猪源支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素基因的
Research Paper
研究报告
微生物学报Acta Microbiologica Sinica 48(3): 330~336; 4 March 2008
基金项目: 国家自然科学基金(30471292); 国家“863计划”(2006AA10A206)
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通讯作者。Tel: +86-27-87286974; Fax: +86-27-87281795; E-mail: wub@https://www.wendangku.net/doc/9414785635.html,
作者简介: 赵战勤(1980?), 男, 河南开封人, 博士研究生, 研究方向为细菌分子生物学和基因工程疫苗。E-mail: zhaozhanqin@https://www.wendangku.net/doc/9414785635.html, 收稿日期: 2007-07-06; 修回日期: 2007-12-19
ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q https://www.wendangku.net/doc/9414785635.html,
猪源支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素基因的
原核表达及其抗体检测ELISA 方法
赵战勤, 薛云, 吴斌*, 汤细彪, 陈焕春, 李增强, 胡睿铭, 张建民, 段龙川
(华中农业大学动物医学院, 农业微生物学国家重点实验室, 武汉 430070)
摘要: 【目的】以猪源支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica , Bb )百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的原核表达产物为抗原建立检测PRN 抗体的间接ELISA 方法。【方法和结果】利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统对PRN 基因在大肠杆菌中进行融合表达。SDS-PAGE 和Western blot 检测证实该基因获得高效表达, 产物易于纯化且具有良好的免疫学活性。
通过凝血酶酶切GST-PRN 并回收, 获得不含GST 载体蛋白的PRN 蛋白片段。以PRN 蛋白片段为抗原建立检测天然PRN 抗体的间接ELISA 方法。该方法对猪巴氏杆菌病等7种常见细菌性疾病阳性血清的检测结果均为阴性, 其敏感性比乳胶凝集试验提高4～128倍, 能检测到人工感染14 d 后的仔猪血清抗体IgG, 对临床送检的1,229份猪血清的检测阳性率为32.7%。ELISA 方法对阳性猪场的监测结果预示了保育期仔猪的合群导致猪群大量感染支气管败血波氏杆菌。【结论】该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点, 可用于猪群PRN 抗体水平监测和猪波氏菌病流行病学调查。 关键词: 支气管败血波氏杆菌; 百日咳杆菌黏附素; ELISA
中图分类号: R392 文献标识码: A 文章编号: 0001-6209 (2008) 03-0330-07
支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica , Bb )可引起猪发生肺炎和非进行性萎缩性鼻炎, 也是猪呼吸道疾病综合症的重要致病因子之一[1]。更重要的是, Bb 的先期感染易于导致其它多种细菌性和病毒性病原, 如多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multicida , Pm )、猪链球菌(Streptococcus suis , S. suis )、副猪嗜血杆菌(Haemophilus suis , HPS )、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory Syndrome virus, PRRSV)、猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)等的继发感染, 从而提高猪群呼吸道疾病的发病率和严重程度, 造成较大损失[1-5]。近年来, 人们发现Bb 可经动物传染给人, 并在免疫功能缺陷或低下的人群(如AIDS 患者体内)形成严重感染, 因此引起高度关注[6]。
目前, 针对猪波氏菌病诊断方法的报道很少, 主要是细菌学检查、血清学凝集试验、PCR 检测等方法[1]。细菌学检查是通过从肺冲洗物、尸检肺组织及鼻分泌物中进行病原菌的分离、鉴定, 该方法的缺点是操作技术要求较高、过程繁琐、花费时间长。而血清学凝集试验和PCR 检测方法常出现假阳性结果。这是因为, 血清学凝集试验以灭活Bb 菌体为检测抗原, 该抗原易于和巴氏杆菌、链球菌等的血清抗体发生交叉反应[7, 8]; PCR 方法虽然能够检测到Bb 的存在, 但作为一种呼吸道常在菌, Bb 的存在并不一定代表猪群已经发生感染或者发病。因此, 这些方法在临床诊断中并没有得到广泛使用。目前急需一种特异、敏感的猪波氏菌病诊断方法。
Bb 具有O 、K 和H 抗原, 其毒力因子包括粘附
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素和毒素两大类。粘附素包括丝状血凝素(filamentous hemagglutinin, FHA)、百日咳杆菌粘附素(pertactin, PRN)、菌毛(fimbriae)等; 毒素包括皮肤坏死毒素(dermonecrotic toxin, DNT)、气管细胞毒素(tracheal cytotoxin)、腺苷环化酶溶血素(adenylate cy-clase-hemolisin, AC-Hly)等[9]。这些毒力因子的表达与病原所处的环境具有紧密的相关性, 均由BvgA/S双因子调节系统调节表达。PRN是由prn基因编码的一种具有保护性的外膜蛋白成分, 是Bb感染的重要黏附因子[9, 10]。在猪的感染试验中, 发现不产生PRN的Bb菌株不能导致猪发生波氏菌病[11, 12], 且猪群的保护率与PRN抗体水平呈线性关系[10, 11, 13], 这就预示着可以通过检测动物体内特异的PRN抗体来诊断猪波氏杆菌病。本研究利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST) 表达系统对prn基因进行了原核表达, 并以表达产物为抗原初步建立了PRN抗体的间接ELISA检测方法。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株、质粒、血清和试验动物: 猪源Bb HH0809和ZK1217株(FHA+, PRN+, DNT+)由本实验室分离鉴定和保存; 受体菌株大肠杆菌DH5α、表达菌株大肠杆菌BL21为本实验室保存。表达载体pGEX-KG、Bb HH0809株猪阳性血清、阴性血清和其它血清由本实验室提供。20日龄断奶仔猪购自湖北天种畜牧股份有限公司。
1.1.2主要试剂: DNA Marker、Pyrobest DNA Po-lymerase、T4 DNA Ligase和限制性内切酶购自大连TaKaRa公司; 基因组提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自上海Sangon公司; 二甲基亚枫(DMSO)购自国药集团公司; GST融合蛋白纯化试剂Glutathione Sepharose TM 4B购自Amersham Biosciences公司; 凝血酶Thrombin、弗氏佐剂购自Sigma公司; IPTG购自Promega公司; 蛋白质Marker购自NEB公司; HRP 标记的羊抗猪IgG抗体、底物DAB购自SouthernBiotech公司。
1.2 prn基因的克隆、序列分析及表达载体的构建
利用D A S软件[14]和H M M T O P软件[15] (https://www.wendangku.net/doc/9414785635.html,/tools/)对GenBank上公布的prn基因(AJ245927)编码的氨基酸序列进行跨膜性预测, 为prn的引物设计和高效表达提供理论依据。参考GenBank 公布的prn基因序列AJ245927设计1 对引物(由上海S a n g o n公司合成),P1:5′-T T T T GGATCCGACTGGAACAACCAGTCCAT-3′和P2: 5′- TTTTGAATCCCCGCCGCCGTCGCCGGTAAA-3′(上下游引物分别引入Bam HⅠ和Eco RⅠ限制性酶切位点)。引物扩增区域为除去N 端信号肽的2040 bp成熟蛋白基因编码区。按试剂盒说明书提取Bb HH0809株基因组为模板。PCR反应采用25 μL体系, 反应条件为: 95℃ 5min; 94℃ 1 min, 59℃ 1 min, 72℃ 2.5 min, 30个循环; 72℃ 10 min。PCR产物用UNIT-10柱式DNA胶回收试剂盒回收。用Bam HⅠ与Eco RⅠ分别对PCR 产物和pGEX-KG 载体质粒进行酶切、回收、连接构建重组质粒, 命名为pGEX-prn。将连接产物转化DH5α, 筛选阳性克隆, 提取质粒, 进行酶切鉴定和序列测定(由大连TaKaRa公司完成)。分别利用生物学网络软件BLAST (http://www. ncbi.nlm. https://www.wendangku.net/doc/9414785635.html,/BLAST/)和ProtParam (https://www.wendangku.net/doc/9414785635.html,.expasy. org/tools/ProtParam)[16]进行核苷酸和氨基酸序列分析。
1.3 prn基因的表达和Western blot分析
将重组质粒pGEX-prn转化BL21, 挑取单菌落于含有氨苄青霉素(终浓度为100 μg/mL)的LB培养基中, 37℃、225 r/min摇床培养至对数生长期时(OD600=0.6~1.0), 加入IPTG诱导表达4 h。通过12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[17]分析蛋白的表达特性。按文献[17]所述方法提取包涵体并进行复性。根据产品说明书, 用GST融合蛋白纯化试剂Glutathione Sepharose TM 4B对表达产物(命名为GST-PRN)进行纯化。根据产品说明书, 进一步用凝血酶Thrombin对部分纯化的GST-PRN进行酶切, 回收表达产物的PRN片段。蛋白浓度通过分光光度计进行测定, 纯度经SDS-PAGE电泳和GelExpert 软件(NucleoTech公司NucleoVision凝胶成像系统自带软件)进行分析。按文献[18]所述方法对表达产物GST-PRN进行Western blot 分析, GST 蛋白为对照。一抗为Bb HH0809株感染猪阳性血清。二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG。
1.4间接ELISA检测方法的初步建立
1.4.1间接ELISA 最佳反应条件的选择: 采用去除GST载体蛋白的纯化PRN蛋白作为ELISA方法包被抗原。通过方阵滴定试验确定确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度。抗原从1:10、1:20稀释到1:1,280,
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分别加到酶标板的1～8行。血清从1:10、1:20稀释到1:320。阳性血清按其稀释度加到第1～6列, 阴性血清按其稀释度加到第7～12列。按间接ELISA方法进行操作, 分光光度计测定OD630值。以阳性OD630值比阴性OD630值(P/N值) 最大的孔所对应的抗原包被浓度和血清稀释度为最佳抗原包被浓度和血清稀释度。
1.4.2确定结果判定标准:将临床送检的经乳胶凝集试验[19]检测为波氏菌病阴性的16份猪血清, 进行ELISA 检测均为阴性, 计算该16份血清的平均值X、标准差SD, 阴阳界限计算公式X + 3SD。
1.4.3分析特异性试验: 分别检测猪巴氏杆菌病(T+Pm, D型)、猪大肠杆菌病(E. coli, O139, F18+, SLT-Ⅱe+)、仔猪副伤寒(猪霍乱沙门氏菌C78-1, 血清型6,7:C:1,5)、猪传染性胸膜肺炎(胸膜肺炎放线杆菌, 1型)、副猪嗜血杆菌病(HPS)、猪链球菌病(S. suis, SC-1, 2型, MRP+, EF+, SLY+)、猪波氏菌病(Bb HH0809株, Bb ZK1217株)阳性血清, 猪波氏菌病阴性血清、接种了猪波氏菌病灭活菌苗(Bb HH0809)的猪血清。猪大肠杆菌病、巴氏杆菌病、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪波氏菌病、猪气喘病阳性血清为病原菌感染猪所制。仔猪副伤寒、猪传染性胸膜肺炎阳性血清为病原菌经灭活免疫猪所制。猪波氏菌病阴性血清为乳胶凝集试验[19]检测阴性血清。
1.4.4敏感性试验: 用该ELISA方法和乳胶凝集试验[19]分别检测2份人工感染猪波氏菌病(Bb HH0809株, Bb ZK1217株)血清和9份临床诊断猪波氏菌病阳性血清, 按各自的阳性判断标准判定两种方法所能检测到的阳性血清的最大稀释度, 对比两种方法的敏感性。另外, 用Bb HH0809株2×1010 CFU通过气管注射感染仔猪, 分别在感染前和感染后5、8、14、21、30、60天从耳缘静脉采血, 通过ELISA方法和乳胶凝集试验[19]分别检测感染后仔猪血清转为阳性的最早时间。
1.4.5重复性试验和方法比较试验: 用相同批次和不同批次的酶标板对不同抗体水平的血清样品(其中4份阳性血清,4份阴性血清)进行批内和批间重复性测定, 计算批内和批间的吸收变异系数。选择乳胶凝集试验[19]与本研究建立的ELISA方法分别检测121份血清, 比较两者的符合率。
1.4.6 ELISA诊断方法的临床应用: 对湖北省某2个阳性猪场进行了疾病监测。分别选取断奶前仔猪、保育期仔猪、生长前期猪和育肥猪各年龄段的血清进行检测, 分析其血清流行病学规律。另外, 用建立的ELISA 方法对2005～2007年间的来自湖北、河南、湖南、安徽、广东、福建、江西、上海等省市送检的1,229份血清进行检测, 统计血清阳性率。
2结果
2.1 PRN蛋白的序列分析
GenBank上公布的prn基因(AJ245927)编码区成熟PRN蛋白全长2,136bp, 编码712个氨基酸, 利用DAS软件[14]和HMMTOP软件[15]对PRN氨基酸序列进行跨膜区预测分析, 结果表明, PRN的氨基酸序列存在1个跨膜区, 位于约第19～28 (DAS)或17～34 (HMMTOP)氨基酸之间, 对应于Charles等[20]已经报道的PRN的信号肽序列位置。引物的设计避开了N 端信号肽序列(前34个氨基酸)。用DAS和HMMTOP 软件对PCR扩增片段编码的PRN氨基酸序列的分析结果与AJ245927中对应PRN氨基酸序列结构一致。利用ProtParam软件[16]对PRN基因编码蛋白的理化性质进行分析, 结果显示其分子结构式为C3016H4828N920O941S6, 理论pI值为9.02, 分子量为69,225.4道尔顿, 脂肪系数为81.83, 不稳定系数为38.33, 属于稳定型蛋白质。
2.2 prn基因的克隆和表达载体的构建
将PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, 可见扩增出2,040 bp左右大小的清晰条带, 与预期的DNA片段大小相符。将重组质粒pGEX-prn分别由Bam HⅠ、Eco RⅠ及Bam HⅠ、SalⅠ酶切鉴定。Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切后, 得到两条带, 大小为5,000bp和2,040 bp左右。Bam HⅠ和SalⅠ双酶切后, 得到3条带, 大小为5,000 bp、1,176 bp和864 bp左右, 均与预期DNA片段相符。序列测定的结果进一步表明prn基因片段在pGEX-KG表达载体中得到正确连接。
2.3 prn基因的表达和Western blot分析
SDS-PAGE结果表明(图1-A), 含pGEX-prn重组质粒的E.coli BL21在约95 kDa处有明显的表达带, 是PRN与GST表达的融合蛋白。空载体对照在约27 kDa有明显的表达带, 相当于GST蛋白的分子量。Western blot分析表明(图1-B), 重组PRN蛋白GST-PRN能够与Bb HH0809株的感染猪血清发生特异性的免疫反应, GST蛋白则不能。这证实克隆基因
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片段获得正确表达, 并具有很好的免疫学反应活性。提取的包涵体经过复性, 并使用GST融合蛋白纯化试剂Glutathione SepharoseTM 4B纯化后, 得到浓度为207.3 μg/mL、纯度为90.1%的融合蛋白GST-PRN, 通过凝血酶Thrombin对纯化GST-PRN进行酶切并回收PRN蛋白片段得到约大小约68 kDa、浓度为140.5 μg/mL、纯度为93.1%的PRN表达蛋白片段。
图1表达产物的SDS-PAGE(A)和Western blot(B)分析Fig.1 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysis of the expressed protein. A: 1 and 2. SDS-PAGE of GST-PRN (ar-row) and PRN proteins after purification (arrow); B: 1 and 2. Western-blotting analysis of GST-PRN (arrow) and GST in BL21 cell lysates; M. protein marker.
2.5 ELISA检测方法的初步建立
2.5.1 ELISA最适条件及阴阳界限的确定: 方阵滴定结果显示, 血清最佳稀释度为1:40, PRN抗原最佳稀释度为1:320(439 ng/孔)。对16份猪波氏菌病阴性血清进行检测, 求得其平均值X =0.114, 标准偏差SD =0.057, 确定阴阳性临界点为X+3SD =0.285。结果判定:以空白孔调零,在酶标仪上测各孔OD630值,OD630≥0.285判为阳性, 诊断为猪波氏菌感染; OD630 <0.285判为阴性。
2.5.2重复性试验: 取相同批次的 5 块包被抗原的酶标板(批内)和不同批次的5块包被抗原的酶标板(批间)检测8份抗体水平不同的血清样品(4份阳性血清和4份阴性血清), 结果显示批内重复的吸收变异系数在563%～735%之间。批间重复的吸收变异系数在436%～824%之间, 说明该诊断方法具有良好的重复性。
2.5.3分析特异性试验: 用ELISA方法检测猪巴氏杆菌病、猪大肠杆菌病、仔猪副伤寒、猪传染性胸膜肺炎、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪气喘病阳性血清和5份猪波氏菌病阴性血清都呈阴性, 其OD630值分别为0.083、0.139、0.252、0.097、0.058、0.099和0.154。ELISA方法对2份接种了猪波氏菌病灭活菌苗(Bb HH0809, ZK1217株)的猪血清和2份Bb (HH0809, ZK1217)感染猪血清的检测结果均为阳性, 其OD630值分别为0.538、0.644、1.264、和0.956。这些试验结果表明该方法的分析特异性良好。
2.5.4敏感性试验: 选择用国内常用的检测方法乳胶凝集试验与本研究建立的ELISA诊断方法同步检测临床送检121份仔猪血清, 二者相比较来确定该ELISA诊断方法的诊断敏感性与符合率。该ELISA 方法和乳胶凝集试验[19]对2份人工感染猪波氏菌病(Bb HH0809株, Bb ZK1217株)血清和9份临床诊断猪波氏菌病阳性血清的检测结果见表2, 该ELISA方法的敏感性比乳胶凝集方法[19]高4～128倍。另外, 乳胶凝集试验[19]和ELISA方法检测感染后仔猪血清转阳的最早时间均为14 d, 检测效价分别为1和8。
表1 ELISA方法和LAT试验诊断敏感性试验比较
Table 1 Diagnosis sensitivity of ELISA method compared to LAT test
Serum
samples 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 LAT 32 8 8 64 2 16 128 32 16 2 16 ELISA 512 64 32 1,024 16 1,024 512 1,024 256 256 128 Note: 1 and 2, serum samples from pigs inocubated with Bb HH0809 or ZK1217 strains, respectively; 3-11, positive serum samples from
Bb-infected pigs identified by clinical diagnosis.
2.5.5符合率试验: 在对比试验中, 送检的121份猪血清经乳胶凝集试验检测阳性和阴性样品分别为80和41份; 间接ELISA检测阳性和阴性样品分别为37和84; 两种方法检测均为阳性或阴性的样品分别为37和41份; 乳胶凝集试验检和间接ELISA检测的总阳性率分别为66.1% (80/121) 和30.6% (37/121); 间接ELISA检测结果阳性的样本, 用乳胶凝集试验检测结果也均为阳性, 符合率为100% (37/37)。
2.5.6 ELISA方法的临床初步应用: 用该ELISA方法检测2005～2007年间来自全国各地的1,229份猪血清样本, 共检测出阳性血清402份, 阳性率为32.7%。在不同的猪场其阳性率差别较大, 有的猪场
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阳性率为0, 有的阳性率达80%。用该方法对湖北2
个阳性猪场各年龄段猪群的进行血清流行病学监测,
发现2个猪场中阳性猪群的分布具有相似性(表2)。
断奶前仔猪和保孕期猪群的阳性率较低(均低于20%),
生长前期猪群的血清阳性率明显升高, 分别提高了3
倍多, 而育肥期的猪群基本维持了同样的血清阳性
率。这预示着保育期仔猪的合群导致猪群发生了大量
感染。
表2间接ELISA方法对湖北某2个猪场血清样品的临
床监测结果
Table 2 The detection results of clinical sera by indirect ELISA
in two pig fields
Sources of serum Days of
pigs’ age
NO. of
samples
NO. of
positive
Positive
rate/%
15～21 145 13 9.0 22～35 147 19 12.9 36～55 163 70 42.9
Ⅰ
56～90 166 77 46.3
15～21 163 21 12.9
22～35 143 27 18.9
36～55 148 93 62.8 Ⅱ
56～90 149 97 65.1 3讨论
PRN是由Bb prn基因编码的一种具有保护性的
外膜蛋白成分, 是Bb感染的重要的黏附因子[9, 10]。在
猪的感染试验中, 发现不产生PRN的Bb菌株不能导
致猪发生波氏菌病, 且猪群的保护率与PRN抗体水
平呈线性关系, PRN被认为是Bb最主要的保护性抗
原[10, 11, 13]。因此, 以PRN蛋白作为ELISA包被抗原
检测动物体内特异的PRN抗体, 可以用来诊断猪群
是否发生了波氏菌病, 该方法也可以用来对猪波氏
菌病疫苗抗体的保护力进行评价。
本研究通过核苷酸和氨基酸序列比对, 发现GenBank上已提交的猪源Bb prn基因序列和氨基酸
序列, 均有98%以上的同源性。这表明该基因可能高
度保守, 可考虑作为猪波氏菌病的检测抗原和亚单
位疫苗研究的候选基因。从融合蛋白的理化特性看,
该蛋白质属于稳定蛋白质[16], 具备了作为基因工程
抗原的理化条件。以本实验室分离的猪源Bb强毒菌
株HH0809的基因组为模板克隆prn基因, 发现其核
苷酸和氨基酸序列与GenBank已经提交的序列也具
有98%以上的同源性。更重要的是, 表达产物GST-PRN经SDS-PAGE后转膜进行Western blot分析, 目的带处呈现明显的条带而未见非特异性条带, 表明表达产物的特异性较好, 这是成功建立本方法的关键。另外, 该基因在大肠杆菌中表达量高。通过GST融合蛋白纯化试剂Glutathione Sepharose TM 4B 进行纯化, 方法简单、快速、纯度高。这就为进一步开发为诊断试剂抗原奠定基础。
在获得纯化GST-PRN的基础上, 进一步使用凝血酶Thrombin将酶切纯化的GST-PRN并回收PRN 蛋白, 以该回收PRN蛋白为包被抗原建立的检测PRN抗体的间接ELISA方法具有较好的重复性、特异性和敏感性。分析其原因可能包括: (1)表达产物纯度高, 且消除了GST载体蛋白, 使ELISA的非特异性反应降到最低水平; (2)表达产物为稳定性蛋白, 受环境的影响较小, 易于保持抗原活性。本研究建立的ELISA与乳胶凝集试验相比较, 其敏感性较之高4～128倍, 有100%的符合率。虽然乳胶凝集试验检测的主要对象是感染早期出现的IgM类抗体, 而该ELISA 方法只针对血清中的IgG, 但在检测人工感染猪血清转阳时间的试验中, ELISA方法仍然比乳胶凝集试验敏感性高8倍。而当检测其它阳性样品时, ELISA的敏感性均远远高于乳胶凝集试验方法。
本研究建立的以亚单位表达蛋白PRN为检测抗原的ELISA方法与以灭活Bb菌体为检测抗原的乳胶凝集试验方法有100%的符合率, 但乳胶凝集方法检出率高达66.1%, 而ELISA方法是30.6%。分析其原因, 主要有三点: (1)某些Bb弱毒菌株不表达或只表达极少量PRN抗原, 感染机体后不能刺激产生可检测水平的相应抗体。这类菌株虽然能够造成猪群在一定程度上的感染, 但不能使猪发病而产生典型的临床症状[11, 12]。(2)乳胶凝集试验的特异性可能较低, 其检出率偏高。以波氏杆菌灭活菌体为抗原建立的乳胶凝集试验与巴氏杆菌抗体等可能存在交叉反应[7, 8]。在研究中我们也发现, 乳胶凝集试验和猪霍乱沙门氏菌抗体有较强的交叉反应, 该方法还有待进一步改进。(3)ELISA阴阳性界限偏高。在设定判定标准时, 不同的报道采用的计算公式不同, 本试验采用均值加3个标准差的计算方法使阴阳性界限偏高。其结果是增加了ELISA方法的特异性, 但是却相应的降低了其敏感性, 特别是对于抗体水平较低的样品增加了假阴性结果。如果使用均值加2个标准差的计算方法, 其阴阳性界限为OD630≥0.228, 其阳性率也随
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之升高到40.5%。但是两者符合率降为91.8%。ELISA 方法阴阳性界限的确定还有待进一步分析和研究。
在临床应用中, ELISA方法检测1,229份血清样品的总阳性率为32.7%, 这说明国内波氏菌的感染率很高。对2个阳性猪场的监测发现, 猪群的血清阳性率随生长年龄的增长而增加, 但是生长期和育肥猪的阳性率远高于断奶前乳猪和保育期仔猪。由于大龄动物对Bb并不易感, 且保育期之前猪群相互接触的机会较少, 因此推测是仔猪在保育期大量合群时发生相互感染, Bb菌潜伏至生长期时, 抗体才升高到可以被检测出来的水平。
本方法的建立, 克服了细菌分离鉴定较为繁琐费时和PCR检测易于出现假阳性的缺点; 此外包被抗原易于纯化, ELISA操作方法简单。更有意义的是, 该ELISA方法直接检测抗PRN的抗体, 阳性结果说明猪群已发生感染, 阳性率高低能反应猪群的实际感染情况。因此, 本研究建立的新方法, 有望成为一种准确、快速和实用的猪波氏菌病血清学诊断方法。
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combinant protein-based indirect ELISA for antibodies detection Zhanqin Zhao, Yun Xue, Bin Wu*, Xibiao Tang, Huanchun Chen, Zengqiang Li, Ruiming Hu,
Jianmin Zhang, Longchuan Duan
(State Key Laboratory of Agriculture Microbiology, College of Veterinary Medicine, Huazhong Agriculture University, Wuhan 430070, China)
Abstract:[Objective] We developed an indirect ELISA method for detecting Bordetella bronchiseptica(Bb) pertactin antibodies based on the recombinant pertactin protein expressed in Escherichia coli (DE3) strain. [Methods and results] The prn gene encoding Bb pertactin was fused to the downstream of glutathione S-transferase (GST) of pGEX-KG ex-pression vector, resulting in the fusion expression plasmid pGEX-prn. SDS-PAGE showed that the GST-PRN fusion pro-tein was expressed in high level in BL21 carrying pGEX-prn. The strong reactivity of the GST-PRN fusion protein, spe-cifically with antiserum against porcine Bordetellosis caused by Bb HH0809, was identified by Western blot. The recom-binant protein fragment of rPRN was purified from the GST-PRN fusion protein digested by protease thrombin with the purity of 93.1℅. The rPRN-based indirect ELISA was developed for detecting antibodies against PRN. The ELISA could detect positive samples in experimentally infected pigs fourteen days post inoculation and the degree of sensitivity was over 4 times higher than the latex agglutination test with the coating antigen of killed Bb. Thirty-two point seven percent of positive samples were detected in 1,229 clinical samples while no false positive results were found in detecting 7 an-tisera against porcine bacterial diseases. Sera samples from two bordetellosis-positive pig fields were tested by the indi-rect ELISA method and the results indicated that pigs were infected by Bb during the nursery periods. [Conclusion] The assay showed excellent specificity, sensitivity and reduplication, and can be useful for epidemiological survey and clinical diagnosis of swine bordetellosis.
Keywords: Bordetella bronchiseptica; pertactin; ELISA
Supported by the National Natural Science Foundation of China (30471292) and the National Programs for High Technology Research and Development of China (2006AA10A206)
*Corresponding author. Tel : +86-27-87286974; Fax : +86-27-87281795; E-mail: wub@https://www.wendangku.net/doc/9414785635.html,
Received: 6 July 2007/ Revised: 19 December 2007
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