菌种科学保藏常用方法

菌种科学保藏常用方法

中华保健食品商务网https://www.wendangku.net/doc/9c8669138.html, 2004-5-31

生产母种通常用PDA培养基，选用180×18毫米试管，制成斜面试管接种而成。PDA培养基配方：

土豆（去皮、去芽）200克（也可用淀粉，用量为6克/1000毫升）

葡萄糖20克

琼脂20克

磷酸二氢钾2克

复合维生素B 2克

旦白胨5克

硫酸镁0.3克

加水1300毫升

本刊记者高级农艺师丁湖广

菌种是国家重要的生物资源，是以微生物为对象的研究和生产所必不可少的材料。因此，世界各国对菌种的保藏极为重视，有55个国家专门设菌种保藏机构。国际微生物学会设有世界菌种保藏机构，简称WFCC，编写有《世界菌种保藏名录》。我国菌种保藏机构，有中国微生物菌种保藏管理委员会（设在北京），共保藏有8000多个菌株，其任务是收藏、供应各种优良菌种。

菌种保藏的目的是：使菌种长期保藏之后，仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征，以及不污染杂菌和不发生虫害。菌种保藏的原理是通过低温、干燥、隔绝空气（真空）和断绝营养等手段，以达到最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制菌丝的生长的繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，所以能够保藏较长时间。

现将菌种保藏的几种主要方法介绍如下。

一、斜面低温保藏这是一种常用最简便的保藏方法。首先将需要保藏的菌种移接到PDA培养基上。为了减少培养基水分散发，延长保藏时间，在配制时琼脂用量加到2.5％，再加入0.2％磷酸氢二钾、磷酸二氢钾及碳酸钙等缓冲剂，以中和保藏过程中产生的有机酸。如果是保藏香菇和木耳菌种，应把配方中的葡萄糖换成麦芽糖，培养基装入量不少于12毫升。菌种接种后置于用适宜温度下培养至菌丝长满斜面，然后选择菌丝生长健壮的试管，先用硫酸纸包扎好管口棉塞，再将若干支试管用牛皮纸包好。也可以用无菌胶塞代替棉塞，既能防止污染，又可隔绝氧气，避免斜面干燥。

具体做法是：选择大小合适的橡皮胶塞，洗净晾干，在75％酒精液中消毒1小时后，用无菌纱布吸去酒精，在火焰上方烧去残留的酒精液；于无菌条件下，将试管口在火焰上灼烧灭菌，拔出棉塞，换上胶塞，再用石蜡密封，放入4℃左右的电冰箱内保存。每隔3～4个月转管一次。如果用胶塞石蜡封口，转管期可延迟至6个月。

斜面低温保藏过程，冰箱内相对湿度应控制在40％～50％，尽量少启用冰箱，以免产生冷凝水而引起污染；若必须启用应边开、边取、边关，做到快速、短暂、熟练。对于个别不耐低温的菌种，如草菇菌丝在5℃下易于死亡，一般置10～12℃条件下保藏，或加质量分数0.1无菌甘油作防冻剂，然后置于4～6℃冰箱贮藏。低温贮藏法简单易行，适用于所有食用菌，是最实用贮藏方法，已得广泛应用。在冰箱较普及的情况下，食用菌专业户、菇农等均可采用。缺点是贮藏时间短，需经常继代培养，不但费时费工，而且传代多，易引起污染、衰退或造成差错。

二、液体石蜡保藏液体石蜡又名矿油，所以该法又称矿油保藏法。这种方法操作简便，只要在菌苔上灌注一层无菌的液体石蜡，即可使菌种与外界空气隔绝，达到防止培养基水分散失，抑制菌丝新陈代谢，推迟菌种老化，延长菌种生命和保存时间的目的。所以此种方法也称为隔绝空气保藏法。

具体操作：选用化学纯液体石蜡100毫升，装入250毫升锥形瓶内，瓶口加棉塞，置于0.103兆帕（1.055千克/厘米2）灭菌30～60分钟；然后置于160℃烘箱中处理1～2小时；或置40℃温箱内3天左右，见瓶内液体石蜡呈澄清透明，液层中无白色雾状物时即可。其目的是使灭菌时进入瓶内的水分得到蒸发。然后在无菌条件下，将液体石蜡倾注或用无菌吸管移入生长健壮、丰满的斜面菌种上，使液体石蜡高出斜面顶端1厘米左右；最后直立放置在洁净的室温下贮藏，转管时直接用刀切取1小块菌种，移接到新的斜面培养基中央，适温培养，余下的菌种仍在原液体石蜡中贮藏。

因经贮藏后的菌丝沾有石蜡，生长慢而弱，需再继代转接1次方可使用。贮藏场所应干燥，防止棉塞受潮发霉；定期观察，凡斜面暴露出液面，应及时补加液体石蜡。也可用无菌橡皮塞代替棉塞：或将棉塞外露部分用刀片切除，蘸取融化的固体石蜡封口，以减慢蒸发。此法贮藏时间可达1年以上，有的可达10年，效果好。

三、悬液保藏此法是将需要保种的菇类菌丝球或孢子保藏在适当的媒液中。现介绍3种媒液的保藏方法：

1、生理盐水保藏法：本法适合保藏深层培养的菌丝球，以无菌生理盐水作为媒液进行保藏。首先制备生理盐水，按常规法制备0.85％的生理盐水，健壮试管每管装约5毫升，经高压灭菌。将保藏的菌种接入马铃署、葡萄糖液体培养基中，250毫升三角瓶装入60毫升，振荡培养5～7天（27～28℃，180转/分）。然后吸取菌丝球4～5个放入上述试管中，管中加上无菌橡皮塞，并用固体石蜡封好，置于4℃下保藏。据黑龙江应用微生物研究所报道，用此法保藏香菇、紫芝菌种，可存活18个月：保藏双孢蘑菇、木耳、银耳、金针菇、茯苓、假蜜环菌、金顶磨、糙皮侧耳、猴头菌等菌种、可存活2年。

2、蒸馏水保藏法：这是保存斜面菌种和孢子最简单的方法，有效期可达1年以上。斜面蒸馏水贮藏：在锥形瓶内装入容量1/3左右的蒸馏水，加棉塞，在0.103兆帕（1.055千克/厘米2）121℃灭菌30分钟，冷却。在无菌条件下，将蒸馏水倾注入需保藏的斜面菌种内。加水量需高出斜面顶端1～2厘米，更换无菌橡皮塞，

直立置于4～6℃冰箱内贮藏。孢子蒸馏水贮藏：试管内分装入蒸馏水，装量约管长的1/5，加棉塞经灭菌冷却后在无菌条件下提取少许孢子，移入试管蒸馏水内，换上橡皮塞，直立置于4～6℃冰箱内贮藏。上述两种方法，若保存时间较长，中途需补充无菌蒸馏水。使用时从管内挑取菌种块或蘸取孢子悬液，移接至新的斜面培养基上活化培养。原试管加塞后仍可继续贮藏。

3、营养液贮藏：马铃署综合培养基内不加琼脂，并加水稀释10倍，分装入试管内，装量约为管长1/4。棉塞上衬1层低压乙稀薄膜，防止棉塞滋生杂菌。然后经0.103兆帕（1.055千克/厘米2）121℃高压灭菌30分钟，冷却后在无菌条件下，移接入菌丝球或带琼脂的菌丝块，直立置室温8～28℃条件贮藏。以后液面逐渐形成菌苔，并沿管壁蔓延。使用时挑取菌苔或菌丝球、菌块，移接至新的斜面培养基上，适温活化培养。

四、载体保藏载体保藏是使食用菌孢子吸附在适当的载体上，如砂土、滤纸等进行干燥保藏的一种方法。其原理是利用孢子具有坚厚的细胞壁，对干燥具有较强的抵抗力，在干燥环境中保存若干年后，遇到适宜的条件，仍会萌发生长的特性而进行保藏的。绝大多数孢子都可采取此法保藏。

1、砂土管贮藏：此法具有广泛应用，适于贮藏孢子和酵母状分生孢子，而对菌丝体不适用。操作时选用细河砂，用内径0.250～0.177毫米筛孔过筛,除去粗粒和砂未；另取耕作层以下、瘠薄的红黄壤土，通过内径0.149毫米过筛，砂土中含铁屑，需用磁铁衬纸吸除，并用0.05～0.1盐酸浸泡半天，除去有机质。然后用清水反复冲洗至酸碱度近中性后，置于60～80℃烘箱中烘干。砂土比例2:1或4:1混合，分装入10毫米×100毫米试管或安瓿瓶内，每管装量0.5克，高度约0.7厘米，加棉塞。经0.138兆帕（1.4千克/厘米2）127℃高压灭菌30分钟，每天1次，共3次。也可采用160℃干热灭菌1次，保持2～3小时。灭菌后挑取少许砂土移至PDA 斜面上培养，证实无杂菌即可。

砂土管中接入孢子分为干接入和湿接两种。干接时，用接种环直接挑取孢子2～3环，拌入砂土管中：湿接时，将孢子刮入5毫升无菌水的试管内，充分摇匀，制在孢子悬液，然后用1毫升吸管吸取悬液，每管中加入0.2毫升。干接法制成的砂土管，含水分少，可直接放在盛有无水氯化钙、变色硅胶或生石灰的广口瓶内保存：湿接法制成的砂土管，需放入干燥剂的真空干燥器内，用真空泵抽气8～10小时，使之干燥。此工作需在接入孢子后12小时内完成，以免孢子发芽。抽干后砂土需用抽样进行无菌检查，合格者可放在盛有无水氯化钙或变色硅胶的大试管内，加橡皮塞，放置4～6℃冰箱中贮藏。此法保藏孢子，寿命可达2～10年，使用时在无菌条件下，挑取少许砂土孢子，抖撒在PDA斜面上，适温培养，菌丝生长后，再转管培养1次。

2、孢子滤纸保藏：将食用菌孢子吸附在滤纸上，干燥后再行低温保藏。此法操作方便，效果也较理想。适用于蘑菇、金针菇、黑木耳和猴头菌等。用滤纸保藏其孢子，可存活18个月。

具体操作：将白色滤纸或黑色粗而厚纸剪成宽约0.6厘米，长2厘米的滤纸条若干张，平铺在大培养皿底，经0.096兆帕（0.984千克/厘米2）120℃高压灭菌30分钟后，在烘箱中稍加烘干。然后将灭菌的滤纸条培养皿移入孢子采罩内，接受孢子（孢子白色宜用黑色纸）。待孢子弹射滤纸条后，用镊子将纸条移入PDA斜面中，管内先装若干变色硅胶干燥剂。然后置干燥器中1～2天，充分干燥后，用火焰熔封试管口，即制成滤纸条保藏管，贴好标签，置于低温下保藏。需用时先用砂轮在管壁外划痕，再在划痕处稍加热，然后用浸有来苏儿湿布敷上，管壁即自动破裂，此时以无菌操作，镊取滤纸条，将附有孢子的一面贴在培养基上，适温下培养一周左右，孢子即萌发菌丝。

五、天然基质保藏天然基质的种类很多，下面介绍常见的几种保藏法。

1、麦粒种保藏法：用麦粒来保藏蘑菇和灵芝菌种，保藏期蘑菇达18个月，而灵芝可达5年之久仍有生活力。制作方法如下：选取无病虫害新鲜小麦，淘洗后在水温20℃下浸5小时，使麦粒含水量达25％为宜。将麦粒稍晾干后，装入试管长度的1/3。然后置于0.103兆帕（1.055千克/厘米2）高压灭菌40分钟后，趁热摇散，冷却接种。每管内接入菌丝悬浮液一滴，摇匀后置于25℃室内培养。当大多数麦粒出现菌丝时，移于干燥冷凉的地方保藏。

2、枝条种保藏法：采用树木枝条作为木腐型菇菌的保藏培养基。选取直径1～1.5厘米的阔叶树枝条,截成1.5～2.0厘米长，晒干备用。使用时将枝条在5％米糠水中浸泡12小时，吸足水分。拌好木屑培养基，按枝条与木屑培养基以3:1的体积比混匀；装入大试管或菌种瓶内，并在表面覆盖一薄层木屑培养基，压平；清洗管壁。按常规法进行灭菌接种、培养，待菌丝长好后，置于常温下或冰箱内保藏。

3、木屑种保藏法：配料按78％木屑、20％麸皮、1％蔗糖、1％石膏粉，加适量水拌匀；装入试管长度3/4，洗净管口，塞好棉塞；用牛皮纸包好管口，置于0.103兆帕（1.055千克/厘米）灭菌40分钟；接种后在25℃下恒温培养。待菌丝长到培养基2/3小时取出，用蜡将棉塞封好，包上塑料薄膜，放入4℃冰箱内，能保藏1～2年。使用时从冰箱取出后，置于25℃恒温箱内培养12～24小时。

4、发酵粪草种保藏法：草腐型菇菌以蘑菇发酵粪草料的保藏为例。选取蘑菇栽培用的发酵料，晒干后去除粪块；将料草切成2厘米长，在清水中浸4～5小时，让料草浸透水，并使之失去一部分养分，沥水控湿至含水量68％左右。将处理好的料草装入大试管中，松紧适当，过紧空隙小空气少，菌丝生长慢；过松则菌丝抗逆能力差，影响菌种生活力。装管后清洗管壁，加上棉塞，经0.103兆帕（10.55千克/厘米2）121℃高压力灭菌2小时，冷却后接种，置于25℃条件下培养，待菌丝长满管后，用石蜡将棉塞封闭，或更换无菌橡皮塞，置电冰箱内保藏。（草菇不耐温，不可置于冰箱内可藏）

六、真空干燥保藏采用低温、干燥和真空办法，使菌种的新陈代谢活动处于高度静止状态，也就是在极低温度下（-70℃左右）快速冷冻，然后在极低温度下真空干燥，使菌体细胞结构成分保持原来状态。因此，菌种保藏10～20年，仍不降低其原有性能。冷冻干燥是目前应用最广泛、效果较好的一种菌种保藏方法。具体操作方法：

1、安瓿瓶的准备：取中性玻璃安瓿瓶，规格内径8毫米、长度不小于100毫米的为好。先用2％盐酸浸泡12小时，再用清水洗涤3次，然后用蒸馏水洗净、烤干；瓶口加棉塞，灭菌后备用。

2、保护剂的选择：保护剂的作用是使细胞在冻干过程中免受损伤及减少在保藏过程中的死亡。保护剂种类很多，如牛马血清、无菌牛奶等，多数菌种保藏是脱脂牛奶。脱脂牛奶的制备方法是：先将牛奶放在阿诺氏灭菌器内加热30分钟，再置于冰箱内，待油脂上浮后用吸管吸取底层牛奶。然后经0.73兆帕压力灭菌15分钟备用。

3、冷冻干燥装置：一般条件好的实验室备有5PS快速真空离心冷冻干燥机。这个装置包括1台真空泵、1付麦氏真空计、1个缓冲瓶、1个真空干燥器（内装五氧化二磷或无水氯化钙等干燥剂）和1个冷冻槽（内盛有1:3的食盐和碎冰块）。

4、制备孢子液：按无菌操作法收集菇菌孢子，用接种针挑取孢子接入盛有2～3毫升无菌脱脂牛奶的试管中，稍加搅动即制成悬浮液。用吸管吸取悬浮液注入安瓿瓶。每管分装约0.2毫升，注意不要溅污上部管壁，防止杂菌污染和熔封时引起碳化。分装应在1小时内完成，装后棉花塞好管口。

5、预冻孢子液：在冷冻干燥之前，先将孢子液的安瓿瓶，置于低温冰箱中预冻1小时，其目的是防止抽气初期产生大量泡沫而外溢。也可将安瓿瓶置于1:1的干冰（固态二氧化碳）和95％乙醇或丙酮液中低温预冻。安瓿瓶放在上述冻结剂中，只需4～5分钟，温度便可达-70℃。

6、减压干燥：将预冻时附在这瓿瓶管上的冰水揩干，立即放入干燥器中抽真空。真空度用“麦氏真空计”测量，一般掌握在30分钟内能达到93.3帕时，菌种冻块才不致融化，继续抽气到真空26.6帕后，保持6～8小时即可。

7、真空熔封：菌种安瓿瓶经减压干燥后，应立即取出安装在封口用的玻璃抽气管上，进行抽气熔封管口。抽气管是一个多歧管，每个分支管口接有真空橡皮管，安瓿瓶口就插在橡皮管内。熔封须保持在真空状态下抽气约10分钟即可达26.6帕。边抽气，边用煤气或酒精灯的细火焰，对准安瓿瓶中央，即可熔断封口。熔封时应注意火焰，不宜过大。

安瓿瓶菌种启用时，在无菌操作下打开这瓿瓶，加入0.3～0.5毫升的无菌生理盐水或1％麦芽汁即可使用。

由于真空干燥保藏的菌种是密封在安瓿瓶里的，因此不仅邮寄运输方便，并且不会污染杂菌。此法适于能形成孢子的菇类长期保藏，其设备和操作均较复杂。

七、液态氮超低温保藏将要保藏菌种的悬浮液或菌块，密封于盛有保护剂的安瓿瓶里，先在控制的条件下致冷，使之缓速预冻，再置于-150至-196℃液态氮超低温冰箱中保藏。其原理是：采用超低温手段，使菌体细胞代谢活动降低到最低水平，甚至处于休眠状态。它的优点是：保存时间可长达数年至数十年；适用范围广，对一些即使不耐低温菌种，如草菇等，也可在保护剂的保护下进行超低温保存；此外，经保藏的菌种基本上不发生变异。

培养基常用马铃薯汁1000毫，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，PH5.6。冷冻保护剂可用10％（V:V）的甘油蒸馏水或10％（V:V）的二甲亚砜蒸馏水。按无菌操作法收集孢子，制成孢子悬浮液。将上述培养基经灭菌后，趁热倒入无菌培养皿制成平板，在中心点接入欲保存的菌种，适温培养。

安瓿瓶的玻璃应能经受温度的突变而不破裂，并容易熔封管口。瓶的大小为75×10毫米，能容1.2毫升保护剂。每瓶装入0.8毫升的保护剂，加上棉塞，经0.096兆帕（0.984千克/厘米2）压力灭菌15分钟即可。若直接用无菌保护剂制备菌悬液，则可将安瓿瓶空管灭菌，然后按无菌操作法将菌悬液或菌丝片装入安瓿瓶内，经火焰熔封瓶口后，可用浸水法检查是否漏气。将封口的安瓿瓶放在慢速冷冻器内，以每分钟下降1℃的速度缓慢降温，使样品冻结到--35℃，达—35℃以下后，其冻结速度则不需控制。当瓶内的保护剂和菌丝块冻结后，

即可将安瓿瓶置于液氮冰箱里保藏。

使用时，取出安瓿瓶，立即置38～40℃的水浴中，使瓶内的冰块迅速融化；然后打开安瓿瓶，取出接种物，移至适宜的培养基上培养；同时应有防护措施，如套戴皮或棉手套等，防止液态氮气溅而冻伤皮肤。

五、天然基质保藏

天然基质的种类很多，下面介绍常见的几种保藏法。

1、麦粒种保藏法：用麦粒来保藏蘑菇和灵芝菌种，保藏期蘑菇达18个月，而灵芝可达5年之久仍有生活力。制作方法如下：选取无病虫害新鲜小麦，淘洗后在水温20℃下浸5小时，使麦粒含水量达25％为宜。将麦粒稍晾干后，装入试管长度的1/3。然后置于0.103兆帕（1.055千克/厘米2）高压灭菌40分钟后，趁热摇散，冷却接种。每管内接入菌丝悬浮液一滴，摇匀后置于25℃室内培养。当大多数麦粒出现菌丝时，移于干燥冷凉的地方保藏。

2、枝条种保藏法：采用树木枝条作为木腐型菇菌的保藏培养基。选取直径1～1.5厘米的阔叶树枝条,截成1.5～2.0厘米长，晒干备用。使用时将枝条在5％米糠水中浸泡12小时，吸足水分。拌好木屑培养基，按枝条与木屑培养基以3:1的体积比混匀；装入大试管或菌种瓶内，并在表面覆盖一薄层木屑培养基，压平；清洗管壁。按常规法进行灭菌接种、培养，待菌丝长好后，置于常温下或冰箱内保藏。

3、木屑种保藏法：配料按78％木屑、20％麸皮、1％蔗糖、1％石膏粉，加适量水拌匀；装入试管长度3/4，洗净管口，塞好棉塞；用牛皮纸包好管口，置于0.103兆帕（1.055千克/厘米）灭菌40分钟；接种后在25℃下恒温培养。待菌丝长到培养基2/3小时取出，用蜡将棉塞封好，包上塑料薄膜，放入4℃冰箱内，能保藏1～2年。使用时从冰箱取出后，置于25℃恒温箱内培养12～24小时。

4、发酵粪草种保藏法：草腐型菇菌以蘑菇发酵粪草料的保藏为例。选取蘑菇栽培用的发酵料，晒干后去除粪块；将料草切成2厘米长，在清水中浸4～5小时，让料草浸透水，并使之失去一部分养分，沥水控湿至含水量68％左右。将处理好的料草装入大试管中，松紧适当，过紧空隙小空气少，菌丝生长慢；过松则菌丝抗逆能力差，影响菌种生活力。装管后清洗管壁，加上棉塞，经0.103兆帕（10.55千克/厘米2）121℃高压力灭菌2小时，冷却后接种，置于25℃条件下培养，待菌丝长满管后，用石蜡将棉塞封闭，或更换无菌橡皮塞，置电冰箱内保藏。（草菇不耐温，不可置于冰箱内可藏）

六、真空干燥保藏采用低温、干燥和真空办法，使菌种的新陈代谢活动处于高度静止状态，也就是在极低温度下（-70℃左右）快速冷冻，然后在极低温度下真空干燥，使菌体细胞结构成分保持原来状态。因此，菌种保藏10～20年，仍不降低其原有性能。冷冻干燥是目前应用最广泛、效果较好的一种菌种保藏方法。具体操作方法：

1、安瓿瓶的准备：取中性玻璃安瓿瓶，规格内径8毫米、长度不小于100毫米的为好。先用2％盐酸浸泡12小时，再用清水洗涤3次，然后用蒸馏水洗净、烤干；瓶口加棉塞，灭菌后备用。

2、保护剂的选择：保护剂的作用是使细胞在冻干过程中免受损伤及减少在保藏过程中的死亡。保护剂种类很多，如牛马血清、无菌牛奶等，多数菌种保藏是脱脂牛奶。脱脂牛奶的制备方法是：先将牛奶放在阿诺氏灭菌器内加热30分钟，再置于冰箱内，待油脂上浮后用吸管吸取底层牛奶。然后经0.73兆帕压力灭菌15分钟备用。

3、冷冻干燥装置：一般条件好的实验室备有5PS快速真空离心冷冻干燥机。这个装置包括1台真空泵、1付麦氏真空计、1个缓冲瓶、1个真空干燥器（内装五氧化二磷或无水氯化钙等干燥剂）和1个冷冻槽（内盛有1:3的食盐和碎冰块）。

4、制备孢子液：按无菌操作法收集菇菌孢子，用接种针挑取孢子接入盛有2～3毫升无菌脱脂牛奶的试管中，稍加搅动即制成悬浮液。用吸管吸取悬浮液注入安瓿瓶。每管分装约0.2毫升，注意不要溅污上部管壁，防止杂菌污染和熔封时引起碳化。分装应在1小时内完成，装后棉花塞好管口。

5、预冻孢子液：在冷冻干燥之前，先将孢子液的安瓿瓶，置于低温冰箱中预冻1小时，其目的是防止抽气初期产生大量泡沫而外溢。也可将安瓿瓶置于1:1的干冰（固态二氧化碳）和95％乙醇或丙酮液中低温预冻。安瓿瓶放在上述冻结剂中，只需4～5分钟，温度便可达-70℃。

6、减压干燥：将预冻时附在这瓿瓶管上的冰水揩干，立即放入干燥器中抽真空。真空度用“麦氏真空计”测量，一般掌握在30分钟内能达到93.3帕时，菌种冻块才不致融化，继续抽气到真空26.6帕后，保持6～8小时即可。

7、真空熔封：菌种安瓿瓶经减压干燥后，应立即取出安装在封口用的玻璃抽气管上，进行抽气熔封管口。抽气管是一个多歧管，每个分支管口接有真空橡皮管，安瓿瓶口就插在橡皮管内。熔封须保持在真空状态下

抽气约10分钟即可达26.6帕。边抽气，边用煤气或酒精灯的细火焰，对准安瓿瓶中央，即可熔断封口。熔封时应注意火焰，不宜过大。

安瓿瓶菌种启用时，在无菌操作下打开这瓿瓶，加入0.3～0.5毫升的无菌生理盐水或1％麦芽汁即可使用。

由于真空干燥保藏的菌种是密封在安瓿瓶里的，因此不仅邮寄运输方便，并且不会污染杂菌。此法适于能形成孢子的菇类长期保藏，其设备和操作均较复杂。

七、液态氮超低温保藏将要保藏菌种的悬浮液或菌块，密封于盛有保护剂的安瓿瓶里，先在控制的条件下致冷，使之缓速预冻，再置于-150至-196℃液态氮超低温冰箱中保藏。其原理是：采用超低温手段，使菌体细胞代谢活动降低到最低水平，甚至处于休眠状态。它的优点是：保存时间可长达数年至数十年；适用范围广，对一些即使不耐低温菌种，如草菇等，也可在保护剂的保护下进行超低温保存；此外，经保藏的菌种基本上不发生变异。

培养基常用马铃薯汁1000毫，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，PH5.6。冷冻保护剂可用10％（V:V）的甘油蒸馏水或10％（V:V）的二甲亚砜蒸馏水。按无菌操作法收集孢子，制成孢子悬浮液。将上述培养基经灭菌后，趁热倒入无菌培养皿制成平板，在中心点接入欲保存的菌种，适温培养。

安瓿瓶的玻璃应能经受温度的突变而不破裂，并容易熔封管口。瓶的大小为75×10毫米，能容1.2毫升保护剂。每瓶装入0.8毫升的保护剂，加上棉塞，经0.096兆帕（0.984千克/厘米2）压力灭菌15分钟即可。若直接用无菌保护剂制备菌悬液，则可将安瓿瓶空管灭菌，然后按无菌操作法将菌悬液或菌丝片装入安瓿瓶内，经火焰熔封瓶口后，可用浸水法检查是否漏气。将封口的安瓿瓶放在慢速冷冻器内，以每分钟下降1℃的速度缓慢降温，使样品冻结到--35℃，达—35℃以下后，其冻结速度则不需控制。当瓶内的保护剂和菌丝块冻结后，即可将安瓿瓶置于液氮冰箱里保藏。

使用时，取出安瓿瓶，立即置38～40℃的水浴中，使瓶内的冰块迅速融化；然后打开安瓿瓶，取出接种物，移至适宜的培养基上培养；同时应有防护措施，如套戴皮或棉手套等，防止液态氮气溅而冻伤皮肤。

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第六节菌种保藏

一、概述

蘑菇菌种和其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性。遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌和发生虫害。能够长期在生产上和研究上应用。

微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达到最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制菌丝的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。

二、保藏方法

（一）斜面冰箱保藏法

这是蘑菇菌种的一种短期保存法，因为它简单易行，不需特殊设备，并能随时观察保藏菌种的情况，因此也是常用的菌种保藏方法。

１、保藏方法蘑菇菌种斜面冰箱保种一般使用PDA斜面培养基即可。菌种移接后，放在22-24℃温度下培养,要勤检查,当菌丝健壮地长满试管时,及时挑选无污染的培养斜面,棉塞用硫酸纸包扎后放置在4℃的冰箱中保藏。一般2-3个月转管一次。

２、注意事项：由于斜面冰箱保藏是在4℃下进行,微生物单孢分离物活动并未停止,需要经常转管移接,因此对于保藏所用的斜面菌种质量要求较高，其菌丝形态、菌落特征应保持原有特性，操作人员必须对斜面菌种质量应具有有一定的鉴别能力，所挑选的菌种才能适合保藏，其次菌种的菌龄不能太幼也不能太老，否则冰箱保藏后转管扩接易造成退化。再则冰箱温度应控制在2-4℃之间,尽量恒温使菌丝体处于稳定的生理状态。

（二）粪草管冰箱保藏法

１、保藏方法：粪草管的培养基是由腐熟麦秆粉100,腐熟牛粪粉25,麸皮8, 石膏粉1%,碳酸钙2%,含水量65%左右,pH7.5制备而成,调配后装入试管中,经高压灭菌后,接入菌种块,放在22-24℃温度下培养。要勤检查是否有污染，当菌丝健壮地长满草基试管时，及时挑选生长正常无污染的试管，棉塞头用硫酸纸包扎后放置在2-4 ℃的冰箱中,该保藏方法为中期保藏，一般2-3年转管一次。

２、注意事项：由于粪草管可保藏2-3年时间,因此如何防止粪草管的水分损失是该保藏方

法时间长短的关键所在,一方面培养基含水量不能低于62%, 另一方面棉塞用硫酸纸包扎后可加些蜡进行封口,防止水分蒸发。再则有条件应把试管保藏在具有保湿的冰柜或冰库中，温度控制在2-4℃,湿度控制在90%左右。

（三）液体石蜡保藏方法

液体石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，抑制菌丝的单孢分离物，可能使其处于休眠状态，推迟细胞衰老，延长菌丝的保藏，一般可保藏5-7年，是一种中长期的菌种保藏方法。

１、保藏方法：液蜡保藏蘑菇菌种的培养基为PDA斜面即可。将菌种块移接到PDA斜面上,在22-24℃下培养15-20天,然后用液体石蜡封藏保存。液体石蜡要选化学纯的，在121℃下高压灭菌30分钟,再将液体石蜡在160℃烘箱中加热1-2小时。亦可将高压灭菌后的液体石蜡放置在40-60℃温箱中,使灭菌后的液体石蜡层出现乳白色直至变成完全透明的无色为止,目的是将高压灭菌时侵入液体石蜡中的水蒸发干净。将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1.0厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，置室温中保藏。

２、注意事项：菌丝的培养时间不能太短，为防止菌丝体的进一步发育，可适当延长菌龄或让试管先置在冰箱中(2-4℃)2天后再加入液体石蜡。倒入的液体石蜡要超过斜面尖端1.0

厘米左右,如过低液体石蜡挥发后会露出斜面, 从而导致斜面培养基的干涸,缩短了保藏时间。烘烤液体石蜡应乇底，尽可能把水分蒸发干净，防止水蒸汽蒸发导致棉花塞潮湿长霉而影响菌种的保藏。

（四）滤纸保藏法

将蘑菇孢子吸附在滤纸条上，干燥后放入冰箱进行保藏，由于该保藏是有性的孢子，一般不用于生产中，主要是起到保藏种质资源的作用及菌种的选育，根据福建省蘑菇菌种研究推广站的滤纸孢子保藏试验，用该方法已保藏蘑菇菌种达10年以上,孢子成活率约为50-80%之间。

１、保藏方法：孢子收集方法同单孢子分离的孢子收集，当滤纸条上收到有相当数量孢子后，用无菌镊子将滤纸条无菌操作放入无菌试管中，将该试管放在抽真空的干燥器中1-2天,除去滤纸条上水分使之充分干燥,随后把试管口封好,粘好标签, 放在冰箱中保藏。

（五）真空冷冻干燥保藏法

真空冷冻干燥简称冻干。这种方法是利用低温使孢子先冷冻，然后再在真空条件下，使孢子中的水分升华排出，孢子处于休眠状态，但仍保持原有活力，是一种长期保藏蘑菇孢子的保藏方法，具体操作如下。

（１）选用内径8mm,长120mm的中性玻璃管作为制安瓿管的材料。将玻管用2% 盐酸浸泡

8-10小时,再用蒸馏水洗2-3次后,置烘箱中烘干。将印有菌号、编号、制作日期的标签放入安瓿管中，塞好棉塞，进行干热灭菌。

（２）用接种铲将收集的蘑菇孢子铲入盛有3ml无菌脱脂牛奶的试管中,稍加摇动, 制成孢子悬浮液。用无菌吸管将孢子悬浮液移入安瓿管的球形部分，每管约0.2ml,然后将管口通过火焰,用无菌镊子取少许无菌棉花塞于安瓿管口。

（３）将安瓿管放入无水乙醇与干冰混合的冻装置，温度可达-65～-70℃预冻5 分钟左右,也可在低温冰箱(-40)预冻30-60分钟。然后取出放入真空干燥器中，用高真空活塞油封好立即抽真空，并随时用真空火花检漏仪检查真空度，发现有微小漏气处，要迅速用真空泥涂住。一般真空度应维持在10.7千帕以下,如抽真空10 分钟后仍达不到此真空度,说明真空系统不佳,可能会造成融化而失败。真空干燥器外面用1:3的盐冰水保温,其效果会好些,真空度稳定,一般抽7-8小时,可完全将安瓿瓶中水升华至干。此时应关闭缓冲瓶前的三道阀门，然后再断电。抽干后的安瓿瓶颜色应是白色，如果浅黄色或不成凹状，多数都因为真空度达不到要求而造成融化失败的结果。

（４）冻干好的安瓿瓶要进行真空熔封。可用一个顶端多歧管或一个Ｚ型管，每个分支口都接入真空橡皮管以便将安瓿管接在橡皮管内，然后抽真空，边抽真空边用煤气喷灯熔封。熔封的安瓿瓶要进行检漏，可用高真空火花检漏仪检查。安瓿瓶内呈蓝色荧光，说明真空封口良好，也可用微带红或蓝的清水浸泡安瓿瓶，经一昼夜安瓿瓶内无颜色水浸入，则为封口合格。

（５）菌种安瓿瓶经无菌检查和存活率检查合格后，置2-8℃冰箱内保藏,一般蘑菇菌种可保藏8-10年。

（６）复苏培养时，可在开启的安瓿管内注入0.3-0.5ml的无菌生理盐水或1% 麦芽汁。菌种安瓿瓶开启时，应先将安瓿瓶的封端加热，在浸有来苏尔等消毒液的湿布上擦一下，使管壁形成裂缝，然后再轻轻敲碎。切忌猛烈割断，以免空气骤然冲入，导致污染。安瓿瓶加入生理盐水后菌种即自行溶化，摇动后即成孢子悬浮液，可接入PDA培养基上,进行萌发培养。（六）液氮超低温保藏法

液氮超低温保种是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓿瓶内，将该安瓿瓶放入液氮

(-196℃)中进行保藏,由于菌丝体处于-196℃,其代谢降低到完全停止的状态。所以不需定期移植。从理论上讲，菌丝体可以无限期地存活。蘑菇菌种的液氮保种从1970年开始进行试验,至今已有20多年的历史,经过大量的试验证明液氮保种是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。随着方法的不断改良，现人介绍近年来应用的一种最简便的液氮保种方法。

（１）菌种制备菌种在PDA培养基平板上于22-24℃下培养10-15天,菌丝体充分生长后,用打孔器(直径2-4mm)打成小孔,或用接种针把菌丝培养物切成2×4mm 长方形小块。

（２）安瓿管的制备把直径4-6mm 的聚乙烯塑料管（也可用饮料吸管）截成小段做成安瓿管。每节大约60mm长,一头用热合机封好。然后用牛皮纸包装进行121℃下高压灭菌30分钟。

（３）保护剂10%的甘油水溶液进行121℃下高压灭菌30分钟可作为冷冻保护剂。用量为每安瓿上留有5-10mm的空间,用无菌注射器从管底注入,以防产生气泡。随后，且无菌接种针从安瓿管口放入5-8块菌种块，热合封好安瓿。用记号笔在发瓿管外写上标签，最后在桌上用一定的力按压，以检查安瓿是否渗漏。

（４）液氮保藏把已做好的安瓿菌种管放入具有孔洞的小塑料瓶中（在塑料瓶的底部放一块铁片，使塑料瓶连同安瓿管能一起沉入液氮罐中），盖好瓶盖，在瓶盖上连接一条细绳并作记号，以便提出所需的菌种。把装有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管缓慢地降温，大约30分钟后,把按瓿管浸入液氮中进行长期保存。

（５）恢复培养如果拟取用液氮保存的菌种，可将安瓿管取出后立即放入35-40℃的温水中迅速解冻,为了防止污染,用75%酒精洗安瓿管表面,表面干燥后, 用火焰烧过的剪刀在安瓿的一端剪开,用无菌接种针把菌块移接至PDA培养基上,置22-24℃培养。

微生物的诱变育种

微生物的诱变育种 作者：佚名来源：生物秀时间：2008-4-18 实验仪器大全实验试剂大全 一、实验目的和内容 目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。 内容：1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。 2．用紫外线进行诱变处理。 3．用平板透明圈法进行两次初筛。 4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。 二、实验材料和用具 米曲霉斜面菌种； 豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白； 三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。 三、操作步骤 (一)出发菌株的选择及菌悬液制备 1．出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。2. 菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备用。 (二)诱变处理 用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。 1．紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。 2．稀释菌悬液按10 倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。 (三)优良菌株的筛选 1. 初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50 个，作为复筛菌株。 2．平板复筛分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8 等份，1～7 份中点种初筛菌株，第8 份点种原始菌株，作为对照。培养48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大摇瓶复筛阶段。3．摇瓶复筛将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦秩85g，

菌种保存方法

菌种保藏方法 中国工业微生物菌种保藏管理中心 微生物菌种保藏对于微生物菌种的研究和利用至关重要。以下是中国工业微生物菌种保藏管理中心整理的目前国际国内常用的菌种保藏方法，包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法，各种菌种保藏方法都有详细的步骤说明。 定期移植法 亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断

搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。 2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。2.1.4 密波状蜿蜒划线法

菌种保藏大全

菌种保藏 一、菌种的含义： 菌种：菌种是指食用菌、工业菌、农用菌菌丝及其生长基质组成的繁殖材料。分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级，也可以理解为保存着的、具有活性的菌株。 微生物工业对菌种的要求 1.原料廉价，生长迅速、目标产物高。 2.易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短。 3.抗杂菌和噬菌体的能力强。 4.菌种遗传性能稳定，不易变化和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。 5.对放大设备的适应强。 二、菌种保藏的重要意义： 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产，如抗生素、氨基酸、酿造等工业，都离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。 其任务首先是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来，而不致向坏的方面转化。 菌种是一种极其重要和珍贵的生物资源，1980年我国成立了中国微生物菌种保藏委员会。 菌种保藏的原理与方法 微生物菌种保藏的概念：收集实验室和生产用微生物（菌种、菌株、病毒毒株等，也包括动、植物的细胞株和微生物质粒），运用适当方法和措施使其长期存活并保持原种的生物学性状稳定不变，使之不死、不衰、不乱，以达到便于研究、交换和使用等目的的措施。 微生物个体微小、代谢活跃、生长繁殖快，很容易发生变异，或被其他微生物污染，甚至死亡。因此根据实际情况选择合适的保藏方法十分重要。 一、菌种保藏的原理： 菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创条件使其生长代谢处于最低或几乎停止的状态，以减少其变异和保持生物性状。 保藏时，一般利用菌种的休眠体（孢子、芽孢等），创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，以降低菌种的代谢活动，减少菌种变异，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力，达到长期保存的目的。 一个好的菌种保藏方法，应能保持原菌种的优良特性和较高的存活率，同时也应考虑到方法本身的经济、简便。 国内外主要菌种保藏机构介绍 国外 （1）ATCC 美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市. （2）CSH 冷泉港研究室，美国. （3）IFO 日本大阪发酵研究所，日本大阪. （4）NRRL 美国北部地区研究实验会

实验12-微生物菌种常用简易保藏法

实验15 微生物菌种保藏方法 一、实验原理 为了保持微生物菌种原有的各种优良特征及活力，使其存活，和丢失，不污染，不发生变异。根据微生物自身的生物学特点，通过人为的创造条件，使微生物处于低温、干燥、缺氧的环境中，以使微生物的生长受到抑制，新陈代谢作用限制在最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保藏的目的。 常用简易保藏法包括常规转接斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物保藏法及沙土管保藏法等。由于这些保藏方法不需要特殊实验设备，操作简便易行，故为一般实验室及生产单位所广泛采用。 常规转接斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上已生长好的培养物置于4-5℃冰箱中保藏，并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 液体石蜡保藏法是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层已灭菌的液体石蜡，再置于4-5℃冰箱中保藏。液体石蜡主要起隔绝空气的作用，使外界空气不与培养物直接接触，从而降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少培养基水分的蒸发。故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长，从而延长保藏时间。 含甘油培养物保藏法是在液体的新鲜培养物中加入15%已灭菌的甘油，然后再置于-20或-70℃冰箱内保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，而且，在-20或-70℃条件下，可大降低细胞代谢水平，但却仍能维持生命活动状态，达到延长保藏时间的目的。 沙土管保藏法，将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上，经培养后，制后孢子悬浮液，无菌操作将孢子悬浮液滴入已灭菌的沙土管中，孢子即吸附在沙土上，将沙土管置于真空干燥器中，通过抽真空达到吸干沙土管中水分，然后将干燥器置于4℃冰箱中保存。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 二、操作步骤 (一) 斜面传代保藏法 l．贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。 2．斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。 3．培养细菌37℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。

微生物学复习资料整理汇总

一、解释下列名词 1．伴胞晶体：少数芽孢杆菌在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁边形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体——δ内毒素,称为伴胞晶体（59） 2．菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，成为菌落。 3．选择培养基：用来将某种或某种微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，一直不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。（91） 4．革兰氏阳性菌：在革兰氏染色法里，通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞膜内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物。革兰氏阳性菌由于其细胞壁厚度大和肽聚糖网层次多和交联致密，故遇乙醇或丙酮酸脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，在加上它不含类脂，故乙醇处理不会溶出缝隙，因此能吧结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色。（49）革兰氏阳性菌细胞壁特点是厚度大、化学组分简单，一般只含90%肽聚糖和10%磷壁酸，从而与层次多、厚度地、成分复杂的革兰氏阴性菌的细胞壁有明显的差别。革兰氏阴性菌因含有LPS外膜，故比革兰氏阳性菌更能抵抗毒物和抗生素对其毒害。（40） 5．LPS:脂多糖，位于革兰氏阴性菌细胞壁最外层的一层较厚的类脂多糖类物质，由类脂、可信多糖和O-特异侧脸三部分组成。（43） 6．营养缺陷型：某些菌株发生突变（自然突变或人工诱变）后，失去合成某种（或某些）对该菌株生长必不可少的物质（通常是生长因子如氨基酸、维生素）的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株成为营养缺陷性（85）(218) 7．氨基酸异养型生物：不能合成某些必须的氨基酸，必须从外源提供这些氨基酸才能成长，动物和部分异养微生物为氨基酸异养型生物。如乳酸细菌需要谷氨酸、天门冬氨酸、半胱氨酸、组氨酸、亮氨酸和脯氨酸等外源氨基酸才能生长。（baidu) （氨基酸自养型：能以无机氮为唯一氮源，合成氨基酸，进而转化为蛋白质及其他含氮有机物。 8．芽孢：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或团圆性、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体（55） 9．鉴别培养基：用于鉴别微生物。在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种带些产物，而这种带些产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可讲该种微生物与其他微生物区分开来（91） 10．PHB：聚-B-羟丁酸，直径为0.2~0.7um的小颗粒，是存在于许多细菌细胞质内属于类脂兴致的碳源类贮藏无。不溶于水，可溶于氯仿，可用尼罗蓝或苏丹黑染色。具有贮藏能量、碳源和降低细胞内渗透压的作用。（53） 11．糖被：包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质。（60）

菌种保藏的主要方法

菌种保藏 （一）、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。 （二）、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。 （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。 由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发，使培养物不会干裂，因而能使保藏期达1～2年，或更长。这种方法操作简单，它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好，可保存几年，甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。 3、砂土管保藏法

菌种保存方法-

菌种保存方法： 一.菌种保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。常用的有甘油菌保存： 取灭过菌的1.5ml EP管，按照60%—80%甘油的加入量，保存零下80度。例：取37°培养过夜的菌液2-4ml甘油6-8ml，充分混匀后分装于1.5ml EP管中，置于-80°冰箱即可。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。二.常用的器材 所要保存的微生物； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 三.各操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、

微生物研究技术与方法 重点大全要点

第一章绪论 课程主要内容： 1、微生物学研究技术发展 2、微生物材料的准备 3、微生物研究中的物理化学方法基础 4、微生物的观察与微生物分析法 5、细胞破碎方法及亚细胞物质分离 6、微生物育种技术 7、固相化技术与生物传感器 8、免疫学技术 9、微生物学研究的分子生物学技术 微生物学研究技术发展： 微生物学是整个生物学中第一门具有一套自己独特操作技术的学科，其技术的发展主要包括： 1、显微镜术和制片染色技术 2、消毒灭菌技术和无菌操作技术 3、纯种分离和克隆化技术 4、合成培养基技术；选择性和鉴别性培养技术 5、突变型标记和筛选技术；深层液体培养技术 6、菌种保藏技术 7、原生质体制备和融合技术 8、各种DNA重组技术等 第二章微生物材料的准备 第一节灭菌、消毒、除菌与无菌操作 掌握知识要点： 原理、方法、生物活性物质的除菌 无菌操作：意识、个人卫生、环境卫生、灭菌、接种等操作、保存 一、几个基本概念 控制害菌的措施： 1）杀灭法： ○1灭菌：彻底杀灭（杀菌、溶菌）——一切微生物 ○2消毒：部分杀灭——仅杀灭病原菌 2）抑制法： ○1防腐：抑制霉腐微生物 ○2化疗：抑制宿主体内的病原菌 1、灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的 措施。例如：高温灭菌、辐射灭菌等。 2、消毒：消除毒害，即传染源、致病菌。一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或 内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。例如：

常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法 对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法 1）巴氏消毒法（pasteurization） 2）煮沸消毒法 采用在100℃下煮沸数分钟的方法，一般用于饮用水的消毒。 3、防腐：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过抑菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。 防腐的方法： ①低温：利用4℃以下的各种低温（0，－20，－70，－196℃）保藏食物、生化试剂、 生物制品或菌种等。 ②缺氧：可采用抽真空、充氮或二氧化碳、加入除氧剂等方法来有效防止食品和粮食 等的霉腐、变质而达到保鲜的目的。 除氧剂的种类很多，是由主要原料铁粉再加上一定量的辅料和填充剂制成，对糕点等含水量较高的新鲜食品有良好的保鲜功能。 ③干燥：采用晒干、烘干或红外线干燥等方法对粮食、食品等进行干燥保藏，是最常 见的防止霉腐的方法； 在密封条件下，用生石灰、无水氯化钙、无氧化二磷、氢氧化钾（或钠）或硅胶等作为吸湿剂，也可很好的达到食品、药品和器材等长期防霉腐的目的。 ④高渗：通过盐腌和糖渍等高渗措施来保存食物，是在民间早就流传的有效防霉腐的 方法。 ⑤高酸度：在我国和韩国等具有悠久历史的泡菜，就是利用乳酸菌的厌氧发酵使新鲜 蔬菜产生大量乳酸，借这种高酸度而达到抑制杂菌和防霉腐的目的。 ⑥高醇度：用白酒或黄酒保存食品，在我国有悠久传统，如：醉蟹、醉麸、醉笋和黄 泥螺等产品，都是特色风味食品。 ⑦加防腐剂：在有些食品、调味品、饮料、果汁或工业器材中，可加入适量的防腐剂 或防霉剂来达到防霉腐的目的，如： 用苯甲酸来使酱油防腐； 用尼泊金作墨汁防腐剂； 用山梨酸、脱氢醋酸作化妆品防腐剂； 用二甲基延胡索酸（DMF）作食品、饲料的防腐剂。 4、化疗——化学治疗 利用具有高度选择毒力即对病原菌具高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。 用于化学治疗目的的化学物质称化学治疗剂，包括磺胺类等化学合成药物、抗生素、生物药物素和若干中草药中有效成分等。 要点： 1.灭菌：利用物理、化学方法杀死物体表面、内部全部的微生物。 2.消毒：杀死物体表面或内部有害微生物或使其钝化，使致病微生物不致病。 3.除菌：利用物理方法除去物体表面的微生物。

微生物一些大题汇总

第二章：名词解释 1、菌落：是指由单个或少数微生物细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成以母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。 2、温和噬菌体：噬菌体侵入宿主细胞后，噬菌体的DNA只整合在宿主的核染色体上，并可长期随宿主DNA的复制而进行同步复制，一般情况下不进行增殖，不引起宿主细胞裂解的噬菌体，称温和噬菌体或溶源噬菌体。 3、L-型细菌：由于无细胞壁故细胞呈多种形态，革兰氏染色阴性，大小为0.05～50μm不等，相差悬殊，有的可以通过细菌滤器，故又称“滤过型菌” 4、菌丝体：菌丝在基质中或培养基上蔓延伸展，反复分枝网状成菌丝群，通称菌丝体。 5、病毒：病毒是一种个体微小，结构简单，只含一种核酸（DNA或RNA），必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。 6、芽孢：某些细菌（芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，少数球菌等）在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形，厚壁，含水量低，抗逆性强的休眠体构造，称为芽孢。 六、简答题。 1、简诉革兰氏染色的过程和机理 过程：革兰染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难区别。经染色后，阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以分类鉴定。 染色原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细菌细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，再用95%乙醇脱色。 2、细菌芽孢有何重要的实践性？ ．1、分类鉴定不同细菌的芽孢具有不同的特点，从形状、大小、表面特征，直到与菌体的关系等都有不同的表现，因此可以作为分类鉴定的依据或参考。 2．科研材料由于芽孢独特的产生方式，成为研究形态发生和遗传控制的好材料。 3．保存菌种芽孢对不良环境有很强的抵抗力，可以保持生命力达数十年之久，在自然界使细菌度过恶劣的环境，在实验室是保存菌种的好材料。 4．分离菌种芽孢的耐热性有助于芽孢细菌的分离。将含菌悬浮液进行热处理，杀死所有营养细胞，可以筛选出形成芽孢的细菌种类。 5．生物杀虫有些芽孢细菌在产生芽孢的同时，可以产生一种双锥形的结晶内含物，称为伴孢晶体，这是一种蛋白质毒素，可以杀死某些昆虫（特别是鳞翅目）的幼虫。蛋白质晶体的毒性是有高度专性的，对其他动物与植物完全没有毒性。因此，它们便成为一种理想的生物杀虫剂，这种杀虫剂的生产，并不需将蛋白质分离出来，只需培养大量细菌，在其形成芽孢并产生晶体时收获、干燥，做成粉剂即可。 3、简诉细菌细胞膜的结构和生理功能。 细胞膜又称质膜（plasmalemma），是位于原生质体外围、紧贴细胞壁的膜结构，作用是保护内部。组成质膜的主要物质是蛋白质和脂类，以及少量的多 糖、微量的核酸、金属离子和水。生理功能细胞膜有重要的生理功能，它既使细胞维持稳定代谢的胞内环境，又能调节和选择物质进出细胞。细胞膜通过胞饮作用（pinocytosis）、吞噬作用（phagocytosis）或胞吐作用（exocytosis）吸收、消化和外排细胞膜外、内的物质。在细胞识别、信号传递、纤维素合成和微纤丝的组装等方面，质膜也发挥重要作用。有些细胞间的信息交流并不是靠细胞膜上的受体来实现的，比如某些细胞分泌的甾醇类物质，这些物质可以作为信号，与其他细胞进行信息交流，但是这些物质并不是

常用菌种保藏方法

微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 素而设计的。 一、保藏方法大致可分为以下几种： 1、传代培养保藏法 2、液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3、载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4、寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5、冷冻保藏法 6、冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 二、器材: 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 三、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保

生物工程专业实验讲义汇总

生物工程专业实验讲义(适用于生物工程专业) 袁丽红曹飞 制药与生命科学学院 二零零四年四月

目录 实验一发酵种子的制备 (1) 实验二 E.coli细胞发酵培养 (2) 实验三高速冷冻离心机的使用方法 (3) 实验四固定化生物催化剂的制备 (4) 实验五游离细胞与固定化细胞酶活比较 (5) 实验六固定化生物催化剂的连续生产 (6) 实验七Ｌ－Asp的分离 (7) 实验八离子交换树脂的预处理及交换容量的测定 (8)

实验一发酵种子的制备 一、目的要求 1．了解实验室种子制备过程。 2．掌握实验室不同菌种种子生产方法。 二、原理 实验室种子制备过程包括琼脂斜面、固体培养基扩大培养或摇瓶液体培养。 不同菌种其具体制备方法不同，其过程如下图： 种子扩大培养过程 三、试验及器材 1．菌种：斜面低温保藏的大肠杆菌（E.coli） 2．培养基：牛肉膏0.5% NaCl 0.5% 蛋白胨1% PH 7.6~7.8 若配固体培养基，在其中加2%琼脂。 3．器材：天平、灭菌锅、试管、三角瓶（500mL） 四、操作方法 1．按培养基配方配制100mL固体培养基，分装于试管中。 压力1Kg/cm2灭菌30mins，结束后取出、趁热制成斜面。 2．按培养基配方配制1000mL液体培养基，分装于三角瓶中，每瓶100mL，压力1Kg/cm2灭菌30mins，结束后取出。 3．挑一环斜面低温保藏的E.coli接于液体培养基中，37℃培养24hs。 4．挑斜面长好的E.coli约2环接入液体培养基中，37℃振荡培养24hs，转速约150rpm。 五、思考与讨论 实验室种子制备的原则是什么？

菌种保藏的方法

菌种保藏的方法 菌种是国家重要的生物资源，鉴于其自身的遗传性和变异性，在菌种保藏过程中，如何降低菌种的衰亡速度，防止杂菌污染，保持菌种遗传性状不变异，使优良高产菌株长期在生产中应用，成为食用菌领域一项重要的课题。为适应群众性生产的需要，为适应群众性生产的需要，本文介绍了几种简单易行、实用效果好的菌种保藏方法。 一、菌种保藏基本原理 通过低温、干燥、缺氧和饥饿等手段来达到最大限度降低菌丝体的生理代谢。首先要挑选优良纯菌种，包括菌丝体和它们的孢子；其次，根据其生理、生化特点，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状，防止变异。 二、菌种保藏的方法 试管斜面菌种系列保存方法 1低温定期移植保藏法 将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3~5℃低温干燥处或4℃冰箱中保藏，每隔3~6个月移植转管1次，具体应根据菌种特性决定。保藏时要注意环境湿度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。因此，若用棉塞，可用干净的塑料薄膜或牛皮纸包扎棉塞，也可用无菌的白胶塞，并用石蜡涂封，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。除草菇外，大多食用菌菌种都能采用此法保藏。 2液体石蜡保藏法

取化学纯液体石蜡装于三角瓶中高压灭菌后，放入40℃恒温箱中，蒸发其中水分，至石蜡油完全透明为止。将处理好的石蜡油移接在空白斜面上，28～30℃下培养2～3d，证明无杂菌生长方可使用。然后将母种接在斜面培养基上，当菌丝在斜面上生长丰满后，将液体石蜡注在斜面上，注入量以高出斜面1cm为宜，使菌种与空气隔绝，降低其新陈代谢能力。管口用灭过菌的白胶塞塞紧，并用石蜡涂封，直立放在室内干燥处或冰箱内保藏。一般可保存1年以上，在低温下保藏时间还可延长。使用时从斜面上挑取菌丝少许，移接到新鲜斜面培养基上，经培养即可。由于菌丝体沾有液体石蜡而影响其生长，需再经1次移接才能恢复正常生长。 3白胶塞封口保存法 选择与试管口径相符的白胶塞，用%煤酚皂溶液洗涤，浸泡在酒精内待用。当试管斜面长满菌丝后，在无菌条件下拔去棉塞，取浸泡的白胶塞1个，通过火焰迅速塞入试管口内，并用石蜡熔封。此法能达到与石蜡油封存相似的效果。用该法保存菌种可存活1～3年，但以每年移植1次为好。 4蒸馏水保藏法 将8成熟试管菌种放在接种箱内，注入蒸馏水，将培养基斜面全部淹没至管口2cm。管口用白胶塞塞紧，并用石蜡涂封，常温下置于阴凉处立放，可以保藏1年左右。 非斜面固体菌种系列保存法 1麦麸保藏法 将麦麸和水按∶1充分拌匀后，装入试管高压灭菌，经无菌检查合格后接种，适温下培养至菌丝体发育好后，将试管放入真空干燥器内，用真空泵将麦麸培养基内水分抽干，然后移入盛有硅胶的干燥器内，用凡士林密封在常温下保存，可保藏3～5年。

微生物菌种保藏方法

微生物菌种保藏方法 1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。 传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。 一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。 传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。 2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。 3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如： ①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。

几种菌种的保存及复苏方法(材料特制)

几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法） 定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2 接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。 2.1.4 密波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。 2.1.5 挖块接种法 挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。

蘑菇工厂化管理大全

蘑菇工厂化管理大全 Prepared on 22 November 2020

金针菇 工厂标准化生产 绿色农产品标准化生产技术 标准生产操作，轻松管理工厂 2014-3-22 前言 金针菇营养丰富，质地脆嫩，可烹调、凉拌、煲汤，更是吃火锅不可缺的一道菜。同时金针菇富含金针菇多糖等生物活性成分，以及赖 氨酸、精氨酸和亮氨酸等儿童发育必需的氨工酸，能 促进儿童生长及健康发育；而且金针菇具有抗癌的功 效，因其含有搞肿瘤活性多糖；在日本长野县种植金 针菇地区，连续栽培金针菇10年以上农户，癌症发病 率是其它地区的1/6。 金针菇在广东、四川、重庆及其它地区，主要消费者是吃火锅客户，还有因为其为儿童增智菇，还有广阔的市场前景可挖。所以其市场潜力巨大，加上生产成本较低，技术门坎不高，所以是投资的一个较理想的项目。 在广东地区目前工厂化生产厂家就有23家，其中以上海雪榕、广东菇木真、绿阳等有名的厂家，还有新兴的品质较优的：绿和；在广东地区的市场已经基本饱和，现状的竞争已经进入白热化阶段，在2013年1月寒冷的天气中，最好品质的绿和园山仔售价才达到：180元/件，所以说在广东市场中现在拼的是：品质、实力！谁能笑到最后，就要看其在经营上的策略及管理上的成本。

而在重庆/四川地区，目前白色金针菇只有上海雪榕（成都都江堰）一家有实力的工厂，其它的基本为小农户或小型工厂生产的黄色金针菇，售价及品质都不及白色金针菇的2/3；而上海雪榕采用的是主玉米芯生产，其单产高，但品质色泽并不佳；所以在重庆市场投放现在绿和公司的产品是极具竞争及发展力的。 而需要打入重庆市场的确需要较大的努力。 首先是：技术方面――在技术方面因绿和公司还不具备标准化生产体系，所有的管理只是完全依靠人员的经验，其产生的问题就是无可复制性（这是广东各农业生产企业普遍的问题，当扩大后会出现质量失控的情况）；在投入重庆市场已经成为一个瓶颈，所以需要加大标准化管理进程； 第二是：资金方面――投入重庆市场所需要的资金虽然并是巨大，但也是一种风险性投资，如果投资6吨产能的工厂，投资厂房及设备方面需要约450－600万元（含流动），而日产值约为6万元（30%利益约合），需要一年左右收回投资成本。但资金投资从何而来 第三：市场方面――目前重庆市场在冬季为农户生产投入时期，市场容量大部分被农户及小工厂化的黄色金针菇为主导，但白色金针菇还是有市场，且不饱和，所以投入是有市场的，只是品质需要较高。 第四：厂房方面――重庆没有定制厂房，需要自己建设，有利也有弊；有利的一方面可以按照最优化的方式建设，且租金方面会有优势，有弊的方面是资金投入加大。 第五：政府方面――在投入前后，与当地政府方面的关系成为一个阻碍发展的重要因素，处理得好可以顺风顺水，并得到部分资金扶持；处理不好会有重重阻碍，产生发展的一重大阻碍。所以利用好政府政策是一个关键的节点。 综上所述：现状最大问题是：标准化生产技术、政府关系节点。

酒类的保藏1

酒类的保藏 关键词：酒类保藏白酒啤酒黄酒果酒葡萄酒药酒 酒是人们生活中一种不可或缺的饮品，不仅仅是因为它特殊的食用价值，它给人们带来的感官上的愉悦感也是人们重视它的一个主要因素。很多人对酒类的保藏确有一定的误区，认为酒是越陈越香，这固然有一定的道理，但是仍然很片面。本文分别从白酒、啤酒、黄酒、果酒、葡萄酒、药酒六种酒为代表叙述的酒类的概述、生产工艺、保藏的技术和方法。 1、白酒 1.1白酒的概述 白酒又称白干。它是以粮谷等为原料，以酒曲/活性干酵母，糖化酶等为糖化发酵剂，经蒸煮，糖化发酵，蒸馏，贮存，勾兑而制成的蒸馏酒。白酒是我国传统的蒸馏酒，与白兰地，威士忌，伏特加，兰姆酒。金酒并列为世界六大蒸馏酒。 关于酒的起源，说法很多，以我国为例，有“仪狄造酒”，“杜康造酒”等说法，于是我国酿酒的起源限定于5000年左右的历史。水果是古人类的主要食物之一，采集的水果没有吃完，很容易被野生酵母发酵成酒，这是最大可能的酒的起源。 白酒按生产方式可分为固态白酒，半固态白酒，液态白酒，其中固态白酒这我国大多数名优酒的传统生产方式，半固态白酒为小曲白酒的传统生产方式之一。按糖化发酵剂可分为大曲白酒，小曲白酒，麸曲白酒。按白酒香型可分为浓香型白酒，以泸州老窖为代表，其他代表有五粮液，洋河大曲，剑南春酒等。酱香型白酒，以茅台酒为代表，其他代表有朗酒，武陵酒等。清香型白酒，以汾酒为代表，此外还有黄鹤楼酒，宝丰酒等。米香型酒，以桂林三花酒为代表。凤香型白酒，以西凤酒为氏表。 白酒的原料多种多样，谷物有高粱，玉米，大米等，薯类有马铃薯，木薯等，同时豆类，糖蜜也能做为原料。白酒用的水要求比较严格，通常采用沙滤，煮沸，活性炭吸附等处理来净化水。 1.2白酒生产工艺 白酒的生产要经过原料浸润与蒸煮，糖化与发酵。这其间会发生淀粉的糊化，液化，老化，自糖化以及糖的美拉德反应，最后会有风味物质的形成。白酒中的风味物质有酸，醇，醛，芳香族化合物等几大类物质。酸一般为有机酸，大部分由细菌生成，包括乳酸，琥珀酸等。醇包括正丙醣，活性戊醇等。 白酒的蒸馏方法分为固态发酵蒸馏法，这是传统的白酒蒸馏方法，不仅要蒸出酒精，还要把香味物质蒸出来。液态蒸馏方法，传统的白兰地采用此法，还有固液串香蒸馏法。 1.3白酒的保藏 白酒的保存是很讲究的，保存好的话，酒就会越放越香，在白酒保存的过程中，要讲究温度，湿度还有密封度，还要注意装酒的容器，只有这些情况都合适的情况下，酒才会越陈越香。但是白酒并不是可以无限制的保存下去的，必须在一定的时间内，那样酒类

菌种保存和微生物常识

菌种保存和微生物常识 1、常用培养基的制备、灭菌与消毒 营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。 营养物：具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。 营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水 培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。 2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程 原则：目的明确、营养协调、经济节约 物理化学条件适宜 方法：生态模拟、查阅文献 精心设计、试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、 加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查 培养基种类： 一、按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 二、按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 三、按培养基用途 基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基 消毒与灭菌： 消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。

方法： 一、物理的方法：加热、过滤、辐射 二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。 加热法： （1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在<180°； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70°时才开箱门。 （2）湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。 高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。 4、注意事项： 1）冷空气彻底排除；2）加水；3）压力降为“0”时方可打开。 常压蒸汽灭菌：对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基，含糖培养基等可采用此法。彻底灭菌则采用间歇灭菌方法。 煮沸灭菌法：适用注射器和解剖器皿，时间10－15min， 超高温杀菌:135-150°C和2-8s对牛乳和其它液态食品。优点：保持食品价值和营养