土壤脲酶的测定方法

土壤脲酶的测定方法

脲酶试验原理：存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。

试剂：

1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液

标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml 苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500μg/g，另1份相应加入1.5ml的丙酮作为对照，然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量，

以便补充水分）。放置于25℃恒温培养箱，培养后第0d、1d，5d，10d（前10d 密封，后来测定的敞口）、20d，30d，40d，50d分别取土样检测脲酶的活性。取样前，反复旋转广口瓶，混匀土样，一个处理随机取3个重复。

1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中

2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟

3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔细

混合

4) 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h

5) 培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用

致密滤纸过滤于三角瓶中。

6) 显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸馏水，充分震荡，

然后加入4ml苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，

放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现（青定）酚的蓝色。

7) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm

液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。

8) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，

整个实验设置一个对照

9) 无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每

个土样都设此对照。

结果计算：土壤脲酶活性以24小时后100g土壤中NH3－N的毫克数表示。

M＝（X样品－X无土－X无基质）*100*10

式中：M－土壤脲酶活性值

X样品——样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数

X无土――无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫数X无基质――无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N 毫克数

100 ――样品定容的体积与测定时吸取量的比值

10 ――酶活性单位的土重与样品土重之比值

注意事项：当脲酶活性为3-80微克NH3-N时，本法能获得可靠结果。当脲

酶活性小于3微克NH3-N，培养时间需增至24小时（已经24h了）（计算时应考虑这一点）

计算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg数表示。

NH3-N（mg）＝a*2

A：从标准曲线查得NH3-N毫克数

2 ：换算成1k土的系数。

土壤容重、孔隙度、含水率等测定方法

1．土壤含水量(含水率)测定 采用酒精燃烧法测定。 操作步聚： (1)取小铝盒若干，洗净后烘干，用天平称出每—铝盒重量(逐一标量记录) (2)在标准地内挖土壤剖面，分20cm 一层。在分层的土壤剖面上用铝盒自下而上刮一层土(约半盒、注意避开根系和石砾等杂物)，马上称重(得出湿土重十铝盒重) (3)倒入酒精8－12ml ，振荡铝盒使与土壤混合均匀(如土壤很湿要用小刀拌匀成泥浆)，点燃酒精，在火焰将熄灭时，用小刀轻拔土壤，使其充分燃烧，烧完后再加入3～4ml 进行第二次燃烧(如土壤粘重、含水量较大，再加入2～3ml 酒精进行第三次燃烧)。 冷却后，马上称出重量(得干土重十盒重)。每层重复三次。 (4)土壤含水量及现有贮水量计算 ①土壤含水量(重量)＝％重（干土重＋盒重）－盒干土重＋盒重）（湿土重＋盒重）－（100? ＝水分重／干土重×l00％ ②土壤含水量(体积)＝） （）容重（土壤含水量（重量％）33g/cm 1g/cm ? ＝％土壤体积 水分体积100? (注：水的容重一般取lg ／cm 3) 2．土壤物理性质测定 采用环刀法 操作步聚： (1)首先量取环刀的高度和内径，计算出其容积(标记、做好记录)： V ＝πr 2H 式中：V —环刀体积(cm 3) R —环刀内半径(cm) H —环刀高度(cm) 将环刀在天平上称重(做好标记、记录)。 (2)选择标准地，在测定地点做一平台(山地)，挖土壤剖面，分层取样测定(按20cm —层)，每层设三个重复。 (3)打入环刀(一定要垂直打入，且不能晃动)，待土壤至环刀下沿齐平时，在环刀上垫—滤纸层后把盖盖好，挖出环刀，用刀削平底部土壤，垫好滤纸，盖好下盖。迅速称重(得：自然土重十环刀重)

土壤容重、比重测定及孔隙度计算

实验二十三土壤容重、比重测定及孔隙度计算 一、目的要求 土壤容重、比重和孔隙度是土壤松紧状况的反映，而土壤的松紧状况与土壤一系列理化性质，耕作情况等密切相关，因此测定土壤容重、比重与孔隙度的大小，可以作为判断土壤肥力高低的一项重要指标。 二、说明 土壤容重是指土壤在自然情况下，单位体积内所具有的干土重量，包括土壤孔隙在内，通常以（克/立方厘米）表示。通过土壤容重测定可以大致估计土壤有机质含量多少，质地状况以及土壤结构好坏。 土壤比重是指单位体积内固体干土粒的重量与同体积水重之比，不包括土壤孔隙在内，决定土壤比重大小的主要因素是土壤有机质含量和土壤矿物组成。 土壤孔隙度是指单位体积内土壤孔隙所占的百分数，土壤孔隙的数量与大小，密切影响着土壤透水、透气与蓄水保墒能力，它可由土壤容重、比重及土壤田间持水量计算而得。 三、方法 （一）容重测定：环刀法 1、在欲测容重地块挖坑，长、宽约1尺左右，坑深视土层情况而定，通常 1.5尺左右即可并将取土坑壁垂直切平。 2、将环刀垂直压入各层土壤中，如土壤紧实时，可在环刀上端垫一块木板，用铁锤击入土壤。环刀进入土层时勿左右摇摆，以免破坏土壤自然状态，影响容重。 3、用铁铲将环刀从土壤中挖出，小心削平下端，然后将上部钢环去掉，再削平上端，环刀内的土壤体积为100立方厘米，同样取三份，两份求其平均值，一份测定土壤毛管孔隙度。 4、将环刀内的土壤无损移入铝盒中，带回室内称重，土壤如在大铝盒中直接烘干时可不称重。 5、将大铝盒打开盖放入105℃烘箱中烘8小时，或取其中的土壤15—20克，放入小铝盒中，用酒精烧失法，求出土壤含水百分数。 6、计算：

土壤酶活性测定方法

土壤酸性磷酸酶活性的测定 1．试剂配制 (1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液 取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至 2 250ml.4摄氏度冰箱保存。 (2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀） 原液由以下成分组成: 三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g 溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL 或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯 (4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液： 36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤 置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。 培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过致密滤纸过滤到50ml容量瓶，用蒸馏水定容后在410nm处比色. 3．计算方法 土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示， W（mg·g-1·h-1）=M1/（m×t） 式中：M1—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的质量（mg）； t —反应时间（h）；=1h m—样品土壤的重量（g） 无土壤CK: 用1ml蒸馏水代替1g土壤；每批土样做2个；无基质CK: 用1ml蒸馏水代替1ml PNPP。每个处理做1个。 标准曲线的制作： 1）对硝基苯酚标液：1g对硝基苯酚定容1L，低温保存。 2）取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中，分别加pH6.5通用缓冲液4ml，Cacl2.2H2O 溶液1ml，NaOH溶液4ml， ②混匀后，定量滤纸过滤到50ml容量瓶，定容后，再取各浓度标液1ml定容至50ml，以0号试管作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。 ③以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R，即对硝基苯酚含量n（mg）=a+b×A410.

脲酶活力测定(纳氏试剂比色法)

实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法） 一、实验原理 脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。反应式： (NH 2)2CO+ H 2 O 脲酶 2NH 3 + CO 2 氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。反应式： NH 3·H 2O ＋2K 2HgI 4 + 3KOH HgO ·HgNH 2I ＋7KI + 3H 20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤 将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作： 取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。按下表步骤加入实（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min ，立即向样品管（3号管）加1 mol ·L -1 H 2SO 4 1.00mL ，终止反应。 三、结果计算 脲酶活力（U · mL -1) = ( A 3 - A 1 ）* 标准管中的NH 3微摩尔数 ( A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂 1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。 2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷

酸盐缓冲液适当稀释。 3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。 4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.2 5 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。 5 、1 mol·L -1 H 2SO 4 溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容 量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。 6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL 。此溶液含NH3为40μmol·mL-1。 7 、纳氏试剂：分别溶解3 . 5g 氯化高汞（HgCl2）于20mL热蒸馏水，10g碘化钾于5 mL水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。向此液中加70 mL30% KOH ，不断搅拌，再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。混匀，静置过夜，倾出清液贮于棕色试剂瓶（用橡皮塞）中放置暗处保存。 在有碘化汞情况下，可溶10 g HgI2和7 g KI于少量蒸馏水中，另溶16 gNaOH 于50mL 水中，待冷却后，将前者慢慢倒入其中，边加边搅拌，最后用水定容至100 mL 。过夜澄清后，倾出上清液存于棕色试剂瓶中。（配置方法之二）

土壤容重的测定

河北工程大学研究生课实验报告 垂直一维入渗实验报告 一、实验目的和意义 观察土壤垂直入渗过程，测定土壤累积入渗量、湿润锋运移距离，根据实测的累积入渗量计算相应的入渗率；通过土壤入渗实测资料，验证土壤水分运动参量间关系，如累积入渗量与时间关系、湿润锋运移距离与时间关系、入渗率与时间关系、累积入渗量与湿润锋关系、入渗率与湿润锋关系等，验证描述垂直一维入渗的常用模型，如考斯加可夫模型(Kostiakov)、菲利普模型(PhiliP)等；测定实验结束时不同深度的土壤含水量，绘制土壤含水量剖面曲线。 入渗是将地表水与地下水、土壤水联系起来的纽带，是径流形成过程、水循环过程的重要环节。垂直入渗是有重力作用的一维入渗，入渗率、累积入渗量和入渗距离（即湿润锋的位置）是描述入渗过程的重要特征量，针对于具体的入渗边界条件，上述特征量的取得对于区域产流产沙估算、农田灌溉、农田排水、地下水补给等效果评估有着重要的意义。 二、实验原理 实验装置由土柱和马氏瓶组成，土壤吸渗水分，土面上的水分减少，供给水面下降，使马氏瓶出水口所受外部压力减小，与马氏瓶内部压力差达到马氏瓶灵敏度时，马氏瓶进气口冒气泡进气，马氏瓶中的水流向土柱，如此反复，马氏瓶定水头自动供给土柱水量。 三、实验设备和装置 垂直入渗实验装置形式多样，但都由实为常用的垂验土柱和供水装置组成，图5-2

直入渗实验装置。实验土柱：目前，已发表论文中试验土马氏瓶可～20cm，土柱直径减小，柱直径范围在4.0供水管水层减小实验土样用量。为了提高实验精度，马进气口出水口进水口氏瓶截面积应相应减小，为了便于观察湿润锋和马氏瓶液面变化，实验土柱和马氏瓶用湿润锋～1透明有机玻璃管制成，土柱管壁交错打上土柱4排取土孔。出水口供水装置：供水装置采用带刻度的改进水室的马氏瓶，可实现恒定水头下自动供水。 改进的马氏瓶的工作原理：马氏瓶供水垂直入渗实验装置示意图5-2 图（高于马氏瓶出管的出水口所受压强等于P内（高于马），也等于）加上马氏瓶内空气压强水口的马氏瓶内水层的静水压强（hPP外马马）；土壤吸渗水分，使土柱(P)）加上大气压强h氏瓶出水口的土柱内水层的静水压强（大土11 共页1 第 河北工程大学研究生课实验报告 内供给水量减少，即供给水面下降，使得马氏瓶出水口所受压力P小于P，当供给水面内外继续下降，使ΔP（P-P）达到一定数值，达到马氏瓶灵敏度时，马氏瓶中的水流向土柱，外内马氏瓶进气口冒气泡进气，增大马氏瓶内空气压强，当马氏瓶供水管的出水口所受压强P内再次等于P时，马氏瓶进气口停止进气，马氏瓶中的水停止流向土柱；如此反复，使得马外氏瓶定水头自动供给土柱水量。 改进的马氏瓶的操作方法：将马氏瓶灌水口打开，关掉进气口和供水口，由灌水口向马氏瓶灌水，待灌到合适位置时，将灌水口塞子塞紧（或阀门关闭），打开供水口排气，当供水口不再流水时，表明排好气，关掉马氏瓶供水口。将马氏瓶放在合适位置，将马氏瓶的供水管接在土柱的进水口处。调整马氏瓶高度，打开供水口和进气口向土柱供水。 其它设备和仪器：土样、天平、铝盒、滤纸、量筒、洗耳球、小型取土钻（也可以用其它设备代替）、秒表、刻度尺。 四、实验步骤 1.土样经风干过2mm筛，按要求容重分层装入实验土柱，填装方法为： V体积所用干土重。先计算按要求容重填装 2??????m?V?R?H（1-1）干m RHRH为分；为土柱半径、高为,cm的环体所装干土质量，式中：g为半径为；干3-3?VRH、为要求达到的土壤容重,g.cm层装土高度,cm；高为为半径为的环体体积，cm。；V体积时所用湿土重为由于装土时常用一定含水量的湿土，按照要求容重填装?m)1?(m?（1-2）= 干湿?m V时所用含水量为θ的湿土重，g为按土壤容重；填装体积θ为填装所用式中：湿3?,m=854.12g, 2.0=30cm, =1.436g/cm。此次试验%R=2.5cm，H=15×湿土的含水量，=852g m湿装好后土柱应放置24h，使土壤剖面含水量均匀。将排好气的马氏瓶安装在合适位置（进气口高度略大于土柱设计水层高度），提高马2.然后拧紧进气口，氏瓶供水管末端与进气口齐平，使供水管完全充水，打开供水口和进气口，将马氏瓶供水管接到土柱的进水口上。，打开马氏瓶进气口，同时计时，开始实验。记下马氏瓶初始读数H3.0，，5min，7min，10min15min，在实验过程中4.,根据由密到疏的原则（如1min3min，）记录入渗时间、湿润锋运移距离和马氏瓶

土壤脲酶活性的测得

靛酚蓝比色法测定土壤脲酶的活性 一、实验目的： 1. 测定土壤脲酶活性的意义。 2. 掌握测定土壤脲酶活性的原理和方法。 二、实验原理 靛酚蓝比色法的基本原理是：被测物浸提剂中的NH4+，在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反应，生成水溶性染料靛酚蓝，其深浅与溶液中的NH4+－N含量呈正比，线性范围为0.05~0.5mg/l之间。 靛酚蓝反应原理如下: NH3 + OCl——NH2 Cl +OH- 三、实验试剂 1） 10%尿素：称取10g尿素，用蒸馏水溶至100ml。 2）柠檬酸盐缓冲液（PH=6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 3）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量无水乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用无水乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。 4）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 5）氮的标准溶液（0.1mg/ml）：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液。 四、实验过程 1.标准曲线的测定 吸取10ml氮的标准溶液定容至100ml，摇匀。从其中分别吸取0，1.00，3.00，5.00，7.00，10.00ml移至50ml比色管中，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，充分混合。加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将显色液在可见分光光度计上于578nm处，以1cm比色皿进行比色测定，以试剂空白为参比。以标准溶液氮含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。 2.土样中脲酶活性的测定 分别称取2g过1mm筛的风干土样于3个100ml锥形瓶中，向其中加入1ml甲苯，以使土样全部湿润为宜。放置15分钟后，加入5ml 10％尿素溶液和10ml柠檬酸缓冲液（pH=6.7），并摇匀。将锥形瓶放入37℃恒温箱中，培养24h。培养结束后，用热至38℃水稀释至刻度，充分摇荡，并将悬液用滤纸过滤到锥形瓶中。 设置有土无基质对照，即考察各种溶液和土壤中氨氮存在带来的影响。相当于其他实验中所做的空白对照。

容重的测定方法1

土壤容重的测定方法 土壤容重是指土壤在未受到破坏的自然结构的情况下，单位体积中的重量，通常以克/厘米3表示。土壤容重的大小与土壤质地、结构、有机质含量、土壤紧实度、耕作措施等有关。砂土容重较大，粘土容重较小。一般腐殖质多的表层容重较小。耕作土壤中，耕层容重一般为1.0-1.3克/厘米3，土层越深则容重越大，可达1.4-1.6克/厘米3。沼泽土的潜育层容重可达1.7-1.9克/厘米3或更大。土壤容重不仅用于鉴定土壤颗粒间排列的紧实度，而且是计算土壤孔隙度和空气含量的必要数据。 一、实验原理 利用一定容积的环刀切割未搅动的自然状态的土样，使土样充满其中，称量后计算单位体积的烘干土重量。本法适用于一般土壤，对坚硬和易碎的土壤不适用。 二、实验步骤 1、采样：在野外采样点选择好土壤剖面点，挖掘土壤剖面并按土壤发生层次自下而上每个土壤发生层次中部平稳打入环刀，待环刀全部进入土壤后，用铁锹挖去环刀周围的土壤，取出环刀，小心脱出环刀上端的环刀托，然后用削土刀削平环刀两端的土壤，使得环刀内土壤容积一定。 在采样过程中，每一个操作步骤都要小心确保不扰动环刀内的土壤，如发现环刀内土壤亏缺或松动，则应该弃掉已采集土样，重新采集。 2、室内测定（注意：以下操作前提是环刀的盖子不能调换，始终保持取样时的盖子）： （1）新鲜土样采集回来后立即称取重量（称之前需先将环刀外部的土清理干净），称完后记录数据为“环刀+湿土重”。 （2）称完后将换刀放入水中浸泡使其吸水达到饱和，吸水前要确认有洞的那一面是否垫纸，纸垫好后将环刀放入水中吸水，水位到达环刀一半以上即可，吸水时 要将无洞的那面盖子打开，使其充分吸水。（注意：此吸水时间为8小时，此步 骤可根据具体取样时间合理安排操作时间，使测定时间在可操作时间内。）（3）吸水8小时后，将环刀取出，并将换刀外的水擦干净，称取此时换刀的重量，记录为“环刀+饱和吸水后土重”，再将环刀放入沙盘中渗水，使其达到田间持 水量。（此步骤需注意将换刀外部水擦干，并且渗水时间为9小时）（4）渗水9小时后，将环刀擦干净称取，使其外围不得有沙，称取重量为“环刀+排水后土重”，称取完毕后将换刀打开放入烘箱内烘干。（烘干时间为24小时）（5）24小时之后，将环刀取出后冷却，称取重量为“环刀+烘干土重”，称取完毕后将土样倒出，将环刀洗干净后烘干。（此步骤需要将环刀冷却后称取，冷却时间 为半小时） （6）环刀干了后称取其重量，记录为“环刀重量”。 （7）数据记录完后应及时输入电脑以免数据丢失，并将纸质版和电子版及时交给指导老师。

土壤酶活性测定的实验步骤

土壤酶的测定 1．三角瓶用稀HNO 3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。 2．土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g，重复一次，14.5×2=29g。 一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323） 1．试剂配制： (1)0.3%过氧化氢溶液： ①（1：100 30%的H 2O 2和水） ②（0.5molH 2O 2+49.5ml蒸馏水） ③（1ml30% H 2O 2+99ml蒸馏水） (2)3N硫酸： （10ml硫酸+50ml水） (3)0.1N高锰酸钾溶液： （1.58gKMnO

4+100ml蒸馏水） 2．操作步骤： 2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml 0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H 2O 2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色 3．结果计算 过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1N KMnO 4的毫升数表示： M=（A－B）×T 式中： A： 空白消耗的0.1N KMnO 4毫升数 B： 滤液消耗的0.1 N KMnO 4毫升数 T： KMnO 4滴定度的校正值

以容量法测H2O2的酶活： Kappen （1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。此法根据H 2O 2与土壤相互作用时，未分解的H 2O 2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H 2O 2）测定H 2O 2的酶活 2 KMnO 4＋5H 2O 2＋3H 2SO 4→2MnSO 4＋K 2SO

实验五 固定化脲酶活力的测定

实验五固定化脲酶活力的测定 一、实验原理 固定化酶的活力测定方法，有振荡测定法、酶柱测定法和连续测定法等多种方法。常用的振荡测定法，是将一定质量的固定化酶放在一定形状和大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶的最适反应条件下，振荡或搅拌反应系统，反应一定的时间后，取出一定量的反应液，进行酶活力测定。酶活力测定的反应原理和方法与溶液酶活力的测定方法相同：脲酶催化尿素水解生成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比。故可测定脲酶活力的大小。 二、仪器和试剂 1、水浴锅，分光光度计，移液管，比色皿及其他常规仪器 2、实验四制备的固定化脲酶 3、磷酸缓冲液（pH 7.0）：6.7 g Na2HPO4.2H2O，3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏 水并定容至100 ml 4、3%尿素溶液：3 g尿素溶于磷酸缓冲液中，并定容至100 ml 5、标准氨溶液：称取在60℃干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322 g，蒸馏水溶 解并定容至100 ml。此溶液含NH3为40 μM 6、1 M H2SO4溶液：56 ml浓硫酸，缓慢加入盛有600 ml蒸馏水容量瓶中， 冷却后加水定容至1000 ml 7、纳氏试剂：称取16 g氢氧化纳，溶于50 mL水中，充分冷却至室温。另 称取7 g碘化钾和10 g碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐 注入氢氧化纳溶液中，用水稀释至100 mL，过夜澄清后，倒出上清液贮 于棕色瓶中，密塞保存。 三、实验步骤 1、将实验四中得到的凝胶包埋脲酶重新称重（m1）。取0.3-0.5 g，切碎。 2、取两支试管编号（1号空白管，3号样品管），分别称取凝胶包埋脲酶100 mg（m2）置于两管中，各加入蒸馏水9 ml，磷酸缓冲液1 ml，于30℃水 浴中保温5 min。

土粒密度(比重瓶法)_土壤容重_孔隙度测定

土粒密度的测定（比重瓶法） 严格而言，土粒密度应称为土壤固相密度或土粒平均密度，用符号ρs 表示。其含义是： s s s V m = ρ 绝大多数矿质土壤的ρs 在2.6g·cm -3～2.7 g·cm -3之间，常规工作中多取平均值2.65 g·cm -3。这一数值很接近砂质土壤中存在量丰富的石英的密度，各种铝硅酸盐粘粒矿物的密度也与此相近。土壤中氧化铁和各种重矿物含量多时则ρs 增高，有机质含量高时则ρs 降低。 文献中传统常用比重一词表示ρs ，其准确含义是指土粒的密度与标准大气压下4℃时水的密度之比又叫相对密度（（d s =ρs ·ρw -1）。一般情况下，水的密度取1.0 g·cm -3，故比重在数值上与土粒密度ρs 相等，但量纲不同，现比重一词已废止。 测定原理 将已知质量的土样放入水中（或其他液体），排尽空气，求出由土壤置换出的液体的体积。以烘干土质量（105℃）除以求得的土壤固相体积，即得土粒密度。 仪器和设备 天平（感量0.001g ）；比重瓶（容积50mL ）；电热板；真空干燥器；真空泵；烘箱。 操作步骤 1、称取通过2mm 筛孔的风干土样约10g （精确至0.001g ），倾入50mL 的比重瓶内。另称10.0g 土样测定吸湿水含量，由此可求出倾入比重瓶内的烘干土样重m s 。 2、向装有土样的比重瓶中加入蒸馏水，至瓶内容积约一半处，然后徐徐摇动比重瓶，驱逐土壤中的空气，使土样充分湿润，与水均匀混合。 3、将比重瓶放于砂盘，在电热板上加热，保持沸腾1h 。煮沸过程中经常要摇动比重瓶，驱逐土壤中的空气，使土样和水充分接触混合。注意，煮沸时温度不可过高，否则易造成土液溅出。 4、从砂盘上取下比重瓶，稍冷却，再把预先煮沸排除空气的蒸馏水加入比重瓶，至比重瓶水面略低于瓶颈为止。待比重瓶内悬液澄清且温度稳定后，加满已经煮沸排除空气并冷却的蒸馏水。然后塞好瓶塞，使多余的水自瓶塞毛细管中溢出，用滤纸擦干后称重（精确到0.001g ），同时用温度计测定瓶内的水温t 1（准确到0.1℃），求得m bws1。 5、将比重瓶中的土液倾出，洗净比重瓶，注满冷却的无气水，测量瓶内水温t 2。加水至瓶口，塞上毛细管塞，擦干瓶外壁，称取t 2时的瓶、水合重（m bw2）。若每个比重瓶事先都经过校正，在测定时可省去此步骤，直接由t 1在比重瓶的校正曲线上求得t 1时这个比重瓶的瓶、水合重m bw1，否则要根据m bw2计算m bw1。

土壤酶活性测定方法

土壤酶活性测定方法 土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h 内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品 实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯

脲酶的测定方法

一、脲酶测定(比色法) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。 1、试剂配制： （1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7， 并用水稀释至2L。 （2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢 氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B 两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。 （3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。 （4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。 （5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。 2、操作步骤 称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ; 往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24ｈ。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立 即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态 氮量。

土壤漆酶活性检测试剂盒说明书 微量法

土壤漆酶活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC1965 规格：100T/48S 产品内容： 试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×2瓶，4℃避光保存，临用前每瓶加7.5mL试剂一溶解。 试剂三：液体3mL×1瓶，常温保存。若有白色物质析出，放于37℃中溶解即可。 产品说明： 土壤漆酶（SL）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，广泛分布于真菌和高等植物中，具有较强的氧化还原能力，在纸浆生物漂白，环境污染物降解和木质纤维素降解以及生物检测方面有非常广泛的应用。 漆酶分解底物ABTS产生ABTS自由基，在420nm处的吸光系数远大于底物ABTS，测定ABTS自由基的增加速率，可计算得漆酶活性。 自备实验用品及仪器： 天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、震荡仪、30目筛（或更小）。操作步骤： 一、样本处理 新鲜土样风干，过30目筛。 二、测定操作 1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到420nm，蒸馏水调零。 2.加样表： 试剂名称测定管对照管 土样（g）0.030.03

试剂一（μL）135135 试剂二（μL）150- 37℃水浴反应10min。 试剂三（μL）1515 试剂二（μL）-150 4℃12000g离心15min，取200μL上清于420nm测定其吸光值，分别记为A测定管、A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照管。 三、土壤漆酶（SL）活性计算公式 （1）按微量比色皿计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟生成1nmol ABTS自由基所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 SL活性（U/g）=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T=0.833×△A÷W。 ε：ABTS自由基摩尔消光系数：36000L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，3×10-4L；W，样本质量，g；T：反应时间，10min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。 （2）按96孔板计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟生成1nmol ABTS自由基所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 SL活性（U/g）=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T= 1.39×△A÷W。 ε：ABTS自由基摩尔消光系数：36000L/mol/cm；d：比色皿光径，0.6cm；V反总：反应总体积，3 ×10-4L；W，样本质量，g；T：反应时间，10min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。 注意事项： 1.试剂一需临用前配制，并且尽快使用，4℃保存一周，若变色则不能使用。 2.测定之前进行预实验，若吸光值较高（A＞1.5），请减少土样质量再进行测定。若数值偏小可以延长反 应时间或增加土样质量进行测定。 3.离心后若上清仍然浑浊，可再次离心去除。

土壤酶活性测定方法综合

土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作 与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验 试剂纯度和基质自身分解。

两种脲酶活性定性测定方法及比较

两种脲酶活性定性测定方法及比较 随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。脲酶活性没有负值，最低为0。在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。国内很多大企业一般均采用0.2。 实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。 一.液态法 1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。 2.试剂 2.1尿素:GB696，分析纯。 2.2酚红指示剂 2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解； 2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。 3.操作方法 3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。 3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。 3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。 颜色出现时间脲酶活性 1min 极强 1～5min 强 5～15min 稍有 15min 无

土壤容重的测定

土壤容重的测定 土壤容重是指土壤在未受到破坏的自然结构的情况下，单位体积中的重量，通常以克/厘米3 表示。土壤容重的大小与土壤质地、结构、有机质含量、土壤紧实度、耕作措施等有关。砂土容重较大，粘土容重较小。一般腐殖质多的表层容重较小。耕作土壤中，耕层容重 一般为-1.3克厘米3，土层越深则容重越大，可达-1.6克厘米3 。沼泽土的潜育层容重可达 -1.9克厘米3 或更大。土壤容重不仅用于鉴定土壤颗粒间排列的紧实度，而且是计算土壤孔隙度和空气含量的必要数据。 测定土壤容重的方法很多，如环刀法、蜡封法、水银排开法等。环刀法是常用的方法之一。 实验原理： 利用一定容积的环刀切割未搅动的自然状态的土样，使土样充满其中，称量后计算单位体积的烘干土重量。本法适用于一般土壤，对坚硬和易碎的土壤不适用。 实验步骤： 准备工作：用凡士林在环刀内壁薄薄的涂抹一层，同时准备一定数量的铝盒，将铝盒逐个编号并称量记录铝盒的重量（准确到0.1g ），记为G 0。 采样：在野外采样点选择好土壤剖面点，挖掘土壤剖面并按土壤发生层次自下而上在每个土壤发生层次中部平稳打入环刀，待环刀全部进入土壤后，用铁锹挖去环刀周围的土壤，取出环刀，小心脱出环刀上端的环刀托，然后用削土刀削平环刀两端的土壤，使得环刀内土壤容积一定。 在采样过程中，每一个操作步骤都要小心确保不扰动环刀内的土壤，如发现环刀内土壤亏缺或松动，则应该弃掉已采集土样，重新采集。 烘干：将已采集好的环刀内土壤样品小心的全部转移到已知重量的铝盒内，称量铝盒及新鲜土壤样品地重量，记为G 1。将样品带回室内，放在 105℃烘箱内烘干至恒重，称量烘干土及铝盒重量，记为G 2。 测定土壤表层容重要做5个重复，底层做3个重复，测定表层土壤含水量要做3个重复，底层做2个重复。 结果计算 ?= (G1-G0)100 土壤容重（dv ）V(100+W) 2r h π环刀容积（V ）= 式中W 指土壤含水量（计算过程见土壤含水量） H 指环刀高度 R 指环刀有刃口一端的内半径 V 指环刀的容积 G 0指铝盒的重量 G 1指铝盒及湿土的重量 实验仪器及试剂： 环刀 铝盒 记号笔 削土小刀 小铁铲 托盘天平 烘箱 凡士林

土壤酶活性测定方法

土壤酶活性测定方法 一、蔗糖酶: 3，5-二硝基水杨酸比色法 1. 试剂配制 （1）2N氢氧化钠200mL：称取16g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定溶于200mL容量瓶中。 （2）3，5-二硝基水杨酸溶液1000mL：称5g二硝基水杨酸，溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中，再加300g酒石酸钾钠，用蒸馏水稀释至1000mL（不超 过7天）。 （3）1/15M 磷酸氢二钠1000mL：23.867g N a2HPO4·12H2O溶于1000mL蒸馏水中。 （4）1/15M 磷酸二氢钾1000mL：9.078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。 （5）pH5.5磷酸缓冲液100mL：5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M) （6）8%蔗糖1000mL：称取80g蔗糖，用水溶解，稀释至1000mL。 （7）甲苯。 （8）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）1000mL：取少量葡萄糖在真空干燥箱中，于55℃条件下真空干燥至恒重。然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄 糖母液（10mg还原糖/ml）。取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准 葡萄糖液（1mg/ml）； 2. 操作步骤 （1）标准曲线绘制：分别取标准葡萄糖液0.4mL，0.8 mL，1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。用蒸馏水补足至10mL。加入3.0mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，随即在自来水流下冷却。最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。 比色后，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，注入15.0mL 8%蔗糖溶液，5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，6000rpm离心10min。取1.0mL上清液（新鲜土样所吸取的上清液体积为1.0mL；风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL）于50mL比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。 为消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差。每一土样需做无基质对照。整个实验需作无土壤对照。 3．结果计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡萄糖（mg）=(a-b)×c 式中 a---从标准曲线查得的样品（加了基质）对应的葡萄糖浓度，mg/mL； b---从标准曲线查得的样品对照组的葡萄糖浓度，mg/mL； c---换算成1g土的系数。 二、脲酶: 靛酚比色法 1. 试剂配制 （1）pH6.7柠檬酸盐缓冲液1L：取184g柠檬酸溶于300mL蒸馏水中，另取147.5g KOH溶于水，再将两种溶液合并，用1N NaOH将pH调至6.7，并用水稀至1L。 （2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，然后用乙醇稀释至100mL(A液)，保存在冰箱中。称取27g NaOH溶于100mL 水中（B液），保存在冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混合，并用蒸馏 水稀释至100mL备用。 （3）次氯酸钠溶液100mL：取10%的次氯酸钠溶液9mL，用水稀释定容于100mL 容量瓶中，即活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 （4）10%尿素溶液500mL：取50g尿素，用水稀释至500mL。 （5）甲苯。

土壤脲酶的测定方法

土壤脲酶的测定方法 脲酶试验原理：存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。 试剂： 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至

1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液 标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500μg/g，另1份相应加入1.5ml的丙酮作为对照，然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量，以便补充水分）。放置于25℃恒温培养箱，培养后第0d、1d，5d，10d（前10d密封，后来测定的敞口）、20d，30d，40d，50d分别取土样检测脲酶的活性。取样前，反复旋转广口瓶，混匀土样，一个处理随机取3个重复。 1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中 2)向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟 3)之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔细混合 4)将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h 5)培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。