基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用
Aug .2007?10 ?
生物加工过程
Chinese Journal of B i op r ocess Engineering
第5卷第3期
2007年8月
基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用
谢承佳,何冰芳,李 霜
3
(南京工业大学 制药与生命科学学院,南京210009)
摘 要:应用基因工程技术对微生物细胞内的代谢通量进行重新设计,是获得高产高效的工业菌株的重要手段之一。基因敲除是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术,利用基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁路,或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量而达到调节代谢流,优化代谢途径的目的。简单介绍了基因敲除技术的操作过程,重点讨论基因敲除技术的敲除策略及在微生物代谢工程方面的应用,并展望了相关技术在诸多领域的发展趋势。
关键词:基因敲除;代谢工程;同源重组
中图分类号:Q784 文献标识码:A 文章编号:1672-3678(2007)03-0010-05
Gene knockout and its appli ca ti on s i n m i crobe m et aboli c eng i n eer i n g
X I E Cheng 2jia,HE B ing 2fang,L I Shuang
(College of L ife Science and Phar maceutical Engineering,Nanjing University of Technol ogy,Nanjing 210009,China )
Abstract:App licati on of genetic engineering technol ogy in the redesigning of the metabolic flux is one of the most i m portant p latf or m technol ogy f or strain i m p r ove ment .A homol ogous recombinati on based,high 2ly efficient molecular bi ol ogy technol ogy ter med ‘gene knockout ’has been devel oped since 1980s .The technol ogy can regulate metabolic flux by inserting,deleting,cl oning or substituting genom ic DNA se 2quences at any desired positi on .The p rinci p les and operati on p r oeedure of gene knockout were briefly in 2tr oduced,and its app licati ons in metabolic engineering were discussed .Key words:gene knockout;metabolic engineering;homol ogous recombinati on
微生物种类繁多,数量庞大,是大自然提供的
天然宝藏。随着科技的发展,发酵工业与生物催化向人们提出了更高的要求,进一步提高目的产物的产量、纯度及开发有价值新化合物等都是有待解决的问题,因此微生物应用的难题集中到如何对菌种进行改造,以获得高产高效的工业菌株。传统的育种手段存在工作量大,效率低,遗传稳定性差等缺点。随着对微生物代谢机理认识的不断加深,随着生物化学、细胞生物学、应用分子生物学、遗传工程
的发展,定向操纵遗传变化成为可能,代谢工程应
运而生。
代谢工程的概念诞生于1991年[1]
,具体而言,代谢工程就是利用重组DNA 及其他技术,有目的地改变生物中已有的代谢和表达调控网络,以更好地理解细胞的代谢途径,并用于化学转化、能量转移
及大分子装配过程[2]
。对于工业微生物育种来说,从野生出发菌株到高效生产菌株,需要经过代谢分析—设计策略—遗传修饰—代谢分析这一流程,不
3收稿日期:2006211228
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20336010)
作者简介:谢承佳(1982-),女,江苏南京人,硕士研究生,研究方向:生物化工。联系人:何冰芳,教授,博士生导师,E 2mail:bingfanghe@njut .edu .cn
2007年8月谢承佳等:基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用?11
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断的循环调整,对宿主进行遗传修饰为其中的重要一环,包括DNA shuffling,genome shuffling及基因敲除技术,这些DNA重组手段可以快速改变分散在基因组不同位置上的一个或数个基因,从而改变相应的细胞表型,快速优化代谢途径,极大地促进代谢工程的进一步发展和应用1
基因敲除是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术,利用微生物体内的同源重组系统,在一定选择压力下使体外改造的某功能基因与受体细胞染色体上的功能基因之间发生同源重组,从而改变细胞的遗传特性。利用基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁路,或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量,从而达到微生物育种的目的。
1 基因敲除的操作步骤
基因敲除的一般流程见图1,基本程序是:用PCR技术扩增目的基因序列,在体外插入卡拉霉素、四环素等受体菌原先不具有的抗性标记,使目的基因失活,再将失活的目的基因构建至一环状载体上,用电转化、显微注射等方法将构建好的载体转化入受体细胞内,以抗性标记初步筛选阳性菌或进行目的基因功能的失活检测,再以PCR,s outhern 杂交等做进一步验证。现在,为了更好地区别单交换与双交换造成的重组,通常使用两个抗性标记,在发生单交换时,阴性和阳性抗性标记都会整合至基因组,而发生双交换时,第二次同源重组会导致基因回复至野生型或敲除目的基因,在前一种情况下,两种标记都不存在;在后一种情况下,基因组上只有阳性标记,因此这样的敲除子可以通过正负筛选鉴别出。但如果载体构建时在同源序列内部引入一些突变,就不会回复至野生型,这样,既能实现基因的失活,基因组上又不会带有抗性标记,这对构建“食品级”的安全菌株是有益的。
在了解微生物代谢途径相关基因的基础上,通过构建合适的敲除载体,利用微生物原有原因与构建的同源重组系统发生交换,进行代谢旁路的阻断,防止副产物或有毒产物的形成,促进目的产物积累,从而达到调节代谢流,优化代谢途径的目的。基因敲除技术既对敲除载体的要求不高可用于原核细胞,也可用于真核细胞,用途广泛
。
图1 基因敲除流程
Fig.1 Fl ow chart of gene knockout
2 敲除策略的选择
基因敲除过程中,敲除载体的设计及构建是非常重要的。同时,在载体构建的过程中要考虑建立合理、可靠的筛选方法。同源重组的效率较低,故对重组子的筛选和检测是基因敲除的关键步骤。目前根据不同的目的和要求,基因敲除的策略主要有以下几种。
211 非复制型质粒载体敲除法
对野生菌做基因敲除,可以先考虑用非复制型载体。由于构建好的敲除载体在受体菌中是不复制的,因此转化之后,在选择压力下,未发生重组的转化子由于敲除载体不能复制随着菌体生长而被稀释。丁晓明等[3]利用在地中海拟无枝菌酸菌中不复制的敲除质粒P DK110,成功地用α2淀粉酶基因取代了地中海拟无枝菌酸菌U32染色体上的32氨基252羟基苯甲酸合成酶基因。此法的主要缺点是整合几率低,需要数千碱基的同源序列,且对受体菌的感受态效率要求较高。
212 不稳定型质粒载体敲除法
若受体菌感受态较难制备,可考虑采用不稳定型敲除载体。例如:22酮基2L2古龙酸(22K LG)是维生素C合成的重要前体,但发现存在高水平的22酮
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基醛糖还原酶(22KR)活力。由于22KR能够利用NADPH或NADH辅酶将V c生产菌代谢中重要的中间产物2,52二酮基2D2葡萄糖酸(2,52DKG)及22 K LG转化为其他副产物,陈芳等[4]将失活的22KR 基因构建到pBR322衍生质粒上,这种质粒在受体菌中分配不稳定,在无压力选择或低磷条件下培养5～10代会出现很多质粒丢失的细胞。因此转化后可先控制培养条件使敲除载体随细胞复制以增加转化子的数目,然后再在无压力选择或低磷条件下让质粒丢失,最后在选择压力下筛选敲除子。目前已成功敲除22KR基因。
213 温度敏感型(Ts型)质粒载体敲除法
1993年,B is was等[5]利用Ts型质粒建立了革兰氏阳性菌高效的基因敲除系统。B is was所用质粒pG+host5在37℃时不复制,而28℃时以滚环模式进行复制。因此转化后在选择压力下37℃培养会导致第一次同源重组sco(single2cr oss over),之后将温度降至28℃,会促使质粒发生滚环复制,这种复制机制会导致发生第二次重组dco(double2cr oss2 over)。重组后,目的基因或是被敲除,或是回复成野生型。由于使用了Ts型质粒,因此转化后可先在复制温度下培养促进转化子的生长及繁殖。即使外界无抗性选择压力重组机率也会增加。该技术可避免使用抗生素抗性标记,可用于构建“食品安全级”的菌株。由于质粒是以滚环机制复制,重组效率高。B is was的研究表明在有抗性选择压力时, 50%以上的菌发生了替换重组;无抗性选择压力时,替换重组的效率为1%～40%。此外,Ts型质粒宿主谱广,可在很多革兰氏阳性菌中使用。
214 线形转化敲除法
1998年,Mur phy等[6]报道了利用λ噬菌体的线性Red同源重组系统获得高重组率。Red系统主要包含3种蛋白质分子,分别称为Exo、Beta和Ga m。Exo蛋白具有DNA外切核酸酶活性,从双链DNA末端按5’→3’的方向消化单链DNA。Beta蛋白可结合在由Ex o消化产生的3’单链DNA末端,促进该单链DNA末端与互补链退火和体内重组。Ga m抑制宿主菌的重组蛋白Rec BCD的线性双链DNA外切酶活性,协助Exo和Beta完成同源重组。Red系统相对于宿主菌来说是一个外来的功能单位,因此必须对其表达进行调控。Yu等[7]将部分λ噬菌体的基因整合至E1coli染色体上,exo,beta和gam3个基因受C2857阻遏蛋白的调控表达;Dat2
senko等[8]将Red系统构建在一个以arac2ParaB为启动子的Ts型质粒上,在阿拉伯糖的诱导下可进行有效表达,而在温度控制下可快速去除此质粒。王恒 等[9]利用此类质粒快速敲除了痢疾杆菌中的asd基因,之后又利用编码F LP重组酶的Ts型辅助质粒去除了抗性基因,为Red系统在E1coli以外的微生物中的应用进行了尝试。
利用λ噬菌体的Red同源重组在大肠杆菌中做基因敲除的优点在于其所需的同源序列只需30～50bp,如此短的核酸序列完全可以人工合成,从而避免了繁琐的酶切及连接过程。通过PCR产生的两端带有同源臂的DNA片段即可在Red系统指导下快速实现基因敲除。
在链霉菌中,廖军等[10]利用含缺口的变性双链DNA敲除了葡萄糖异构酶的基因,推测可能是单链DNA的构型有利于其与链霉菌染色体序列的同源重组,而碱变性后的双链DNA中的部分氢键的断裂,造成部分单链区域成为同源重组的较佳底物。
在酿酒酵母中,由于双链DNA缺口修复途径十分有效,也可直接用由PCR产生的两端带同源序列的线形DNA转化,Baudin等[11]通过同源重组用酵母筛选标记基因(如H I S3)替换酵母中的目的基因,可快速产生大量的基因缺失突变体。
采用线形基因不需采用特定的载体,这使构建过程得以简化,并且可以避免采用环形载体时非同源片段的干扰。
215 结合转化敲除法
芮贤良等[12-13]利用宿主2载体平衡致死系统筛选致贺氏3价疫苗候选株。首先使目的基因体外失活,将其克隆到“自杀转移载体”pXL275上获得质粒pXL312,转化大肠杆菌受体菌S M10λp ir。以S M10λp ir为供体菌,与受体菌T32进行固相滤膜交配,由于重组质粒pXL312含有RK2的mob位点和特殊的R6K复制子,不仅可被供体菌内的RP4系统诱导转移至受体菌T32,而且在T32菌内不能复制,是一自杀型质粒。因此,当用载体的抗生素抗性进行选择时,可筛选到转移质粒和染色体发生同源重组形成的共整合结合子。因此,如果要进行基因敲除的目标菌不易制备感受态或感受态效率很低,则可以通过寻找“中介菌”来完成基因转移的过程。
3 基因敲除在代谢工程中的应用
代谢工程的难题就是如何使微生物的代谢主
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流流经理想载流途径。在发酵生产中,为了达到这一目的,从营养物质进入细胞到产物产生通常需要从三个方面加以控制[14],即:使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物;阻塞或去除与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流,使碳架物质相对集中地流向目的产物;消除或削弱目的产物进一步代谢的途径。在上述各过程中,起关键作用的无疑是酶,而基因敲除技术的出现使快速失活成为现实,从而达到调节代谢流,优化代谢途径的目的。以下例子论述基因敲除技术在代谢工程方面的应用。
311 降低能耗
长链二元酸是合成工程塑料、香料、液晶等物质的一种重要的化工原料,目前主要利用热带假丝酵母转化烷烃进行生产。在热带假丝酵母代谢烷烃的过程中,烷烃的β2氧化过程,既是细胞生命活动所必需,但也存在原料的无益消耗。高弘等[15]将在脂肪酸向β2氧化转运过程中起到关键作用的肉毒碱乙酰基转移酶(CAT)单拷贝敲除,减少β2氧化过程中脂肪酸的无谓消耗,经过初步检测,重组菌的CAT酶活降低了43%,十三碳二元酸的产量与摩尔转化率分别提高了1310%和1118%。
312 阻断或降低副产物的合成
乙酸是大肠杆菌代谢的末端产物,乙酸累积抑制菌体生长和外源蛋白的表达,目前一般采用改变发酵温度和限制补料速率等方法控制发酵液中乙酸的浓度,近年来用代谢工程方法降低乙酸的累积获得成功。主要思路包括:阻断乙酸产生的主要途径,限制糖酵解途径中的碳代谢流,转换过量的丙酮酸为其他低毒性的副产物以及分流碳代谢流等几个方面[16]。在大肠杆菌磷酸转移酶系统中,葡萄糖主要由pts G基因编码的酶转运入细胞。降低葡萄糖的摄取速率,减少了乙酸累积,有利于菌体生长。韩聪等[17]利用基因敲除技术构建pts G基因缺陷株,净化葡萄糖的摄取速率,减少了乙酸累积,有利于菌体生长。在含有葡萄糖的LB培养基中, pts G基因缺陷株最高菌密度分别是原始菌的3147倍和4125倍,在大肠杆菌高密度发酵研究方面具有良好的应用前景。
313 去除重组菌的抗性
碱性蛋白酶(A lkaline p r otease)是指在pH碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,广泛应用于各种洗涤剂。唐雪明等[18]构建了带卡那霉素和碱性蛋白酶基因的质粒,通过逐步提高培养液中卡拉霉素的水平,促进载体不断整合至染色体上,从而实现碱性蛋白酶基因在宿主染色体的扩增。但是,带多拷贝卡拉霉素基因的构建菌可能会给环境造成转基因污染,故又构建载体敲除了卡拉霉素基因[19],筛选得到了11株不含抗性基因的整合型碱性蛋白酶工程菌,并使产酶水平保持稳定。
314 提高产物纯度
乳酸在食品、医药、化工、环保等领域有广泛的用途。乳酸菌L actobacillus helveticus CNRZ32既有Kyla2D2乳酸脱氢酶基因(ldh L),又含L2乳酸脱氢酶基因(ldh D)等[20]。用基因替代的方式构建了2株菌GRL86和RL89,其中GRL86菌株缺失了ldh D 的启动子区域;GRL89菌株中用另一个ldh L基因替代了ldh D基因,新增加的ldh L在原来ldh D启动子的调控下表达1敲除后,两株菌都只生产L2乳酸,且L2LDH的最高活性分别比原始菌株高出53%和93%。
315 降低或阻断骨骼代谢
奎尼酸是一种具有光学活性的环状多羟基化合物,可广泛用于合成抗肿瘤制剂、免疫抑制剂,助溶剂及光学材料等。在大肠杆菌中,奎尼酸的前体化合物是莽草酸途径的中间代谢产物,是由糖酵解和磷酸戊糖途径分别产生的磷酸烯醇式丙酮酸和赤鲜糖242磷酸缩合而来,这是决定芳香化合物合成速率及产量的关键。Berry等[21]将糖酵解途径中的限速酶———丙酮酸激酶的2个同工酶基因都敲除后,DAHP的产量增加了3倍。后来又采取扩增DAHP合成酶基因ro G和编码转酮酶A的tkt A基因,同时失活两个丙酮酸激酶同工酶,DAHP产量明显提高[22]。
在微生物芳香族氨基酸的生物合成中,至少有17种酶参与,且具有复杂的调控机制。在大肠杆菌中,发现了苯丙氨酸合成的中心代谢途径及其他生理特性的调控因子———贮碳因子(Carbon St orage Regu2 lat or A,Csr A),敲除Csr A可增强糖质新生,降低糖酵解,因此提高了芳香族氨基酸的前体物质———磷酸烯醇式丙酮酸的量,整体水平上实现对芳香族氨基酸的中心代谢途径的调控,敲除Csr A并优化条件后苯丙氨酸的产量是出发菌株的两倍[23]。
4 展 望
作为一项新兴的微生物育种技术,基因敲除克
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服了传统诱变方法的盲目性和偶然性,敲除后被改变的基因会随染色体DNA进行复制,改良的菌种可稳定地用于后续的研究和生产。
随着大量模式生物及重要功能微生物全基因组的解明以及功能基因的定位,人们从基因水平上更加清楚的认识微生物代谢的规律,同时敲除载体及相关技术的完善可进一步推动代谢工程的广泛应用,通过基因敲除手段改变微生物细胞的代谢流向,阻断有害代谢产物积累,可望降低成本,大幅度提高生产水平及产品纯度。
除了微生物代谢工程,基因敲除技术还可用于基因结构与功能研究[24]、细胞生活周期调控机制研究、无毒活体疫苗的制备研究以及遗传病的基因治疗等诸多方面。随着人类基因组计划的完成以及疾病分子机理的解明,基因敲除技术还可有效用于遗传病及癌症的基因治疗。该技术可望在发酵,医药,轻工食品等多项领域作出重大贡献。
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代谢工程在工业微生物育种中的应用
代谢工程在工业微生物育种中的应用 摘要：传统的诱变育种仍是目前发酵工业菌种选育中最常用的育种技术，以基因工程技术为主的多元化育种方式的发展，为代谢途径操作引入了全新的理念和方法，使代谢工程得以发展。代谢工程是对细胞代谢网络的代谢流量及代谢控制进行定量地、系统地分析，并通过DNA重组技术和相关的遗传学手段对微生物细胞进行代谢改造，提高其目的产物代谢量。本文论述了微生物代谢工程的理论基础及其在发酵工业微生物育种中的应用现状。 关键词：代谢工程；代谢途径；菌种选育 发酵工业自20世纪40年代发展至今，在青霉素等抗生素的发酵生产、赖氨酸等一系列氨基酸的发酵生产以及核苷酸、有机酸等物质的发酵产业发展中起了极其重要的作用。在工业微生物育种的过程中，对个别基因进行改造的经典基因工程技术不能保证对微生物代谢网络结构和功能的准确分析和高效利用，影响了相关行业的生产效率的稳定和经济效益的提高。目前，几乎所有重要工业微生物模式菌种的基因组全序列已经或即将公布，转录组、蛋白质组、代谢组、通量组等数据资源正在迅速扩展。充分利用组学数据中包含的有用信息，可以更有效地改造和控制细胞性能、提高底物利用以及产品的产率、改善微生物工业适应性，促进工业生物技术发展[1]。 菌种筛选和持续不断的改良贯彻于发酵生产过程的始终，以基因工程为核心的现代生物技术正越来越显示出其在菌种改良上的魅力，将最终成为微生物育种的主导技术[2]。建立在重组DNA技术基础之上的代谢工程技术，可以更容易地选择菌种的改良靶点，构建具有新的代谢途径的微生物细胞，提高其发酵性能，生产特定目的产物，从而可以推动发酵工业的发展。 一、代谢工程概述 代谢工程（Metabolic engineering），又称途径工程（Pathway engineering），是指利用生物学原理，系统地分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径，通过遗传修饰，完成细胞特性改造的应用性学科。1974年，Chakrabarty在假单胞菌属的两个菌种中分别引入几个稳定的重组质粒，从而提高了对樟脑和萘等复杂有机物的降解活性，这成为代谢工程技术的第一个应用实例。代谢工程的概念是1991年由生化工程专
微生物课后答案
绪论 3微生物是如何分类的？ 答为了识别和研究微生物，将各种微生物按其客观存在的生物属性（如个体形态及大小、染色反应、菌落特征、细胞结构，生理生化反应、与氧的关系、血清学反应等）及谈们的亲缘关系，有次序的分门别类排列成一个系统，从小到大按域、界、门、纲、目、科、属、种等分类。 6微生物有哪些特点？ 答、①个体极小：微生物的个体极小，有几纳米到几微米，，要通过光学显微镜才能看见，病毒小于0.2微米，在光学显微镜可视范围外，还需要通过电子显微镜才可看见。②分布广，种类繁多环境的多样性如极端高温、高盐度和极端pH造就了微生物的种类繁多和数量庞大。③繁殖快大多数微生物以裂殖的方式繁殖后代，在适宜的环境条件下，十几分钟至二十分钟就可繁殖一代。在物种竞争上取得优势，这是生存竞争的保证。④易变异多数微生物为单细胞，结构简单，整个细胞直接与环境接触，易受外界环境因素影响，引起遗传物质DNA的改变而发生变异。或者变异为优良菌种，或使菌种退化。 第一章 1病毒是一类怎样的微生物？他有什么特点？ 答病毒是没有细胞结构，专性寄生在活的敏感素主体内的超微笑微生物。它们只具有简单的独特结构，可通过细菌过滤器。特点：个体小、
没有合成蛋白质结构----核糖体、也没有合成细胞物质和繁殖所必需的酶系统，不具有独立代谢能力，必须专性寄生在活的敏感细胞内依靠宿主细胞和成病毒的化学组成和繁殖新个体。 3病毒具有怎样的化学组成和结构？ 答、病毒的化学组成由蛋白质和核酸，个体大的病毒还含有脂质和多糖。病毒没有细胞机构，确有其自身特有的结构。整个病毒体分两部分：蛋白质衣壳和核酸内芯，两者够成核衣壳。完整具有感染力的病毒体叫病毒粒子。病毒粒子有两种一种不具被膜（囊膜）的裸漏病毒粒子，另一种是在核衣壳外面有被膜包围所构成的病毒粒子。 4叙述大肠杆菌T系噬菌体的繁殖过程。 答、吸附、侵入、复制与聚集、释放。吸附：大肠杆菌T系噬菌体以及它的尾部末端吸附到敏感细胞表面上某一特定的化学成分。侵入：噬菌体的尾部借着尾丝的帮助固着在敏感细胞的细胞壁上，尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖形成小孔，尾鞘消耗ATP获得能量而收、、、、、、、、、、、、P18 5什么叫毒性噬菌体？什么叫温和噬菌体？ 答、噬菌体有毒性噬菌体和温和噬菌体两种类型，侵入宿主细胞后，随即引起宿主细胞裂解的噬菌体称作毒性噬菌体。维恩和噬菌体则是：当他侵入宿主细胞后，其核酸附着并整合在宿主染色体上，和宿主的核酸同步复制，宿主细胞不裂解而继续生长，这种不引起宿主细胞裂解的噬菌体称作温和噬菌体。 6什么叫溶原细胞（菌）？什么叫原噬菌体？
基因敲除技术
第23卷武 夷 科 学V o.l23 2007年12月WUY I SCIENCE J OURNA L D ec.2007 文章编号:1001 4276 (2007)01 0187 04 几种常用的基因敲除技术 李今煜,陈健铭,彭振坤 (福建农林大学生命科学学院,福建福州350002) 摘要: 摘要:随着功能基因组学研究的深入发展,基因敲除技术逐渐成为基因功能研究的重要手段,本文就常用的三种基因敲除技术,即同源重组、插入突变、RNA干扰各自的原理、适用的范围和优缺点作简要介绍。关键词: 基因敲除;同源重组;插入突变;RNA干扰 中图分类号: Q343.1 文献标识码: A 随着越来越多生物的全基因组被测序,功能基因组学成为时下研究的热点。研究基因功能的方法主要有两种思路,一是通过增强其表达,取得表达产物进行研究,二是减弱或者终止其表达,观察整体功能的变化,进而推测相应的基因功能。前者因为不能反映基因产物的真实表达情况,而逐渐被抛弃。后者将基因与生物的整体功能联系起来考察,并能为基因的功能提供直接证据,因而其技术不断得到发展和完善,其中最常用的就是基因敲除(gene knockou t)技术。 基因敲除技术除最早的同源重组技术外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和RNA,i它们同样可以达到基因敲除的目的。下面就这几种基因敲除技术简要进行介绍。 1 利用同源重组进行基因敲除 基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞(e mbryon i c ste m cel,l ES细胞)技术的基础上逐步完善发展起来,主要是利用DNA转化技术,将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基因整合入内源基因组内,使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变,达到研究基因功能的目的[1]。 基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段,现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除;而条件基因敲除则是将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段,即通过位点特异的重组系统实现特定基因敲除[2],现阶段以噬菌体的C re/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统应用得最为广泛[3]。 虽然基因敲除技术的广泛使用使其成为研究基因功能重要的技术手段,但目前仍然存在 收稿日期:2007-09-26 基金项目:福建省自然科学基金计划资助项目(项目编号:2006J0052)。 作者简介:李金煜(1976-),女,硕士,研究方向:主要从事生物化学与分子生物学领域的研究。
代谢工程
代谢工程 科技名词定义 中文名称：代谢工程 英文名称：metabolic engineering 定义：通过基因工程的方法改变细胞的代谢途径。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；新陈代谢（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 代谢工程书籍图 代谢工程（Metabolic engineering）是生物工程的一个新的分支。代谢工程把量化代谢流及其控制的工程分析方法和用以精确制订遗传修饰方案并付之实施的分子生物学综合技术结合起来，以上述“分析——综合”反复交替操作、螺旋式逼近目标的方式，在较广范围内改善细胞性能，以满足人类对生物的特定需求的生物工程。 目录
发展前沿 展开 编辑本段发展 为了满足人类对生物的特定需求而对微生物进行代谢途径操作，已有将近半个世纪的历史了。在氨基酸、抗生素、溶剂和维生素的发酵法生产中，都可以找到一些典型实例。操作的主要方法是，用化学诱变剂处理微生物，并用创造性的筛选技术来检出已获得优良性状的突变菌株。尽管这种方法已被广泛地接受并已取得好的效果，但对突变株的遗传和代谢性状的鉴定是很不够的，更何况诱变是随机的，科学不足技巧补！ DNA重组的分子生物学技术的开发把代谢操作引进了一个新的层面。遗传工程使我们有可能对代谢途径的指定酶反应进行精确的修饰，因此，有可能构建精心设计的遗传背景。DNA重组技术刚进入可行阶段不久，就出现了不少可用来说明这种技术在定向的途径修饰方面的潜在应用的术语。如分子育种（1981年），体外进化（1988年），微生物工程或代谢途径工程（1988~1991年），细胞工程（1991年）和代谢工程（1991年）。尽管不同的作者提出不完全相同的定义，这些定义均传达了与代谢工程的总目标和手段相似的含义。 我们曾经把代谢工程定义为，代谢工程就是用DNA重组技术修饰特定的生化反应或引进新的生化反应，直接改善产物的形成和细胞的性能的学科。这样定义代谢工程强调了代谢工程工作目标的确切性。也就是说，先要找到要进行修饰或要引进的目标生化反应，一旦找准了目标，就用已建立的分子生物学技术去扩增、去抑制或删除、去传递相应的基因或酶，或者解除对相应的基因或酶调节，而广义的DNA重组只是常规地应用于不同步骤中，以便于达到这些目标。 编辑本段优势与研究方向 优势 尽管在所有的菌种改良方案中都有某种定向的含义，但与随机诱变育种相比较，在代谢工程中工作计划的定向性更加集中更加有针对性。这定向性在酶的目标的选择，实验的设计，数据的分析上起着支配的作用。不能把细胞改良中的所谓“定向” 解释为合理的途径设计和修饰，因为“定向选择”与随机诱变之间没有直接关系。相反地我们可借助于“逆行的代谢工程”（reverse metabolic engineering）, 从随机诱变而获得的突变株及其性状的实验结果，来提取途径及其控制的判断信息（critical information）。 研究方向
微生物代谢工程答案整理样本
1.微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段。 定义: 经过某些特定生化反应的修饰来定向改进细胞的特性功能, 运用重组DNA技术来创造新的化合物。 研究内容: 生物合成相关代谢调控和代谢网络理论; 代谢流的定量分析; 代谢网络的重新设计; 中心代谢作用机理及相关代谢分析; 基因操作。 研究手段: 代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工程等领域的最新成果。因此, 在研究方法和技术方面主要有下列三大常见手段: (1)检测技术: 常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究, 如物料平衡、同位素标记示踪法、酶促反应动力学分析法、光谱学法、生物传感器技术。 (2)分析技术: 采用化学计量学、分子反应动力学和化学工程学的研究方法并结计算机技术, 阐明细胞代谢网络的动态特征与控制机理, 如稳态法、扰动法、组合法和代谢网络优化等。 (3) 基因操作技术: 在代谢工程中, 代谢网络的操作实质上能够归结为基因水平上的操作: 涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术, 如基因和基因簇的克隆、表示、调控, DNA 的杂交检测与序列分析, 外源DNA 的转化, 基因的体内同源重组与敲除, 整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。 2. 2.代谢改造思路和代谢设计原理。 代谢改造思路: 根据微生物的不同代谢特性, 常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。 (1)改变代谢途径的方法: 加速限速反应, 增加限速酶的表示量, 来提高产
物产率。改变分支代谢途径流向, 提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力, 使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势, 从而提高目的代谢产物的产量。 (2)扩展代谢途径的方法: 在宿主菌中克隆和表示特定外源基因, 从而延伸代谢途径, 以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。 (3)转移或构建新的代谢途径: 经过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。 代谢设计原理: 现存代谢途径中改变增加目的产物代谢流: 增加限速酶编码基因的拷贝数; 强化关键基因的表示系统; 提高目标途径激活因子的合成速率; 灭活目标途径抑制因子的编码基因; 阻断与目标途径相竟争的代谢途径; 改变分支代谢途径流向; 构建代谢旁路; 改变能量代谢途径; 在现存途径中改变物流的性质: 利用酶对前体库分子结构的宽容性; 经过修饰酶分子以拓展底物识别范围; 在现存途径基础上扩展代谢途径: 在宿主菌中克隆、表示特定外源基因能够延伸代谢途径, 从而生产新的代谢产物、提高产率。 3. 微生物的基因操作技术有哪些? ( 举两例说明) 微生物的基因操作技术有: 核酸的凝胶电泳、核酸的分子杂交技术、DNA序列分析、基因的定点诱变、细菌的转化、利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究、PCR技术等。 基因定点突变(site-directed mutagenesis): 经过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列, 用于研究氨基酸残基对蛋白质的结构、催
CRISPR cas9基因敲除原理及其应用
CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用 CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。 目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。 由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。 通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：Cas9质粒构建 设计2条单链oligo序列； 退火形成双链DNA pGK1.1 将双链DNA连接到载体 中 转化G10competent cell 筛选阳性克隆；测序验证 序列；质粒大提；电转染 靶细胞 在细胞内crRNA识别靶 位点，Cas9对靶位点进行 随机剪切 Cruiser TM酶切细胞池，计 算突变率；Cruiser TM酶切 初筛阳性克隆；将阳性克 隆测序验证；做敲除序列 比对分析。
基因敲除技术研究进展
兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述 题目：基因敲除技术研究进展 作者：王振宇 学号：201207744 指导教师：谢放 完成日期：2014-7-16
基因敲除技术研究进展 摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除 RNA i生物模型基因置换基因打靶同源重组1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、
我国在微生物代谢领域的研究现状及展望
我国在微生物代谢领域的研究现状及展望 发表时间：2012-06-18T14:33:59.827Z 来源：《赤子》2012年第8期供稿作者：李夏 [导读] 微生物代谢是指微生物吸收营养物质维持生命和增殖并降解基质的一系列化学反应过程，包括有机物的降解和微生物的增殖。 李夏（四川化工职业技术学院，四川泸州 646005） 摘要：微生物代谢是指微生物吸收营养物质维持生命和增殖并降解基质的一系列化学反应过程，包括有机物的降解和微生物的增殖。在分解代谢中，有机物在微生物作用下，发生氧化、放热和酶降解过程，使结构复杂的大分子降解；合成代谢中，微生物利用营养物及分解代谢中释放的能量，发生还原吸热及酶的合成过程，使微生物生长增殖。文章主要介绍我国在微生物代谢领域的研究现状及对未来的展望，为我们呈现了一个广阔的微生物代谢世界。 关键词：微生物代谢；分解代谢；合成代谢；研究现 前言 微生物在生长过程中机体内的复杂代谢过程是互相协调和高度有序的，并对外界环境的改变能够迅速做出反应。其原则是经济合理地利用和合成所需要的各种物质和能量，使细胞处于平衡生长状态。在实际生产中，往往需要高浓度的积累某一种代谢产物，而这个浓度又常常超过细胞正常生长和代谢所需的范围。因此要达到超量积累这种产物，提高生产效率，必须打破微生物原有的代谢调控系统，在适当的条件下，让微生物建立新的代谢方式，高浓度的积累人们所期望的产物[1]。 1 我国微生物代谢的研究现状 1.1 利用微生物代谢生产酶 工业上，曾由植物、动物和微生物生产酶。微生物的酶可以用发酵技术大量生产，是其最大的优点。而且与植物或动物相比，改进微生物的生产能力也方便得多。微生物的酶主要应用于食品及其有关工业中。酶的生产是受到微生物本身严格控制。为改进酶的生产能力可以改变这些控制，如在培养基中加入诱导物和采用菌株的诱变和筛选技术，以消除反馈阻遏作用。 1.2 利用微生物代谢产生的代谢产物生产目的物 在微生物对数生长期中，所产生的产物，主要是供给细胞生长的物质，入氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物等。这些产物称为初级代谢产物。利用发酵生产的许多初级代谢产物，具有重大的经济意义，我国现已可以根据微生物代谢调控的理论，通过改变发酵工艺条件如pH、温度、通气量、培养基组成和微生物遗传特性等，达到改变菌体代谢平衡，过量生产所需要产物的目的。 1.3 利用微生物代谢理论发展产生了代谢工程 代谢工程是指利用基因工程技术，定向的对细胞代谢途径进行修饰、改造，以改变微生物的代谢特征，并于微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新的代谢途径，生产新的代谢产物的工程技术领域。 1.4 改变微生物代谢途径生产目的物 改变代谢途径是指改变分支代谢的流向，阻断其他代谢产物的合成，以达到提高目的产物的目的。改变代谢途径有各种方法，如加速限速反应，改变分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改变能量代谢途径等不同方法[1]。 1.5 利用微生物代谢进行发酵 数千年来由于科学技术进步缓慢，各种微生物工业也未能充分发展。直到20世纪中期才建立了一系列新的微生物工业。近几年来，由于微生物代谢工程的应用，发酵工业开始进入新的发展时期。发酵产品增长快、质量明显提高，在国民经济中起重要作用。 1.6 微生物代谢在环境方面的应用 微生物降解是环境中去除污染物的主要途径。深人了解污染物在微生物内的代谢途径，将有助于人们优化生物降解的条件，从而实现快速的生物修复。这些代谢中间体大都通过萃取、分析方法进行逐个研究，并借助专家经验拟合出代谢途径，其动力学过程亦很少触及。代谢组学方法的采用有可能改变这一现状[2]。 1.7 利用微生物代谢进行赖氨酸的生产 在许多微生物中，可用天冬氨酸作原料，通过分支代谢途径合成出赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。赖氨酸在人类和动物营养上是一种十分重要的必须氨基酸，因此，在食品、医药和畜牧业上需求量很大。但在代谢过程中，一方面由于赖氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制作用，另一方面，由于天冬氨酸除用于合成赖氨酸外，还要作为合成甲硫氨酸和苏氨酸的原料，因此，在正常细胞内，就难以累积较高浓度的赖氨酸。 为了解除正常的代谢调节以获得赖氨酸的高产菌株，工业上选育了谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型菌株作为赖氨酸的发酵菌种。由于它不能合成高丝氨酸脱氢酶，故不能合成高丝氨酸，也不能产生苏氨酸和甲硫氨酸，在补给适量高丝氨酸的条件下，可在含较高糖浓度和铵盐的培养基上，产生大量的赖氨酸[3]。 1.8 微生物代谢与分子生物学方法的结合 随着遗传学、分子生物学等方法的不断发展，人们越来越多地将这些方法运用到微生物的研究工作中。一些野生菌的合成能力或分泌能力有限，目前可通过人工诱变或构建高效的基因工程菌株等方法对其进行改造以扩大应用范围此外，现在许多细菌合成拮抗物质的基因已被克隆测序，为使植物获得微生物所具有的特殊功能，一种可能的方法是通过基因工程将目的基因导入植物体内，使植物直接表达活性物质[4]。 2 展望 2.1 微生物代谢在医药行业的展望 微生物在代谢过程中可分泌蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等几十种胞外酶进入培养基，这些酶有的可以将药物成分分解转化，形成新的化合物，有的可水解植物细胞壁的纤维素、半纤维素、果胶质等，使细胞破裂，利于有效成分溶出。特别是采用一些酶作用于药用植物材料，使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素等物质降解，使细胞破裂，细胞间隙增加，减小细胞壁、细胞间物质传递屏障、对有效成分从胞内向胞外扩散的阻力减少，可促进有效成分的吸收提高。 2.2 微生物代谢在生理生化、微生物遗传育种方面的展望 随着分子生物学理论与技术的飞速发展，尤其是基因组和后基因组时代的到来，传统上的生理学与遗传学的交叉融合越来越多，许多
《微生物》习题附答案
一．名词解释 1.巴氏消毒法： 2.致死温度： 3.同步生长： 4.生长限制因子 5.次生代谢物 6.温和噬菌体： 7.致死时间： 8.灭菌: 9.消毒与灭菌： 10．disinfection 消毒continuous culture 连续培养 11．纯培养： 二．填空 1．混菌法平板计数，在10-2稀释度的平板中平均有32个细菌菌落，每毫升原始牛奶中有个__________细菌. 2．__________是在10分钟内将悬液中的所有微生物都杀死的最低温度。 3．__________ 酶能消除超氧化物自由基的毒害。 4．厌氧菌可生长在__________的培养基中 5根据细菌的生长曲线可将细菌的生长分为__________，__________, _________和__________ 四个时期，作为研究材料应取__________时期细菌最合适。 6．氢离子浓度（pH）可影响到细胞质膜电荷和养料吸收，大多数细菌的最适生长pH值为__________ 。 7书写莫诺（Monod）经验公式：__________，其含义是表示______________ . 8巴氏消毒采取的条件为：___________。 9高压蒸汽灭菌采取的条件为：_____________________。 10设一种细菌在接种时的细胞浓度为100个/ml，经400min的培养，细胞浓度增至10亿个/ml，则该菌在该段时间内的G为__________ ；R为__________ ；n为__________ 。（注：1/lg2=3.322，整个培养过程都处于对数期） 11好氧的微生物需要较____________（高、低）的氧化还原电位。厌氧的微生物需要较_____________（高、低）的氧化还原电位。 12烘箱热空气灭菌法的操作条件是控制温度在__________ ，维持时间为__________ 。
基因敲除小鼠的制作方法
.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.
微生物生产L_苏氨酸的代谢工程研究进展_董迅衍
Advances in Microbial Metabolic Engineering to Increase L-Threonine Production DONG Xunyan 1，2， WANG Xiaoyuan *1，2 （1.State Key Laboratory of Food Science and Technology ，Jiangnan University ，Wuxi 214122，China ；2.School of Biotechnology ，Jiangnan University ，Wuxi 214122，China ） Abstract ：As an essential amino acid for mammals ，L-threonine has a wide application in the food ，feeds ，pharmaceutical and cosmetics industries.To date ，L-threonine is almost exclusively produced through microbial fermentation.Metabolic engineering provides an effective means to strain development and thus to enhancing the L-threonine production.In this article ，the pathway and regulation of L-threonine in the major industrial strains ，Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli are summarized ，and advances on metabolic engineering to increase L-threonine production are reviewed. Keywords ：L-threonine ，Corynebacterium glutamicum ，Escherichia coli ，metabolic engineering ，fermentation 摘要：L-苏氨酸作为一种必需氨基酸被广泛用于食品、饲料、医药及化妆品行业。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵法生产。代谢工程技术的应用为菌种选育开辟了有效途径，使在现有高产基础上进一步提高氨基酸的产量成为可能。作者对两大氨基酸生产菌——— 大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中的L-苏氨酸生物合成相关途径、代谢调控机理以及运用代谢工程技术提高L-苏氨酸产量所取得的成果进行了系统综述。 关键词：L-苏氨酸；谷氨酸棒杆菌；大肠杆菌；代谢工程；发酵中图分类号：Q 933 文献标志码：A 文章编号：1673—1689（2016）12—1233—08 微生物生产L-苏氨酸的代谢工程研究进展 董迅衍1，2，王小元*1，2 （1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏无锡214122；2.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122） 收稿日期：2016-07-08 基金项目：国家973计划项目（2012CB725202）；国家自然科学基金项目（NSFC31370131）；江南大学博士科研基金项目（JUDCF11025）。作者简介：董迅衍（1986—），女，江苏无锡人，发酵工程博士研究生，主要从事氨基酸生产菌株代谢工程方面的研究。 Email ：xunyandong@https://www.wendangku.net/doc/9b14835516.html, *通信作者：王小元（1965—），男，山西垣曲人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事工业微生物代谢工程方面的研究。 E-mail ：xwang@https://www.wendangku.net/doc/9b14835516.html,
微生物代谢工程
微生物代谢工程 1.代谢控制发酵 代谢控制发酵就是利用遗传学的方法或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使得目的产物大量的生成、积累的发酵。 代谢控制发酵的核心：解除微生物代谢控制机制，打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。 2.微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段 定义：应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。简而言之，代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的的修饰。 研究内容： (1)代谢流的定量和定向 (2)细胞对底物的吸收和产品的释放模型及分析 (3)研究胞内代谢物浓度的反应工程方法 (4)用13C标记实验进行胞内稳态流分析 研究手段 (1)采用遗传学手段的遗传操作 ①基因工程技术的应用。②常规诱变技术的应用。 (2)生物合成途径的代谢调控 ①生物合成中间产物的定量生物测定。②共合成法在生物合成中的应用。③酶的诱导合成和分解代谢产物阻遏。④无机磷对生物合成的调节。 (3)研究生物合成机制的常用方法 ①刺激实验法。②同位素示踪法。③洗涤菌丝悬浮法。④无细胞抽提法。⑤遗传特性诱变法。 3. 工业发酵的五字策略（图示加文字说明） ①进，在育种和发酵控制方面都要促进细胞对碳源营养物质的吸收； ②通，在育种方面解除对某些酶的反馈调节，在发酵控制方面，诱导这些酶的合成或激活这些酶，从而使来自各代谢物流（除碳架物流外海包括其他支持生物合成的物流）能够畅通的注入载流途径，汇入代谢主流，流向目的产物，特别是当发酵进入目的产物合成阶段后，必需确保载流路径通畅，代谢主流优势明显 ③节，采用育种或发酵控制手段，节制与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物。这里所谓的“节制”是指封闭或削弱以目的产物合成途径的起始底物或以中间产物为起始底物的分支途径； ④堵，采用育种或发酵手段消除或削弱目的产物进一步代谢的途径，包括目的产物参与的分解代谢和合成代谢，为了消除或削弱目的产物的进一步分解代谢，就必须降解目的产物进一步代谢的酶活力或酶量，甚至使这些酶不再合成或不起作用； ⑤出，促进目的产物向胞外空间分泌。在育种和发酵控制发面可通过调节细胞对目的产物的通透性，增加输送目的产物的载体蛋白的量，为目的产物输送代谢能的方法，使目的产物尽快转移出细胞。 4. 酶的阻遏机制，以大肠杆菌色氨酸或组氨酸操纵子为例来说明（图示加文字说明） 终端产物对其自身合成途径的酶的合成的反馈阻遏和弱化的机制反馈阻遏：
基因敲除技术的最新进展doc - 丁香园
基因敲除技术的最新进展 yunfenglin 干细胞与组织工程讨论版 【摘要】 自从上世纪80年代初的胚胎干细胞技术的成熟，在短短的20年里，关于基因敲除动物模型的报道呈几何数增长。现在的技术已经可以产生在时间和空间上都可以人为控制的，从点突变到染色体组大片段的删除和重排的各种基因突变小鼠，这样就可以让研究每个基因的具体功能成为可能。本文将首先简介基因敲除技术的技术背景、基本原理、基本步骤；然后将重点介绍现在基因敲除的常用策略及其利弊；接着将探讨基因打靶结果不理想的常见因素，包括基因背景、基因重复、基因补偿、和基因补充；最后介绍基因打靶技术的技术热点，包括组织特异性打靶、诱导性打靶。并探讨基因打靶技术在颌面外科的应用前景。 【关键词】基因敲除、条件性基因打靶、组织特异性基因打靶、诱导性基因打靶 技术背景 基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的[1]，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。所谓胚胎干细胞(Embryonic Stem cell，ES)是从着床前胚胎(孕3—5天)分离出的内细胞团(Inner cell mass，ICM)细胞[2]，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性。在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠胚胎，它能发育成胚胎的各种组织。而基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能，这种重组称为同源重组。[3] 基因打靶就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术[4]。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。现在基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。２０００年初的敲除了决定表面抗原的猪的模型的成功建立更是为异种器官移植排除了一道重要的障碍，展示了基因敲除技术的美好前景。 基本步骤 利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为： ａ．ES细胞的获得：现在基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最近来自于C57BL/6×CBN/JNCrj F1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。c57BL／6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学领域，并以此为背景建立了许多成功的转基因模型。[5,9,11] ｂ．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，此重组载体即为打靶载体。因基因打靶的目的不同，此载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体[6,7]。如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上，这种情况下应设计的插入型载体要包括外源
基因敲除技术的原理、方法和应用
基因敲除技术的原理、方法和应用 2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验浏览次数：6302 网友评论 0 条 1．基因敲除概述 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2利用随机插入突变进行基因敲 除。 2.3.RNAi引起的基因敲除。 3．基因敲除技术的应用及前景 4．基因敲除技术的缺陷 关键词：基因敲除 1．基因敲除概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
微生物代谢工程
生工学院 课程编号：020101 课程名称：分子生物学（Molecular Biology） 总学时：41 学分：2.0 主讲教师：王正祥（教授） 主要内容：前言、分子生物学方法、转录和转录后加工、翻译、DNA复制重组和转座、基因组、实验。通过学习掌握分子生物学的基本知识，了解分子生物学的最新进展，掌握分子生物学中常用专业英文词汇，基本掌握分子生物学研究中的核心技术。 课程编号：020102 课程名称：基因操作实验技术（Laboratory Techniques for Gene Manipulation） 总学时：56 学分：2.0 主讲教师：王正祥（教授） 主要内容： 课程编号：020201 课程名称：工业微生物资源（Sources and Application of Industrial Microorganisms） 总学时：46 学分：2.0 主讲教师：诸葛健(教授) 主要内容: 工业微生物资源、目的菌株筛选、模拟放大、工业微生物的初步鉴定与保藏、专利保护。通过学习，可以帮助同学掌握工业微生物资源的获得方法和应用工业微生物生产的技术；为学位研究课题奠定应用工业微生物的技术基础。 课程编号：020202 课程名称：工业微生物育种学（Genentic Improvement of Industrial Microorganisms） 总学时：46 学分：2.0 主讲教师：诸葛健(教授) 主要内容:绪论、诱变育种、原生质体育种技术、基因工程育种技术。通过本课程的学习，将进一步规范微生物操作，完成单元实验和组合实验，为进入研究课题奠定有关的基础理论和实验技能。 课程编号：020203 课程名称:现代微生物实验技术(Modern Microbiology Laboratory Manual) 总学时：46 学分：2.0 主讲教师：诸葛健(教授) 主要内容：显微技术、微生物细胞特殊结构的观察、噬菌体、工业菌种的标记获得、核酸的测定、固定化技术等。通过本课程的学习使学生进一步了解和初步掌握一些现代微生物学上应用的实验技术，有利于学位论文中更多采用现代微生物学实验技术。 课程编号：020204
基因敲除技术样本
基因敲除技术 点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢 绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的 使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):
图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子 都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]