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分子生物学实验讲义

实验讲义

课程名称：分子生物学实验

课程性质：专业课

课程类型：必修课

专业：生物工程、生物技术、生物科学学时： 80、32

生物科学与工程学院分子生物学实验室

上部分

实验一实验室安全和分子生物学常用仪器使用实验二碱裂解法小量提取质粒DNA

实验三感受态细胞的制备及转化准备

实验四特异性片段PCR的扩增

实验五外源基因在大肠杆菌的诱导表达

下部分

实验六基因组DNA的提取

实验七利用ITS序列鉴定真菌

实验八外源基因在大肠杆菌中的优化表达

分子生物学实验课的要求

1.1 实验前

（1）了解本次实验的目的、要求，充分理解本次实验的原理、熟悉实验项目、操作步骤和程序，了解实验的注意事项。

（2）结合实验阅读相关理论知识，必要时还需要查阅一定的资料，做到充分理解实验原理与方法，力求提高实验课的效果。

（3）预测本次实验结果，对预测的结果尽可能地做出合理的解释。

（4）估计本次实验可能发生的问题，并思考解决问题的应急措施。

1.2 实验时

（1）遵守实验室规则。

（2）爱惜实验器械和样本；节约药品、水、电，确保实验完成。

（3）按程序正确操作仪器和器械，按实验步骤进行实验。

（4）认真观察和纪录实验结果，并加上必要的标记、文字说明；实验过程中还要思考出现了什么样的结果？为什么会有这些结果？这些结果有何意义？若出现非预期结果，还应分析其原因，尽可能地及时解决。

（5）实验中要有耐心，必须等前一项实验基本恢复正常后，才能进行下一项实验，注意观察实验的全过程。

1.3 实验后

（1）实验完成后要及时关闭仪器和设备的电源；按规定整理实验器具和处理废弃物。

（2）及时整理实验纪录，分析实验结果，做出实验结论。

（3）认真撰写实验报告，按时交给教师批阅。

实验一、实验室安全和分子生物学常用仪器使用

一、【实验目的】

（1）了解分子生物学实验室要求及各种规章制度

（2）了解实验的常规仪器、设备、耗材

（3）掌握本实验所用仪器的功能和使用方法

二、【实验内容】

1.温度控制系统：

1.1.冰箱: 根据药品、试剂及多种生物制剂保存的需要，必须具备不同控温级别的冰箱，最常使用的有：4℃、-20℃、-80℃冰箱。 4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等； -20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等； -80℃适合某些长期低温保存的样品、纯化的样品、特殊的低温处理消化液等的保存；0-10℃的冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。

1.2 液氮罐：有些实验材料、某些器官组织、细胞株、菌株及纯化的样品等，要求速冻和长期保存在超低温环境下，就需要一个液氮罐（-196℃）具有经济、省力和较好地保持细胞生物学特性的优点。

1.3 培养箱：37℃恒温箱用于细菌的固体培养和细胞培养； CO2培养箱适用于培养各种细胞，可恒定地提供一定量的CO2（通常5%），用来维持培养液的酸度（pH值）；37℃恒温空气摇床可进行液体细菌的培养。

1.4 水浴锅：用于保温。 25-100℃水浴摇床可用于分子杂交试验，各种生物化学酶反应等试验的保温。 25-100℃水浴箱用于常规试验。

1.5 烘箱：主用于烘干实验器皿，有些需要温度高些，有些需要温度低些。用于RNA方面的实验用具，需要在250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在42-45℃的烤箱中进行烘干。

2 水的净化装置：随着分子生物学的飞速发展，许多实验对水纯度的要求越来越高。

2.1 蒸馏水皿：单蒸水常难以满足实验要求。双蒸水、三蒸水配液，许多实验要去离子水。多次蒸馏水可除去水中挥发性杂质，不能完全除去水中溶解的气体杂质（Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Mo(Ⅵ)）。

2.2离子交换器：去离子水—用离子交换法制取的水，称去离子水。去离子效果好，但不能除去水中的非离子型杂质，其中常含有微量的有机物（树脂等）。

2.3超纯水：用蒸馏水、离子交换水、反渗透纯水做为供水，磁铁耦合齿轮泵作用使水循环。用于PCR、PCR氨基酸分析、DNA测序、酶反应、组织和细胞培养等。

3 菌消毒设备：分子生物学所用大部分试剂，而且实验用具都应严格消毒灭菌。

3.1 蒸汽消毒锅：用于小批量物品的随时消毒。大批实验物品、试剂、培养基可使用大型消毒且定时进行消毒

3.2 紫外线：75%乙醇、0.1%SDS（消毒剂）

一些耐高压、高温消毒且可用紫外线照射或乙醇和SDS浸泡。紫外线照射使用方便，且很方便，但灭菌效果与距离有关，且产生臭氧污染安全，用于无菌室，超净台和塑料用具的消毒。

3.3 滤器滤膜：不耐高温、高压的试剂用其处菌。

3.4 煮沸消毒：主用于金属器械和针急需时采用。

4 计量系统：

4.1 称量系统：（各种天平）台秤、托盘天平、钮力摆动天平、光电分子天平、精密电子分析天平4.2 液体体积的度量：精：量筒、移液管、微量取液器粗：刻度试管、烧杯、锥形瓶

4.3 pH值测量：

pH计：测定溶液中H+的直接电位的仪器，主要通过一对电极，在不同的pH溶液中产生不同的电动势用pH值表示出来。

pH试纸：只适用于培养液、酚饱和液、缓冲液或其它试剂溶液的pH值的粗略估计。而大部分试剂的配制要求严格的pH值，需精确度高（小数点后两位）的pH计。

4.4 OD 值测量：光密度、分光光度计是利用物质在可见光和紫外线区域中的吸收光谱来鉴定该物质的性质及其含量的一种仪器。它是由光源、单色器、吸收池、接收器、测量仪表或显示屏幕所组成。OD值是许多溶液中溶质定量的方便指标之一，通过所产生的单色光而测定某一溶液对该单色光的吸收值，利用它可进行核酸溶液定量和纯度的初步判断。

5 离心机：离心技术是研究生物的结构和功能中不可缺少的一种物理技术手段。因为各种物质在沉淀系数、浮力、和质量等方面有差异，可利用强大的离心力场，使其分离、纯化和浓缩。目前有各种各样的离心机。可供少于0.05ml到几升的样品离心之用。离心技术应用广泛，包括收集和分离细胞、细胞器和生物大分子等。据其转速的不同，可分为以下几种类型：

5.1 普通离心机：最大转速6000 r/m ，最大离心力6000g

①医用或台式离心机：是离心机中最简单而廉价的，最常用于收集快速沉降系数的物质，如红细胞、粗大的沉淀物、酵母菌和细菌等。

②低速冷冻离心机：主要用于细胞、细胞核、细胞膜和细菌的沉淀和收集等。

5.2 高速离心机：最大转速25000 r/m ，最大离心力89000g ，有冷冻和常温两种，多用于制备和手收集微生物、细胞碎片、细胞、大的细胞器、硫酸铵沉淀物以及免疫沉淀物等。

5.3 超速离心机：最大转速9000 r/m ，最大离心力694000g。

5.4 台式超速离心机：最大转速12000r/m ，最大离心力625000g。

6 超净工作台：内有紫外灯、照明灯、还应有酒精灯火焰、75%乙醇等灭菌的设备，是一种提供局部洁净度的设备。其原理是鼓风机驱动空气，经过低、中效的过滤器后，通过工作台面，使实验操作区域成为无菌的环境。超净台按气流方向的不同大致有几种类型：

①侧流式：净化后气流，从左侧或右侧通过工作台面，流向对侧，或者从上往下或从下往上流向对侧，他们都能形成气流屏障而保障台面无菌。缺点：在净化气流和外边气体交界处，可因气体的流向而出现负压，使少量的未净化气体混入，而造成污染。

②外流式：气流是面向操作人员的方向流动，从而保证外面气体不能混入。缺点：在进行有害物质实验时，对操作人员不利，但可采用有机玻璃把上半部分遮挡起来，使气流往下方流出。

7 电泳系统：电泳技术是检测、鉴定各种生物大分子的纯度、含量及描述它们的特征，甚至还是分离、纯化、回收和浓缩样品的工具之一。核酸和蛋白质等都带有电荷，当它们被置于电场中时，能够移动。

电泳装置由两部分组成：电源装置和电泳槽装置。

①电泳装置：电源需经稳流通过稳压器，既能提供稳定的直流电，又能输出稳定的电压。可用于三种：常度稳压电泳仪：输出电压0-500v 0-15mA；中度稳压电泳仪：输出电压400-1000v；高度稳压电泳仪：输出电压1000以上的电源装置。

②电泳槽装置：分两种即水平式电泳槽：一般分为微型电泳槽和大号水平式电泳槽；垂直式电泳槽：分垂直平板电泳槽和圆柱形电泳槽装置。

8 PCR仪：Polymerase Chain Reaction仪，也称DNA热循环仪，基因扩增，它是使一对寡核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数百万倍的靶序列DNA片段，它的每一循环包括在三种不同温度进行的DNA变性，引物复性，DNA聚合酶催化的延伸反应三个过程。

9 凝胶成像分析系统: 对电泳后含溴乙锭（EB）核酸样品的观察分析。

10 干燥设备：

10.1 真空加热干燥箱：核酸在硝酸纤维素膜和尼龙膜上固定，用于杂交实验。

10.2 电泳凝胶干燥箱：电泳后的凝胶进行脱水干燥的仪器，一般可将凝胶干燥到一些玻璃纸上，干燥后的凝胶易于保存。

10.3 液氮冷冻干燥：适用于活性蛋白质样品的干燥与结晶。

10.4 真空泵：许多实验都需要抽真空。如：乙醇沉淀后核酸样品的干燥，电泳凝胶的干燥等。

11 其他

11.1 微波炉：便于一些溶液的快速加热和定温加热，电泳琼脂糖凝胶配制、溶化等。

11.2 制冰机：用于制造大多数核酸、蛋白质的实验操作所需的低温环境，以减少核酸酶或蛋白质酶的水解。

11.3 层析装置：（色谱分离）是一种分离多组分混合物的有效物理方法。真空印记系统，DNA合成/测序仪：这些都是对核酸进行深入研究的必备仪器。

11.4 磁力搅拌器：多角度旋转混匀器、快速振荡混合器：用于混合仪器。

11.5 组织匀浆器：超声组织及细胞破碎器，用其进行样品的分离提纯实验。

11.6 通风橱：很多溶剂能逸出毒气，必备柜，放射性试验还要有有机玻璃屏蔽。

11.7 玻璃蒸馏器、电热加帽、变压器：用于酚等有机溶剂的蒸馏。

11.8 Tip头、Eppendorf管：微管移液器tip头（吸液尖）、Eppendorf管（微量离心管）可洗涤，硅化消毒后反复使用。对一些要求严格的实验，如RNA的提取、保存等操作，应使用新的消毒tip 头与Eppendorf管。另外还应备有常用规格的离心管（1000ml、500 ml、250 ml、50 ml、7 ml等）及96孔、24孔、12孔、6孔的细胞培养塑料平板等。

11.9 小型设备、用具：定时器、滤膜、保鲜膜、防护眼镜鸭嘴镊、常规的玻璃或塑料器皿（包括平皿、试管、烧杯、量瓶、试剂分液漏斗、避光保存的试剂应使用棕色试剂瓶，如饱和酚、巯基乙醇等）、记号笔、各种手套PE、乳胶、家用、防酸的等）

【小测验】

1.可调式微量取液器的使用方法？使用该取液器的注意事项？

2.分子生物学实验室的常规仪器设备有哪几大类？简单说明。

3.蒸馏水与去离子水的区别？PCR技术需要哪种纯度的水？

实验二碱裂解法小量提取质粒DNA

一、【实验目的】

1、掌握碱裂解法提取质粒原理及方法

2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法

二、【实验原理】

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们，E.Coli染色体约4700Kb，SDS是一种阴离子表面活性剂，它和NaOH共同作用既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性， SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA 以及基因组DNA从细胞中同时释放出来，基因组DNA断裂为线性双链片段，而质粒DNA仍为超螺旋，释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性，基因组DNA全部完全变性，而质粒DNA只有部分变性，然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA为小分子，两条互补链复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等通过离心一起沉淀下来而被除去。然后通过苯酚、氯仿等抽提蛋白，2倍体积无水乙醇或0.6倍体积异丙醇沉淀DNA，70％酒精洗后，干燥，用无菌的双蒸水或TE溶解，－20℃保存。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称CCCDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，（open circular DNA, 简称OCDNA）,线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，开环质粒DNA。但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。

三、【实验仪器、材料和试剂】

1、仪器、用具：恒温培养箱恒温摇床台式离心机高压灭菌锅琼脂糖凝胶电泳系统 :电泳仪、

电泳槽凝胶成像系统 1.5mL离心管移液器枪头一次性手套

2、材料：含pUC19质粒的大肠杆菌

3、试剂：

①溶液I：

成分：葡萄糖50mmo1／L （增加粘度，减少机械剪力破坏）

EDTA（pH 8.0） 10mmol／L（螯合金属离子，抑制Dnase）

Tris·HCl（pH 8.0） 25mmol／L（调pH）

可在使用前加入Rnase至终浓度0.8mg/mL

200mL溶液I配法：

葡萄糖.H2O 1.98g 1M EDTA（pH 8.0） 20mL 1M Tris·HCl（pH 8.0） 50mL 水定容至200mL，在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

500mL 1M Tris（pH 8.0）配法：Tris 60.5g先用400mL水溶解，再加入浓HCl约21mL，定容，待冷却后再调PH值

500ml 1M EDTA（pH 8.0）配法：Na2EDTA·2H2O 186.1g用用400mL水溶解，再加入NaOH 约5g，定容，再调PH，注意：PH至8.0时，EDTA才能完全溶解

②溶液II：（现配）

成分： 0.2mo1／L NaOH （DNA变性，裂解细胞）

1％ SDS （破坏细胞膜、核膜，蛋白质变性形成复合物沉淀）

100ml 0.4M NaOH配法：1.6gNaOH小心缓慢加入90ml水中，溶解，定容

100ml 2％SDS配法：2g SDS水溶解、定容100ml

③溶液III：（3M K+，5M Ac-,pH 4.8的高盐溶液）

KAc 3M（K+与SDS形成难溶性盐，与蛋白质形成沉淀）. 冰醋酸 5M（调pH）200ml溶液III配法：

KAc 58.8g 冰醋酸 23mL H2O定容至200mL

④50xTAE(50倍体积的TAE贮存液) pH 8.5：2M Tris-醋酸，100mM EDTA配1000mL 5xTAE：

Tris 242 g

冰醋酸 57.1 mL

Na2EDTA·2H2O 37.2 g

⑤凝胶加样缓冲液(6x)：

溴酚蓝 0.25％

蔗糖 40（W/V）

⑥溴化乙锭溶液(EB) 10mg／mL避光保存，工作浓度0.5mg/L

⑦20μg/ml胰RNA酶：将RNA酶溶于10mmol/L Tris?HCl(pH8.0)、15mmol/L NaCl中，配成的相应浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。

⑧琼脂糖、无水乙醇、Tris饱和酚、70％乙醇、双蒸水

⑨DNA分子量标准物

四、【实验方法与步骤】试剂盒法

1、将2 ml含氨苄青霉素素(3微升100 ug/ml)的LB液体培养基加入试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌单菌落，37℃振荡培养过夜，取10ul培养液加入100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜

2、取1.0ml菌液，加入1.5ml离心管中，10000 r/min离心1 min, 弃上清。使沉淀尽可能干燥。

3、加入200ul Buffer S1，悬浮沉淀,均匀,不留菌块。

4、加200 ul Buffer S2，盖紧盖，轻轻颠倒4-6次混匀，使菌充分裂解,可见鼻涕样粘稠物,不超过5 min。

5、加300 ul，Buffer S3,盖紧盖，轻轻颠倒4-6次使混匀，1-2 min（可见絮状沉淀）。13000 r/min ,离心10 min ，将上清转至制备管中, 注意制备管插入2ml 离心管。离心前要平衡.

6、将2ml 离心管与制备管一起离心,13000 r/min ,离心1 min，小心抽出制备管,弃2ml 离心管管底滤液。

7、将制备管置回2ml 离心管,加500ul，Buffer W1,13000 r/min ,离心1 min，弃滤液。

8、将制备管置回2ml 离心管,加700ul，Buffer W2,13000 r/min ,离心1 min，弃滤液。同样方法再进行一次。

9、将制备管置回2ml 离心管,13000 r/min ,离心1 min。

10、将制备管移到新2ml 离心管,在制备管膜中央加50ul灭菌水，静置1 min，13000 r/min ,离心1 min，管底即为质粒提取液。写上标签-20度保存

11、制备琼脂糖凝胶：取10×TBE缓冲液稀释成0.5×TBE缓冲液,待用，称取适量琼脂糖,置于200ml 锥形瓶中，加入适量0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为1％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

13、胶板的制备：将胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入生物素溶液1/万。将琼脂糖小心地倒入

胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀,速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5×TAE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

14、加样：取5ul 质粒与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA 含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿，在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入5ul 的100bp DNA ladder 。

15、电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA 片段从负极向正极移动）120V 电泳，DNA 的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5 V/cm 。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1－2cm 处，停止电泳。

16、成像：染色后观察在琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作）在波长为254nm 的长波长紫外灯下观察染色后电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛，用凝胶成像系统照相。五、【实验结果】

1 2 3

质粒pUC19 DNA 琼脂糖电泳检测图

1. 100bp DNA ladder

2. 质粒pUC19 DNA 经EcoRI 完全酶切

3. 自提的质粒pUC19 DNA

3.0Kb

2.0Kb

2.6Kb

六、【思考题】

1、实验中葡萄糖、EDTA 、Tris-HCl 、KCl 、HAc 、NaOH 、SDS 、Tris 平衡酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇的作用是什么？

2、影响电泳结果的因素有哪些？

实验三感受态细胞的制备及转化准备

一、【实验目的】

1、掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法

2、掌握热激法转化大肠杆菌的原理和方法

二、【实验原理】

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物,将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基(如含有氨苄青霉素)上。

三、【实验仪器、材料和试剂】

1、仪器、用具：高速离心机、恒温摇床、恒温培养箱、恒温水浴锅、培养皿、涂棒、吸头、枪试管、培养皿、酒精灯、镊子、灭菌牙签、1.5mL离心管等。

2、材料：质粒PUC19、大肠杆菌DH5a

3、试剂：

① LB液体培养基：配制每升LB液体培养基，应在950mL去离子水中加入：

胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g 酵母提取物(bacto—yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7．0，加入去离子水至总体积为1L，LB固体培养基加入0.5％琼脂,121℃高压灭菌20min。 (现用商品LB液体培养基)

②氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL溶液，置-20℃冰箱保存。

③ 0.1M CaCl2：100ml 0.1M CaCl2配法：CaCl2.2 H2O 1.47g，水定容100ml，高压灭菌。

四、【实验方法与步骤】注意无菌操作,低温

1、挑取LB固体培养基上生长的DH5a单菌落，接种于5 ml LB液体培养基中，37℃摇过夜；

2、取5ul培养液加入50ml LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，按1%接种量转接到100 ml LB液体培养基中，于37℃，150rpm摇约3小时，OD600值（0.4-0.6之间）较为合适；

3、无菌条件下，向无菌、冰预冷的1.5 ml离心管中加入1ml菌液，冰上放10-30 min；(2管/人)

4、4℃，5000 rpm，离心5-10min，超静工作台上弃上清液于废物瓶，留沉淀；

5、无菌下，一管加500μL冰预冷的0.1M CaCl2液,悬沉淀，移入另一管合并,冰上15-30 min；

6、4℃ ,5000 r/min,离心5-10 min，超静工作台上弃上清液于废物瓶，留沉淀；

7、每管加冰预冷0.1M CaCl 2溶液100ul,悬沉淀.此液为感受态细胞.(可保存于-80℃备用)

8、2人一组,一管中加入5ul 质粒，另一管加5 μL 无菌水,冰上放置10-30 min ；

对照：100 μL 感受态细胞＋5 μL 无菌水

处理：100 μL 感受态细胞＋5 μL 质粒DNA 溶液

9、42℃热激60-90 sec ，快速转移离心管到冰浴上，冷却5-10 min ；

10、每管加500μL 无抗性的LB 液体培养基，于37℃温育30-45 min ，使细菌复苏；

11、超净台上取对照,处理菌液各100μL,转移到含Amp100μg/mL 的LB 固体平板培养基上，涂均，待液体吸收后，倒置平皿，37℃培养12-16 h 。

五、【实验结果】

同时做两个对照: 对照: 此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。

处理: 此组正常情况下应产生大量菌落。

六、【注意事项】

1．实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源DNA 的污染。

2．实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。

3．必须设对照组，以检验实验过程中是否有污染。

4．整个实验过程均需置于冰上。

5．选用对数生长期细胞，OD600不应高于0.6。

七、【思考题】

实验中热激进行完之后，向管中加入1ml LB 液体培养基(不含Amp),混匀后,37℃振荡培养，目

的是什么？

图感受态细胞转化结果

实验四特异性片段ＰＣＲ的扩增

一、【实验目的】

掌握PCR反应的基本原理及方法

二、【实验原理】

多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )原理类似于DNA的变性和复制过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq 酶的最适温度（72℃）下，以引物3‘端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3‘方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。

三、【实验仪器、材料和试剂】

1、仪器、用具：PCR仪琼脂糖凝胶电泳系统移液器 PCR管 (0.2ml) 一次性手套

2、材料：质粒puc19

3、试剂：

① 10x缓冲液（Mg2＋ free）② dNTP（10mM each）

③ Taq酶（5U／uL）④ DNA模板：质粒puc19 上次各自提取的质粒DNA

⑤引物：（10uM） M13-F M13-R

⑥ MgCl2（25mM）⑦琼脂糖

⑧ DNA分子量标准物（100bp ladder）

四、【实验方法与步骤】

1、PCR反应体系

在0．2mL PCR小管内配制20uL反应体系：快速试剂盒法

体系成分单位 uL

ddH20 8

2× Taq-Mix 10

10uM引物1 0.5

10uM引物2 0.5

模板DNA 1

充分摇动混匀

分项试剂盒法体系成分

单位 uL ddH 20 14 10×PCR 缓冲液 2 10mMdNTP

0.4 25mmo1／L MgCl 2

1.6 10uM 引物1

1 10uM 引物2

1 模板DNA

0.5 5U/ul Taq 酶 0.5 充分摇动混匀

2、PCR 程序

①94℃预变性5min ；

②94℃变性 5～60s （推荐10s ）；

③52～56℃退火（推荐56℃） 5～60s （推荐10s ）；

④72℃延伸 5～60s （推荐10s ）；

⑤重复步骤②-④30次；

⑥72℃延伸5min 。

3、用1％琼脂糖凝胶:标记物=15ml ：1ul, 从PCR 小管分别取5μl 产物电泳检测，并拍照保存。

五、【实验结果】

六、【思考题】

用PCR 扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？

质粒pBI121上GUS 基因PCR 扩增产物电泳图 1. 1Kb DNA ladder 2,4,6. CK 3,5,7,8. PCR 产物 1 2 3 4 5 6 7 8 3Kb 2Kb 2.7Kb

实验五外源基因在大肠杆菌的诱导表达及检测

一、【实验目的】

掌握外源基因在原核细胞中诱导表达的原理和方法

二、【实验原理】

将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中表达。先让宿主菌生长，

lacⅠ产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正

常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG（异丙基硫代－β－D－半乳糖），阻遏蛋白

不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可以经SDS－PAGE检测。

三、【实验仪器、材料和试剂】

1、仪器、用具：恒温摇床培养用锥形瓶超静工作台垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳系统

2、材料：含pET28b control载体的大肠杆菌BL（DE3）

3、试剂：

① LB培养基② 100 mg/mL卡那霉素( Kana)过滤菌膜于灭菌小指管中，-20℃贮存。

③ 1 mol/L IPTG过滤菌膜于灭菌小指管中，-20℃贮存备用。④ 1.5 mol/LTris·HCl pH 8.8

1.0 mol/L Tris·HCI pH 6.8。⑤ 10％ SDS。⑥ 30％ Acr/Bis：29.2g Acr + 0.8g Bis，用双蒸

水定容至100mL，过滤备用，4℃存放。⑦ 10％ Aps：现配现用

⑧ 2x上样缓冲液(室温存放)

1.0 mol／L Tris·HCl pH6.8 1 mL 甘油 2 mL

SDS 0.4g 0.1％溴酚蓝 0.5 mL

2-ME 1.0mL 双蒸水定容10 mL

⑨ 5x电泳缓冲液(室温存放)

Tris 7.5 g, Gly 36 g, SDS 2.5 g,双蒸水溶解，定容至500mL，使用时稀释5倍使用.

⑩染色液：1g考马斯亮蓝R250溶于400ml下述脱色液中

脱色液：酒精：冰醋酸：水（5：1：5）

四、【实验方法与步骤】

1、含外源基因的表达菌株在LB(含50μg/mL Kana)培养基中预培养过夜(一定注意无菌操作)。

2、100mL LB培养基加入终浓度达50μg/mL的Kana（100mg/ml Kana,约50ul），按1％比例加入上

述LB 培养液，37℃恒温摇床，120rpm 培养14h,使其OD600值达0.7-0.8。

3、每组取2个灭菌三角瓶，各加上述菌液5ml ，之后一个加入5μL 1 mol/L IPTG ，终浓度达1.0 mmol/L ，进行外源基因的诱导表达，另一个不加IPTG 为对照。37℃,恒温摇床，200r/ min ，培养2h 。

4、从上述2个三角瓶各取1ml 培养物于离心管中,4℃离心，4000r/min ，10 min ，弃上清，各加50ul 2x 上样缓冲液悬浮沉淀，漩涡震荡混匀，沸水浴中保温2min ，12000rpm 离心3min ，上清待用。

5、配制分离胶（8％）,架好胶板，夹子固定。

双蒸水 4.6mL 1.5mol/LTris ·HCI(pH 8.8) 2.6mL 10％(W/V)SDS 100μL Aer/Bis(30％) 2.6mL TEMED 10μL 10％Aps 100μL 总体积10mL , 混匀后加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm 无水乙醇，约40min 。

6、配制5％浓缩胶

双蒸水 2.3mL 1.0mol/L Tris ·HCl pH 6.8 500uL 10％(W/V)SDS 40μL Acr/Bis(30％) 660uL TEMED 8μL 10％Ap 40μL

总体积 4mL, 混匀后加在分离胶上，插梳子，凝固后小心拨梳，冲洗样凹槽底部未凝丙烯酰胺。

7、电泳：一孔加5μL 标准蛋白，之后样孔分别加10μL 样品、对照。玻璃板凝胶放人电泳槽中，在槽中加入电极液，接通电源，电压80V ，当样品进入分离胶时，调节电压使恒定在120V 。当溴酚蓝到底部约0.5cm 时，断电，停止电泳。将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下胶。移去浓缩胶，将分离胶用考马斯亮蓝染色液染色,染色5～10min ，脱色2次，10min ，沸水煮至条带清楚。

8、凝胶用染色液染色5-10min ，脱色液脱色10min ，沸水中煮至条带清楚，目标蛋白约116KD 。

五、

【实验结果】

M 1 2 3 4 5 6 7 图外源基因诱导表达PAGE 电泳检测结果

M 标准分子量蛋白质 4,6,7 对照 1,2,3,5 加IPTG 94.4KD

目标条带

六、【思考题】

IPTG为什么会作为诱导剂？

医学分子生物学讲义复习重点

分子生物学 1.ORF 答:ORF是open reading frame的缩写，即开放阅读框架。在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码列，叫做一个开放阅读框架。 2.结构基因答：结构基因（structural genes）可被转录形成mRNA,并翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质或催化各种生化反应的酶和激素等。 3.断裂基因答：基因是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，一个基因不仅仅包括编码蛋白质或 RNA 的核酸序列，还包括保证转录所必需的调控序列、位于编码区 5 ' 端与 3 ' 端的非编码序列和内含子。真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（split gene）。 4.选择性剪接答：选择性剪接（也叫可变剪接）是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程，而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，或者，在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。 5.C值答：基因组的大小通常以其DNA的含量来表示，我们把一种生物体单倍体基因组DNA的总量成为C值（C value）。 6.生物大分子答：生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。 7.酚抽提法答：酚抽提法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。 8.凝胶过滤层析答：凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。 9.多重PCR 答：多重PCR技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等技术加以鉴别。 10.荧光域值答：荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值的设置是基线荧光信号的标准偏差的10倍。 11.退火答：温度突然降至37-58℃时，变性的DNA单链在碱基互补的基础上重新形成氢

现代分子生物学_复习笔记完整版.doc

现代分子生物学复习提纲第一章绪论第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学：以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控等过程，也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术（基因工程） ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） ●基因组、功能基因组与生物信息学研究第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间：19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一：肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二：噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括： ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些？ ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5～10位获诺贝尔奖的科学家，简要说明其贡献。

分子生物学实验指导(精)

分子生物学实验指导生物技术教学室编宁夏大学生命科学学院 2008年8月

实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。

实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。

建立一个分子生物学实验室所需的仪器

分子生物学技术信息关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器一、上游分子克隆分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：

二、核酸分子杂交核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。核酸分子杂交中常用的仪器：三、下游蛋白的表达及分离纯化目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达

分子生物学实验复习题附答案(最新整理)

分子生物学复习题实验一DNA的制备（1）为什么分子生物学实施时要担心EB？溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。（5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。（6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？

分子生物学实验技术考试题库

一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。

11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合

《分子生物学》实验指导(2015-2016)

《分子生物学》实验指导实验1 总DNA提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，

现代分子生物学课后答案(朱玉贤_第三版)上

第一章绪论 2.写出DNA和RNA的英文全称。答：脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid），核糖核酸（RNA, Ribonucleic acid）4.早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质？写出这些实验的主要步骤。答：一，肺炎双球菌感染实验，1，R型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。2，S型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。3，用加热的方法杀死S型细菌后注入到小鼠体内，小鼠不死亡；二，噬菌体侵染细菌的实验：1，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。2，DNA中P的含量多，蛋白质中P的含量少；蛋白质中有S而DNA中没有S，所以用放射性同位素35S标记一部分噬菌体的蛋白质，用放射性同位素32P标记另一部分噬菌体的DNA。用35P标记蛋白质的噬菌体侵染后，细菌体内无放射性，即表明噬菌体的蛋白质没有进入细菌内部；而用32P标记DNA的噬菌体侵染细菌后，细菌体内有放射性，即表明噬菌体的DNA进入了细菌体内。三，烟草TMV的重建实验：1957年，Fraenkel-Conrat等人，将两个不同的TMV株系（S株系和HR株系）的蛋白质和RNA分别提取出来，然后相互对换，将S株系的蛋白质和HR株系的RNA，或反过来将HR株系的蛋白质和S株系的RNA放在一起，重建形成两种杂种病毒，去感染烟草叶片。 6.说出分子生物学的主要研究内容。答：1，DNA重组技术；2，基因表达调控研究；3，生物大分子的结构功能研究----结构分子生物学；4，基因组、功能基因组与生物信息学研究。第二章染色体与DNA 3.简述真核生物染色体的组成及组装过程真核生物染色体除了性细胞外全是二倍体，DNA以及大量蛋白质及核膜构成的核小体是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）构成的扁球状8聚体。蛋白质包括组蛋白与非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体，含有大量赖氨酸核精氨酸。非组蛋白包括酶类与细胞分裂有关的蛋白等，他们也有可能是染色体的结构成分由DNA和组蛋白组成的染色体纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。 1.由DNA与组蛋白包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形成直径约10nm的核小体串珠结构，这是染色质包装的一级结构。 2.在有组蛋白H1存在的情况下，由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，每圈6个核小体，形成外径为30nm，内径10nm，螺距11nm的螺线管，这是染色质包装的二级结构。 3.由螺线管进一步螺旋化形成直径为0.4μm的圆筒状结构，称为超螺线管，这是染色

分子生物学实验

分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月一、教学目标本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。二、教学内容和学时分配实验一、实验总论5 学时基础性主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌）教学要求：了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范；掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选）教学要求：了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术；理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；

分子生物学期末考试重点

1.定义重组DNA技术将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，然后在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。 2.说出分子生物学的主要研究内容 1.DNA重组技术 2.基因表达研究调控 3.生物大分子的结构功能研究 4.基因组、功能基因组与生物信息学研究 3.简述DNA的一、二、三级结构一级：4种核苷酸的连接及排列顺序，表示了该DNA分子的化学成分二级：2条多核苷酸连反向平行盘绕所形成的双螺旋结构三级：DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定的空间结构 4.原核生物DNA具有哪些不同于真核生物DNA的特征？ ①DNA双螺旋是由2条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成，多核苷酸的方向由核苷酸间的磷酸二酯键的走向决定，一条是5---3，另一条是3---5②DNA双螺旋中脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧构成基本骨架，碱基排在内侧③两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对 5.DNA双螺旋结构模型是由谁提出的？沃森和克里克 6.DNA以何种方式进行复制，如何保证DNA复制的准确性？线性DNA的双链复制：将线性复制子转变为环状或者多聚分子，在DNA末端形成发卡式结构，使分子没有游离末端，在某种蛋白质的介入下在真正的末端上启动复制。环状DNA 复制：θ型、滚环型、D型 ①以亲代DNA分子为模板进行半保留复制，复制时严格按照碱基配对原则 ②DNA聚合酶I 非主要聚合酶，可确保DNA合成的准确性

③DNA修复系统：错配修复、切除修复、重组修复、DNA直接修复、SOS系统 7.简述原核生物DNA复制特点只有一个复制起点，复制起始点上可以连续开始新的DNA复制，变现为虽只有一个复制单元，但可以有多个复制叉 8.真核生物DNA的复制在哪些水平上受到调控？细胞生活周期水平调控；染色体水平调控；复制子水平调控 9.细胞通过哪几种修复系统对DNA损伤进行修复？错配修复，恢复错配；切除修复，切除突变的碱基和核苷酸片段；重组修复，复制后的修复；DNA直接修复，修复嘧啶二聚体；SOS系统，DNA的修复，导致变异 10.什么是转座子？分为哪些种类？是存在于染色体DNA上可自主复制和移动的基本单位。可分为插入序列和复合型转座子11.什么是编码链？什么是模板链？与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链，另一条根据碱基互补配对原则指导mRNA 合成DNA链称为模板链 12.简述RNA的种类及其生物学作用 mRNA：编码了一个或多个多肽链序列。 tRNA：把mRNA上的遗传信息变为多肽中的氨基酸信息。 rRNA：是核糖体中的主要成分。 hnRNA：由DNA转录生成的原始转录产物。 snRNA：核小RNA，在前体mRNA加工中，参与去除内含子。 snoRNA：核仁小RNA，主要参与rRNA及其它RNA的修饰、加工、成熟等过程。scRNA：细胞质小RNA在蛋白质合成过程起作用。

分子生物学终极复习资料汇总

《分子生物学》复习题 1、染色体：是指在细胞分裂期出现的一种能被碱性染料强烈染色，并具有一定形态、结构特征的物体。携带很多基因的分离单位。只有在细胞分裂中才可见的形态单位。 2、染色质：是指细胞周期间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白和少量RNA 组成的复合结构，因其易被碱性染料染色而得名。 3、核小体：染色质的基本结构亚基，由约200 bp的DNA和组蛋白八聚体所组成 4、C值谬误：一个有机体的C值与它的编码能力缺乏相关性称为C值矛盾 5、半保留复制：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自6、亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制 6、DNA重组技术又称基因工程，目的是将不同的DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。 7、半不连续复制：DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。 8、引发酶：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。 9、转坐子：存在与染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。 10、多顺反子：一种能作为两种或多种多肽链翻译模板的信使RNA，由DNA 链上的邻近顺反子所界定。 11、基因：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。 12、启动子：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 13、增强子：能强化转录起始的序列 14、全酶：含有表达其基础酶活力所必需的5个亚基的酶蛋白复合物，拥有σ因子。（即核心酶+σ因子） 15、核心酶：仅含有表达其基础酶活力所必需亚基的酶蛋白复合物，没有σ因子。 16、核酶：是一类具有催化功能的RNA分子 17、三元复合物：开放复合物与最初的两个NTP相结合，并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后，转变成包括RNA聚合酶，DNA和新生的RNA的三元复合物。 18、SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。30S亚基通过其

现代分子生物学总结题库

第一章、基因的结构和功能实体及基因组 1、基因定义基因（遗传因子）是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，携带有遗传信息的DNA序列，是具有遗传效应的DNA分子片段，是控制性状的基本遗传单位，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复（DNA repairing）是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的DNA损伤事件，就不能生存。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。3、DNA损伤 DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为：substitutation （替换）deletion （删除）insertion （插入）exon skipping （外显子跳跃）。 DNA损伤的改变类型：a、点突变：指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤（A与G之间的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C与T之间的替代）称为转换（transition）；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换（transvertion）。b、缺失：指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入：指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动（reading frame shift），使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变（frame-shift mutaion）。d、倒位或转位：（transposition）指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 e、双链断裂：对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 4、同源重组同源重组，（Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday 结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法同源重组(homologousrecombination)是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。

分子生物学实验心得体会

关于分子生物学实验的体会梁慧媛（生技01 级）不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。分子生物学实验心得体会刘东强（生科01 级）分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值刘佳凝（生技01 级）一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我

分子生物学试验基础知识

分子生物学实验基础知识分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。一、基因工程的常用工具（一）载体载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。（二）工具酶

肿瘤分子生物学讲义

肿瘤分子生物学讲义第一节概述 (1) 第二节肿瘤的发生机制 (4) 第三节癌基因及其致癌的分子机制 (5) 第四节抑癌基因及其抑癌的分子机制 (9) 第五节肿瘤转移相关基因 (11) 第六节肿瘤的预防和治疗 (13) 第一节概述一、肿瘤及肿瘤分子生物学的概念肿瘤（tumor）是一类疾病的总称，它们的基本特征是细胞增殖与凋亡失控，扩张性增生形成新生物。肿瘤可分为良性肿瘤（benign tumor）和恶性肿瘤（malignant tumor）。良性肿瘤生长缓慢，虽可增长至相当大的体积，但仍保留正常细胞的某些特性，通常在瘤体外有完整的包膜，手术切除后患者预后良好。绝大多数良性肿瘤基本上是无害的，不引起或很少引起宿主损伤。不过有极少数良性肿瘤因其靠近生命中枢或能合成大量生物活性物质也可能杀伤宿主。例如，脑膜上生长缓慢的良性肿瘤通过压迫使得生命中枢萎缩破坏，最终导致宿主死亡；胰岛细胞良性肿瘤可以分泌大量胰岛素而引起体内胰岛素过量，导致低血糖和死亡。恶性肿瘤统称为癌症（cancer），它不同于良性肿瘤的最重要的特性是能侵袭周围组织，疾病晚期癌细胞发生远端转移，破坏受侵袭的脏器，最终使机体衰亡，但如能在侵袭转移前切除癌瘤，一般预后明显改善。由于技术水平的限制，目前临床诊断的癌症患者多处于中晚期。加上不良生活方式如吸烟、过度饮酒、不合理饮食习惯，以及环境污染增加等因素，在刚过去的20世纪，世界各国许多常见癌症的发病率在总体上呈上升趋势，或维持在高水平，在我国的情况亦大致如此。目前除几种较少见的癌症如妇科的宫颈癌、绒癌等的死亡率有明显下降外，多数常见恶性肿瘤死亡率还处于令人忧心的高位态势下。有研究者预测，在21世纪癌症仍将是危害人类健康的主要疾病之一，故应引起预防、临床和基础研究者的高度关注。恶性肿瘤几乎在所有类型的细胞中均可发生。根据组织学来源，癌症的起源可分为三种：癌（carcinoma）起源于上皮细胞，大部分成人癌症属此类；淋巴瘤起源于脾和淋巴结等的淋巴细胞；肉瘤（sarcoma）起源于间叶组织如结缔组织、骨和肌肉等。以上在各种实质性组织、脏器中发生的癌症属实体肿瘤（solid tumor）。白血病起源于骨髓造血细胞，恶性细胞存在于流动的血液中，属液体肿瘤（liquid tumor）。肿瘤分子生物学，就是用分子生物学的理论和技术来研究肿瘤的一门科学，是医学和生物学的一门交叉学科二、肿瘤的生物学特征 1、癌症是体细胞遗传病就本质而论，癌症是一种遗传学疾病或体细胞遗传学疾病，可简称为遗传病。在癌细胞中发生的遗传学变异有：基因内的碱基替代、缺失、插入和基因扩增等，以及染色体的数量和结构的改变，如非整倍体、易位等；表遗传学改变有：DNA甲基化型式改变、组蛋白修饰和染色质改型等。这些改变引起了肿瘤抑制基因灭活和原癌基因的活化，它们所产生的恶性表型通过有丝分裂能在细胞世代间传递。上述过程均发生在体细胞，这是占全部癌症中绝大多数的、散发性癌症的发生模式。遗传性癌综合征不同于其他一些遗传病，它遗传的仅是癌易感性，还需要体细胞的多次击中才能产生恶性表型。基因组内存在两类癌相关基因：一类基因直接调控细胞增殖与凋亡、运动与黏着，以及细胞基质的改型等，并参与细胞的信号转导，结果得以维持正常组织细胞的自稳性。当这些基因缺陷造成上述过程失衡，随着细胞各种恶性特征的积累，最终癌症发生。这些基因包括癌基因、肿瘤抑制基因中把关基因（gatekeeper gene）；另一类基因并不直接调控细胞的增殖和凋亡，而是影响第一类癌相关基因的突变速率的管护基因（caretaker gene），这包括各类DNA修复基因，还包括代谢酶多态性在内的一组修饰基因（modifier gene）。 2、癌细胞的恶性生物学特征

分子生物学常用实验指南

生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验（0801班）

2011-2012学年度分子生物学实验指导实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌）五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。

分子生物学实验讲义

医学分子生物学讲义复习重点

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