子的形成需要93%－95%，因而木霉在潮湿土壤中的生命力较干性土壤中强。 1.2.1.2 光照若光照以对数比例增强可以促进分生孢子的产生，有研究发现380nm和440nm波长的光诱导力最强，而254nm和1100nm以外波长的光不可能诱导繁殖体的产生。木霉经日光处理3min或经紫外线光处理10-30s诱导产孢的效果更好。 1.2.1.3 pH值和CO2木霉的最适生长pH值为5－5.5，在pH值为1.5或9.0的培养基上也可能生长，但酸性条件比碱性条件下的萌发率更高。CO2对木霉生长的影响取决于CO2的浓度和培养基的pH值，在碱性基质中，高浓度的CO2有利于木霉菌的生长。 1.2.2 营养条件 1.2.2.1 碳源木霉菌株能够利用多种有机物作为碳源，较理想的是单糖、双糖、多糖、嘌呤、嘧啶和氨基酸等。绿色木霉在富含碳水化合物的培养基上大量产生酸类，用葡萄糖或淀粉作为碳源，该菌产生60%－80%的柠檬酸（理论上推算）。 1.2.2.2 氮源在缓冲介质中，铵是木霉菌最易利用的氮源，其他氮源如氨基酸、尿素、硝酸盐、亚硝酸盐也能维持其正常生长。以天冬门素为氮源生长特别好，含氮量低，会促进孢子形成，对高浓度硝酸盐的负影响由于硫酸镁的存在可以得到补偿。 1.2.2.3 无机盐及微量元素无机盐对木霉的生长很重要，对绿色木霉来说，镁离子能促进其生长，铜离子能促进分生孢子色素形成，铁离子对孢子的形成也很重要。

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛

里氏木霉原生质体的制备及转化

里氏木霉原生质体的制备及转化 摘要本实验通过将含潮霉素B抗性标记的质粒pAN7-1转化至里氏木酶原生质体中，在含100ug/ml潮霉素B的PDA平板上筛选转化子。并予以验证，结果表明，在1kb处有潮霉素抗性基因组，其中浓度为107个/ml的转化子效果最好。 关键词里氏木酶原生质制备转化 前言纤维素是自然界提供给人类的最宝贵的财富，植物每年通过光合作用产生数千亿吨的纤维素，但目前只有一小部分用于纺织、造纸、建筑和饲料等方面。木霉属是迄今被认为纤维素酶成分最全面，分解天然纤维素活力最高的一类菌。在育种方面利用高能电子、紫外线、亚硝基胍处理和原生质体融合等方法，使酶的活力得到很大的提高。本试验对里氏木霉原生质体的制备及转化进行了研究,为进一步的育种工作奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株及质粒来源 里氏木霉QM9414和质粒pAN7-1由深圳大学生命科学学院S402实验室刘刚老师提供。 1.1.2试剂及培养基的配制 1.1. 2.1 Mandels 营养盐浓缩液配制(NH4)2SO4 14 g，尿素 3 g，KH2PO420 g，CaCl2?2H2O 4 g，MgSO4?7H2O 3 g，ddH2O 定容至1L 1.1. 2.2 Mandels 微量元素浓缩液配制 FeSO4?7H2O 5 g，ZnSO4?7H2O 1.7 g，CoCl2?6H2O 23.7 g，MnSO4?H2O 1.6 g，ddH2O 定容至1L 1.1. 2.3 1 M柠檬酸缓冲液配制 柠檬酸210 g，NaOH（纯度96 %）78 g，ddH2O 750 ml，冷却后定容至1L 1.1. 2.4 60％的PEG4000 50 mM CaCl2，10 mM Tris·Cl（pH 7.5），60 g PEG4000加水定容到100 ml 1M CaCl25ml，1M Tris·Cl（pH 7.5）1ml，PEG4000 60g，ddH2O定容至100 ml 1.1. 2.5 STC 山梨醇218.6g（所需浓度为1.2 M），1M Tris·Cl（pH 7.5）10ml（所需浓度为10 mM），1M CaCl2 50ml（所需浓度为50 mM），ddH2O 定容至1L 1.1. 2.6 PDA培养基 去皮土豆200g，葡萄糖20g，琼脂(Agar) 15g，ddH2O定容至1L 其中20 %土豆浸出液制作方法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。筛选里氏木霉转化子时加入终浓度为100 μg/ml潮霉素。 1.1. 2.7 里氏木霉种子培养基 培养里氏木霉转化子时加入终浓度为100 μg/ml潮霉素。Mandels营养液浓缩液100 ml，Mandels微量元素浓缩液1 ml，1 M 的柠檬酸缓冲液（pH 4.5）50 ml，吐温80 2 ml，蛋白胨1g，ddH2O定容至900 ml，D-葡萄糖（单灭后加入）20g溶于100 ml ddH2O 1.1.2.8 原生质体再生培养基 用于里氏木霉原生质体再生培养，为含 有STC的里氏木霉种子培养基。 1.2M STC 500 ml，Mandels营养液浓缩液100 ml，Mandels微量元素浓缩液 1 ml，1 M的柠檬酸缓冲液（pH 4.5）50 ml，吐温80 2 ml，蛋白胨1g，ddH2O定容至900 ml，D-葡萄糖（单灭后加入）20g溶于100 ml ddH2O 1.1. 2.9 酶解液 称取100mg溶壁酶（Sigma）溶于已灭

木霉对土传病害的生防机制及其应用前景

木霉对土传病害的生防机制及其应用前景 【摘要】文章从竞争作用、重寄生作用、抗生作用、诱导抗性等四个方面对木霉防治土传病原菌的作用机制进行了概述,并对其应用前景进行了展望。 【关键词】木霉土传病害生防机制应用前景 近年来随着温室蔬菜栽培面积的不断扩大,保护地栽培已经成为设施农业发展的新特点,并产生了很好的经济效益,但由于保护地多年连作的原因,为土传病原菌提供了赖以生存的寄主和适宜的繁殖环境。枯萎病、根腐病、青枯病、根结线虫病等都是常见的土传病害,严重制约了高效农业的发展。土传病害可以通过采用喷施农药的手段进行防控,但农药的使用与当前绿色、环保的的大主题相悖,因此,生物防治则表现出了极大的优势。木霉菌就是一类普遍存在于土壤以及植物残体等环境中的生防益菌。它可以拮抗两种或两种以上的病原菌,为了使其发挥更好的效果,我们必须了解木霉拮抗真菌作用的机理[1],本文从竞争作用、重寄生作用、抗生作用、诱导抗性等多方面总结了木霉防治土传病原菌的作用机制,以求达到木霉菌的最佳生防效果,并对其应用前景进行展望。 1.木霉的生防机制 1.1 竞争作用竞争作用参与的双方是生防菌株和病原菌,他们主要是争夺营养和生长空间。木霉菌较病原菌对环境的适应性强,且生命力顽强,生长速度更快, 能够快速抢占生长的空间,将植物表面或侵入点附近低浓度营养物质作为起点,吸收营养,从而抢占病原菌的入侵位点[2],将病原菌的生长控制在很小的范围内。竞争作用机制在木霉菌拮抗植物根际的病原菌的作用较明显,对于已经有病害潜伏的植物根系,如果施用木霉的孢子悬浮液,一段时间后会发现木霉分布满根系的表面;相对地,不喷施木霉的根系,一段时间后,它的根系则布满了病原菌

里氏木霉概述

里氏木霉 一、里氏木霉概述：里氏木霉是多细胞的真核微生物，红褐肉座菌的无性型,隶属于丛梗孢目木霉属。其作为工业菌株用于生产分解不同植物材料的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等，已有多年历史。里氏木霉所产生的一种主要的纤维酶一纤维二糖水解酶，由单拷贝基因编码，其产量可达里氏木霉胞外分泌性蛋白总量的50%。由此可见，纤维二糖水解酶启动子是很强的启动子。因此在对里氏木霉的遗传改造中，常利用纤维二糖水解酶的启动子与终止子序列构建载体，并利的前导肽序列引导重组蛋白进行分泌性表达。里氏木霉具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力；并具有真核的分泌机制，很可能还具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能，如：高甘露糖型和N-糖基化等。由于里氏木霉具有以上优良性能，再加之其工业化规模发酵条件已比较成熟，这些都促进了对里氏木霉的遗传改造，为同源或异源分泌性蛋白的产生提供了一条行之有效的途径。 里氏木霉不仅具有适于蛋白生产的诸多优点，且对人没有毒性，在产酶条件下也不产生真菌毒素和抗生素。近年来的实践表明，经过基因工程手术改造的里氏木霉重组菌株是安全无害的。 二、里氏木霉使用说明：里氏木霉主产纤维素酶-纤维二糖水解酶，具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，一般采用的发酵方法有两种：固态发发酵和液体深层培养发酵生产纤维素酶，产生的纤维素酶是胞外酶。现在的固体发酵比较的成熟，液态发酵一般采用的是流加发酵。主要用于秸秆腐熟剂添加使用。

产品用途：作为饲料添加剂使用, 作饲料用：1.提高饲料原料中营养物质的转化，提高原料的消化能力和代谢能力，提高动物生产性能。 2.提高内源酶的分泌及活性，促进营养物质的消化吸收，提高饲料利用率。 3.促进动物肠道内有益菌的生长从而抑制有害菌的繁殖，有效提高了动物的免疫力，并有效防止腹泻。 使用量：建议添加80-100克/吨。 添加方法：均匀的混合于粉料中 保存方法:25℃以下低温干燥保存 产品包装：4kg一袋 保质期：阴凉干燥下12个月 注意事项:防暴晒、雨淋，避免高温或阳光直射；防止与皮肤或粘膜性物质接触。

一个快速响应干旱的F-box基因的克隆和表达分析

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.wendangku.net/doc/9a13616864.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.wendangku.net/doc/9a13616864.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.wendangku.net/doc/9a13616864.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.wendangku.net/doc/9a13616864.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.wendangku.net/doc/9a13616864.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发

木霉名录

木霉及其肉座菌有性阶段种类名录 1 Trichoderma aggressivum Samuels & Gams (侵占木霉) 1.1 Trichoderma aggressivum f.aggressivum Samuels & Gams (侵占木霉侵占 变种) 1.2 Trichoderma aggressivum f. europaeum Samuels & Gams (侵占木霉欧洲 变种) 2 Trichoderma arundinaceum Zafari, Fraf. & Sanuels (苇状木霉) 3 Trichoderma asperellum Samuels，Lieckfeldt & Nirenberg (棘孢木霉) 4 Trichoderma atroviride Karsten / Hypocrea atroviridis Dodd, Lieckfeldt et Samuels (深绿木霉/肉座菌) 5 Trichoderma aureoviride Rifai / Hypocrea aureoviridis Plowr. & Cooke (黄绿木霉/肉座菌) 6 Trichoderma austrokoningii Samuels & Druzhinina/Hypocrea austrokoningii Samuels & Druzhinina (澳洲康宁木霉/肉座菌) 7 Trichoderma brevicompactum Kraus, Kubicek & Gams (短密木霉) 8 Trichoderma candidum Chaverri & Samuels /Hypocrea candida Chaverri & Samuels (雪白木霉/肉座菌) 9 Trichoderma caribbaeum Samuels & Schroers (加勒比木霉) 9.1 Trichoderma caribbaeum var. aequatoriale Samuels & Evans (加勒比木霉 厄瓜多尔变种) 9.2 Trichoderma caribbaeum var. caribbaeum Samuels & Schroers (加勒比木 霉加勒比变种) 10 Trichoderma catoptron Chaverri & Samuels /Hypocrea catoptron Berk. & Broome (低头木霉/肉座菌) 11 Trichoderma ceraceum Chaverri & Samuels /Hypocrea ceracea Chaverri & Samuels (蜡座木霉/肉座菌) 12 Trichoderma ceramicum Chaverri＆Samuels /Hypocrea ceramica Ellis & Everh. (陶瓷木霉/肉座菌) 13 Trichoderma cerinum Bissett, Kubicek & Szakacs (蜡素木霉) 14 Trichoderma chlorosporum Chaverri & Samuels /Hypocrea chlorospora Berk. & Curtis (绿孢木霉/肉座菌) 15 Trichoderma chromospermum Chaverri & Samuels /Hypocrea chromosperma Curtis & Peck (色精木霉/肉座菌) 16 Trichoderma cinnamomeum Chaverri & Samuels /Hypocrea cinnamomea