文档库 最新最全的文档下载
当前位置:文档库 › 分子生物学实验 (1)

分子生物学实验 (1)

分子生物学实验 (1)
分子生物学实验 (1)

实验一感受态细胞制备(4学时)

一、实验目的:通过本实验,掌握大肠杆菌感受态细胞制备的方法和技术。

二、实验原理:细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态。其原理是细菌处于0℃、CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。

三、仪器、材料和试剂

(一)仪器:

1.超净工作台

2.离心机

3.恒温摇床

4.高压灭菌锅

5.移液枪

6.振荡器

7.天平8.恒温水浴9.离心管10.锥形瓶

(二)材料:大肠杆菌DH5α

(三)试剂:1. 0.1mol/l CaCl2溶液 2. LB液体培养基 3.70%酒精

四、实验步骤

1.从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于3ml LB液体培养基的试管中,37℃震荡培养过夜。

2.取1 ml菌夜转接到一个含有50ml LB液体培养基的锥形瓶中,37℃震荡培养2-3h(此时,A600应在0.4-0.5之间,细胞数务必﹤108/ml,此为实验成功的关键)。

3.用移液枪取2ml菌液转移到离心管中,冰上放置10min。(1000μl的枪,蓝色枪头,旋转不要太快,不能超过量程,每组至少做6管)

4.离心10min(4000r/min)。(离心机,严禁空转和不平衡,使用之前用太平平衡,对称放。上离心机之前,用卫生纸擦离心管。不要贴标签。用记号笔标记就可以。盖紧离心管口。盖好离心机内盖)

5.倒出培养液,将管倒置1min,以使培养液流尽。(在超净工作台中操作)

6.用冰冷的0.1mol/l CaCl2200μl悬浮沉淀(用振荡器),立即放在冰上保温30min。(200μl的枪,黄色枪头)

7.低温离心10min(4000r/min),回收细胞。

8.用冰冷的0.1mol/l CaCl2 200μl悬浮细胞(用振荡器)。

9.分装细胞,毎200ul一份,此细胞为感受态细胞。

五、实验结果:

有白色细胞细胞沉淀出现,该白色沉淀即为大肠杆菌感受态细胞。

六、分析讨论:

1.为什么实验步骤中A600应在0.4-0.5之间,细胞数务必﹤108/ml?

2.步骤6和8中都加入了CaCl2目的一样吗?它们的作用分别是什么?

3.本实验的注意事项有哪些?

实验二阳性克隆的筛选与鉴定、质粒DNA的提取(5学时)一、实验目的:通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术和克隆载体的筛选与鉴定方法。

二、实验原理:

1、蓝白斑筛选原理

2、碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。

三、仪器、材料、试剂

(一)仪器:1、恒温摇床2、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器

(二)材料:1、含PUC-18质粒的大肠杆菌2、乙二胺四乙酸(EDTA)

3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚11、氯仿12、异戊醇13、乙醇1

4、胰RNA酶1

5、羧苄青霉素

16、离心管

(三)试剂:1、溶液? (pH8.0) 2、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液(pH8.0)

5、0.5mol/LEDTA

6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1)

7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)

8、70%乙醇

9、胰RNA酶

四、实验步骤

1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL),然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落,37℃震荡培养过夜。

2、取过夜培养的菌液2mL加入离心管中,4000r/min,倒出培养液,将所有菌体细胞收集在离心管中。(每组至少做6管)

3、加入100μl溶液?于含菌体细胞的离心管中,旋涡震荡将细菌沉淀悬浮,室温

放置10min。

4、加入200μl溶液Ⅱ(新鲜配置),轻轻混匀内容物,溶液逐渐变清亮后加入溶液

Ш(千万不可用旋涡震荡器,裂解时间不超过5min)。

5、加入150μl溶液Ш(冰上预冷),盖紧管口,轻轻混匀数次。冰上放置15min让

质粒DNA复性(千万不可用旋涡震荡器)。

6、12000r/min离心10min,将上清转至另一个离心管中。(注意用枪取,记着取

多少)

7、向上清中加入等体积饱和酚:氯仿:异戊醇溶液,旋涡混匀,12000r/min离心

5min,将上清转至另一离心管中。

8、向上清中加入等体积氯仿:异戊醇,旋涡混匀,12000r/min离心5min,将上

清转移到另一个离心管中。

9、向上清中加入2倍体积无水乙醇,旋涡混匀后,室温放置30min。12000r/min

离心10min,吸去上清液。

10、用200μl 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀1次(12000r/min离心5min),倒去上清液,空气中干燥。

11、加入20uLRTE,使质粒DNA完全溶解。

五、实验结果

有白色质粒沉淀,然后又溶解。

六、分析讨论

1、溶液?、溶液Ⅱ、溶液Ш的作用分别是什么?

2、为什么真核生物基因组DNA不能用碱裂解法提取?

3、本实验需要掌握哪些知识和技术?

实验三目标基因的5’-末端的PCR扩增、3’-末端的PCR扩增

一、实验目的:学习和掌握用RACE方法扩增cDNA的5’-末端和3’-末端的方法和技术。

二、实验原理:

1、聚合酶链反应的原理:类似于DNA的天然复制过程。包括高温变性(94o C)、低温退火(50o- 60o C)、中温延伸(72o C)三个阶段。

2、电泳技术原理:DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。分子量(片段)越小,其在电泳中跑的越快;构型越稳定,跑的越快。

三、仪器、材料、试剂:

1.PCR热循环仪

2.琼脂糖凝胶电泳系统

3.紫外透射仪

4.PCR管、移液枪

5.DNA模板

6.dNTP混合物

7.引物对(正向引物和反向引物)

8.Taq酶

9.琼脂糖10. 0.5×TBE 11. 10×PCR buffer 12. loading buffer

四、实验步骤:

1.根据模板,设计引物。

2.在PCR管内配制100 μl反应体系。

双蒸水70 μl

10×PCR buffer 10 μl

2.5 mmol/L dNTP混合物8 μl

正向引物 4 μl

反向引物 4 μl

模板DNA 2 μl

Taq聚合酶 2 μl

3. 根据条件,设计PCR程序,进行扩增

94 o C 预变性2min

94 o C 变性30s

55 o C 退火30s

72 o C 延伸1min

重复步骤(2)、(3)、(4) 30次

72 o C 总延伸2min

4.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果

①将有机玻璃内槽洗净、晾干,放置于水平制胶器中,并架好样品梳子。

②制胶:配制适宜浓度的琼脂糖凝胶。准确称量0.15 g琼脂糖干粉,放入洗好的锥形瓶内,加入15 ml 0.5倍的TBE(用量筒量取)。然后,用纸盖着锥形瓶的口,

放入微波炉内加热熔化,然后冷却片刻,加入1μl染色剂,混匀,然后倒入架好的有机玻璃内槽内中,待其凝固。(先熔化30s,然后摇匀,再熔化。倒的时候如果有气泡,用枪头处理)

③拔梳子:室温下20-30 min后,有机玻璃内槽的凝胶形成一层均匀的胶面,小心拔出梳子。

④将有机玻璃内槽连同凝胶取出,放入电泳槽内。向电泳槽内加入电泳缓冲液(0.5倍的TBE),其量以没过胶面1mm为宜(约42 ml,量筒取)。

⑤加样:分别取20 μl DNA和20 μl Loading-buffer混匀,用移液枪将混匀的样品缓缓加入点样孔中。(每组点样5-6个孔)

⑥接通电源,红色为正极,黑色为负极,DNA样品由负极向正极移动,一般选择

80 V电压,电泳时间为30 min。

⑦当溴酚蓝移动到距凝胶前沿1-2 cm处,停止电泳。

⑧电泳完毕,关上电源,取出凝胶,在染色室紫外透射仪下观察结果。(注意要带上手套,不要把有机玻璃内槽拿到染色室)

五、实验结果:

基因存在处显示出绿色荧光条带。

六、分析讨论:

1. PCR技术的原理?

2. RACE技术的原理?

实验四目标产物的回收与纯化(4学时)

一、实验目的:学习和掌握回收纯化DNA的方法和技术。

二、实验原理:采用平衡酚抽提,无水乙醇和醋酸钠沉淀法,回收纯化DNA。

三、仪器、材料和试剂

(一)仪器:

1.离心机

2.琼脂糖凝胶电泳系统

3.紫外透射仪

4.移液枪

(二)材料:PCR产物

(三)试剂:

1.Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)

2.氯仿:异戊醇(V:V=24:1)

3.3M醋酸钠(pH5.2)

4.无水乙醇

5.70%酒精

6.TE缓冲液(pH8.0)

四、实验步骤

1.100μlPCR产物补水至200μl,加等体积(200μl)的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇,旋涡混匀,12000r/min离心5min,取上清(约120μl)。

2.加等体积氯仿:异戊醇,旋涡混匀,12000r/min离心5min,取上清(约100μl)。

3.加等体积无水乙醇(冰上预冷)和1/10体积3M醋酸钠(pH5.2),充分混匀(漩涡混匀或用手摇200次),沉淀DNA。

4.手动短时离心3-5s,冰上沉淀30min。

5.12000r/min离心10min,弃上清。

6. 用200μl 70%乙醇洗涤沉淀1次(12000r/min离心5min),弃上清,空气中干燥。

7. 加入20μl TE,溶解。

8.电泳检测。

五、实验结果

基因存在处显示绿色荧光条带。

六、分析讨论

1. 如何纯化PCR产物或粗提的DNA?

实验五PCR产物与载体的连接、连接产物的转化(5学时)

一、实验目的:学习和掌握DNA重组以及重组子鉴定的方法。

二、实验原理:酶切—连接—转化—蓝白斑筛选。

三、实验仪器、材料和试剂:

1、恒温摇床

2、离心机

3、超净工作台

4、恒温水浴

5、移液枪

6、LB液体培养基

7、LB固体培养基

8、IPTG 9、X-gal 10、质粒11、感受态细胞12、酶切分子试剂Ecor I

13、solution I (含目的基因和连接酶)

四、实验步骤

(一)质粒DNA的制备

(二)目的基因的获得(solution I含目的基因和连接酶)

(三)质粒DNA酶切

1.分别取两管酶切反应体系:5μl质粒+5ul Ecor I酶+5μl酶切反应液+5μl无菌水。

2.短时离心混匀(10 S以内)。

3. 37℃保温1h。

(四)载体和目的基因的连接

1.取两管10μl反应体系:5μl酶切产物+5μl Solution I,混匀,16℃水浴1h。(五)连接产物的转化

1.取感受态细胞200μl,加入10μl连接产物,冰浴30min。

2.热激:42℃保温90s。

3.冰浴2min。

4.加入800μl LB液体培养基,37℃慢摇复苏30min,同时在超净工作台上制作选择平板。

(六)重组子的鉴定(蓝白斑筛选)

1.将复苏菌液4000r/min离心1min,先吸去800μl上清液,再将细胞吹散成细胞悬液,取50μl细胞悬液直接涂布在含有羧苄青霉素、X-gal、IPTG的选择平板上。

2.将平板(培养皿)正向放置30min至液体被吸收,倒置平皿37℃培养16h,出现菌落,其中白色菌落为重组质粒。

五、实验结果:

出现的白色菌落为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。

六、分析讨论:

1.蓝白斑筛选的原理?

实验六克隆片段的鉴定(5学时)

一、实验目的:学习和掌握重组克隆的鉴定方法。

二、实验原理:克隆位点两侧分别有Eco R I和H ind III酶切位点,因此这两种酶能够将插入片段从克隆载体中切割下来。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,可以观察插入片段的大小。

三、仪器、材料、试剂

1. 实验仪器

离心机、移液枪;制冰机;电泳仪;紫外透射仪。

2. 材料

质粒载体。

3. 试剂

限制性内切酶Eco R I和H ind III。

四、实验步骤

1.挑取生长较好的单菌落,导入装有2ml LB液体培养基的离心管中,在恒温摇床培养1h。(37℃,200转)

2.提取质粒。

3. 用Eco RI和H ind III内切酶双酶切插入有外源片段的质粒载体,按以下体系配置反应液:

双酶切反应体系(50μl)

反应成分reaction ingredient 体积volume

10×H Buffer 10 μl

质粒DNA 20 μl

Eco RI酶 5 μl

H ind III酶 5 μl

ddH2O 10 μl

4. 混匀后,手动离心3-5s,置37℃反应1h,反应结束后,电泳检测。

五、实验结果:

基因存在处显示两条绿色荧光条带。

六、分析讨论

1. 进行双酶切反应注意哪些问题?

实验七-酵母表达载体的构建(11个学时)

CTAB法提取植物基因组DNA

一、实验目的:

通过本实验学习从植物基因组中提取DNA的方法和实验技术。

二、实验原理

CTAB在高离子强度的溶液中(>0.7 mol/L NaCl) 与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。EDTA抑制DNA酶的活性。再用氯仿/异戊醇抽提的方法去除蛋白质,得到的DNA溶液经NaAC和异丙醇沉淀。

三、仪器、材料、试剂

(一)仪器

恒温水浴锅,离心机,冰箱,琼脂糖凝胶电泳系统,凝胶成像仪

(二)材料

幼嫩的烟草叶片,CTAB,EDTA,NaCl,Tris,2 mL离心管,枪头等。(三)试剂

1、CTAB缓冲液;

2、3 M NaAc;

3、氯仿/异丙醇=24;1;

4、70 %酒精。

四、实验步骤

1、CTAB缓冲液置于65 ℃水浴锅中温浴1 h;

2、取幼嫩的烟草叶片置于研钵中,加入2 mL CTAB缓冲液充分研磨;

3、将研磨后的匀浆分别装在离心管中(注意每个离心管中只装1 mL的匀浆),

65 ℃水浴1 h,中间颠倒混匀4-5次;

4、加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),颠倒混匀5 min;

3、12000 rpm离心15 min;

4、取上层液体,加入80 μl 3M NaAc和800 μl异丙醇,颠倒混匀后室温静置

15min;

5、12000 rpm离心15 min;

6、弃上清,加入500 μl 70 %酒精洗沉淀一次;

7、12000 rpm离心5 min;

8、弃上清,沉淀在室温下干燥20-30 min后加入30 μl ddH2O溶解DNA。

9、取3-5 μl新提取的DNA,琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量,其余的样品保存在-20 ℃冰箱中备用。

五、实验结果

提取得到的DNA应为一条带,如果DNA降解会出现弥散带型。

六、分析讨论

CTAB法提取基因组DNA的原理是什么?

实验八-酵母的转化与筛选(4个学时)

-基因组DNA的大样酶切

一、实验目的:

通过本实验学习酶切基因组DNA的方法和实验技术。

二、实验原理

在做Southern杂交之前,基因组DNA的酶切是至关重要的一个环节。其中DNA样品的质量、纯度以及限制性内切酶的选择将直接影响酶切效果。EcoR I是资料报道中在Southern-blotting中最为常用的一种酶,酶比较稳定、受抑制剂影响较轻,而且比较便宜。

三、仪器、材料、试剂

(一)仪器

恒温水浴锅,冰箱,琼脂糖凝胶电泳系统,凝胶成像仪

(二)材料

基因组DNA(上周提取),离心管,枪头等。

(三)试剂

1、EcoR I酶;

2、Loading buffer

3、琼脂糖

四、实验步骤

1、酶切体系(总20 μL):混样过程应在冰上操作

10 × H buffer: 2 μL

EcoRI:10-15 U (1 μL)

基因组DNA:5-8 μL

ddH2O:9-12 μL

Total:20 μL

2、反应条件:37 ℃反应3 h;

3、酶切反应的终止:加入2 μL 10 × Loading buffer

4、凝胶电泳检测:低电压、长时间跑。

五、实验结果

DNA被切成Smear的带型。

六、关键知识点

1、Takara酶切中常见的Buffer及其组成:

(1)10 × L

100 mM Tris-HCl(pH7.5)

100 mM MgCl2

10 mM Dithiothreitol(DTT,二硫苏糖醇)

(2)10 × M

100 mM Tris-Hcl(pH7.5)

100 mM MgCl2

10 mM Dithiothreitol

500 mM NaCl

(3)10 × H

500 mM Tris-HCl(pH7.5)

100 mM MgCl2

10 mM Dithiothreitol

1000 mM NaCl

(4)10 × K

200 mM Tris-HCl(pH8.5)

100 mM MgCl2

10 mM Dithiothreitol

1000 mM KCl

(5)10 × T

330 mM Tris-acetate(pH 7.9)

100 mM Mg-acetate

5 mM Dithiothreitol

660 mM K-acetate

(6)10 × loading buffer 组成

SDS 0.9%

Glycerol 50%

Bromophenol Blue 0.05%

2、Southern-blotting的步骤:

基因组DNA的提取—大样酶切—低电压长时间的电泳(30V,一般过夜)—转膜—杂交—放射自显影。

七、分析讨论

基因组的酶切与质粒DNA的酶切有什么异同点?

实验九-报告基因的表达检测(4个学时)

-PBS提取植物总蛋白

一、实验目的:

通过本实验学习PBS提取植物总蛋白以及利用硫酸铵沉淀法来浓缩蛋白的方法和实验技术。

二、实验原理

在做Nornthern杂交之前,总蛋白的提取和纯化是至关重要的一个环节。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

三、仪器、材料、试剂

(一)仪器

制冰机,离心机

(二)材料

幼嫩烟草叶片,离心管,枪头等。

(三)试剂

PBS Buffer;饱和硫酸铵溶液

四、实验步骤

1、将叶片剪碎后加入2-3 mL PBS缓冲液,充分研磨样品;

2、将研磨成匀浆的样品转移至1.5 mL的离心管中(每管750 μL),冰上放置60 min;期间颠倒混匀,以便蛋白质充分溶解;

3、12000 rpm离心15 min;

4、将上清转移至新管中;

5、如果上清中仍有杂质,12000 g离心15 min;(若没有杂质,此步骤可以省略)

6、取上清液,加入等体积的饱和硫酸铵溶液,此时可以看到白色的蛋白质析出,颠倒混匀15-30 min;(请注意:保留1管不加硫酸铵缓冲液的上清液,直接放在冰箱中备用)

7、12000 rpm离心15 min;

8、-20 ℃保存备用。

五、实验结果

可以看到白色的蛋白质沉淀。

六、分析讨论

硫酸铵可以沉淀蛋白质的原理是什么?

实验十外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测

一、实验目的:

掌握蛋白质凝胶电泳技术(SDS-PAGE)。

二、实验原理

SDS是一种阴离子去污剂,在溶液中能与蛋白质分子的疏水部分定量结合,把大多数蛋白质拆成亚单位,并带上阴离子。这些阴离子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷差异,所以SDS-PAGE消除了电荷效应,只有分子筛效应。在电场下,蛋白质分子按照分子量大小在板状胶上排列。

三、仪器、材料、试剂

(一)仪器

玻璃板、胶条、梳子、垂直板电泳槽、电泳仪等。

(二)材料

上周提取的蛋白质溶液

(三)试剂

1、30%丙烯酰胺

2、1.5 mol/LTris(pH8.8)

3、10%SDS

4、10%过硫酸铵

5、5 × Tris-甘氨酸电泳缓冲液

6、考马斯亮蓝染色液

7、考马斯亮蓝脱色液

按照如下表格配制SDS-PAGE的分离胶(也称上层胶):

按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶):

四、实验步骤

1、向15 μL蛋白质上清中加入5 μL 10 × SDS-Loading Buffer,在沸水中煮沸3 min;

2、12,000 × g离心10 min,取上清,点样(20 μL)于已配制好的SDS-PAGE凝胶点样孔中;

3、浓缩胶70 V电泳20-30 min(20 min),分离胶120 V电泳2-2.5 h (1-1.5 h);

4、用至少5倍体积的染液浸泡凝胶,放在平缓摇动的平台上于室温染色1 h以上;

5、移出并回收染液,将凝胶浸于脱色液中,平缓摇动1-2 h,其间更换脱色液二到三次,直至看到蛋白质条带;

6、脱色完毕后观察结果并拍照保存。

五、实验结果

电泳结束后能看到不同大小的蛋白质条带。

六、分析讨论

SDS-PAGE能按照蛋白质分子量大小对其进行分离的原理是什么?

分子生物学实验指导(精)

分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月

实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术;质粒提取;转化;重组体的筛选;PCR技术等。

实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应,DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭(Ethidum bromide ,EB),在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带,在电场中,pH8.0条件下,凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点: (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比,分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时,线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,随着电压的增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显,不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变,但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱,最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶,电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化。

分子生物学实验指

DNA分离 核酸包括DNA、RNA两种分子在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子;原核生物的"染色体"、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子;有些噬菌体DNA有时为单链环状分子;RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子;不同类型的RNA分子可具有不同的结构特点,如真核自由RNA分子多数在3'端带有ploy(A)结构。至于病毒的DNA、RNA分子,其存在形式多种多样,有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状等。 95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内,其它5%为细胞器DNA,如线粒体、叶绿体等。RNA分子主要存在于细胞质中,约占75%,另有10%在细胞核内,15%在细胞器中。RNA以rRNA 的数量最多(80%~85%),tRNA及核内小分子RNA占10%~15%,而mRNA分子只占1%~5%,mRNA分子大小不一,序列各异。总的来说,DNA分子的总长度一般随着生物的进化程度而增大,而mRNA 的分子量与生物进化无明显关系。 分离纯化核酸总的原则:①应保证核酸一级结构的完整性;②排除其它分子的污染。为了保证核酸结构与功能的研究,完整的一级结构是最基本的要求,因为遗传信息全部贮存在一级结构之内。核

酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式。 核酸的纯化应达到的要求:①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子;②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度;③排除其它核酸分子的污染,如提取DNA分子时,应去除RNA分子,反之亦然。 实验过程中注意事宜: ①尽量简化操作步骤,缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破坏;②减少化学因素对核酸的降解,为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏,操作多在pH4~10条件下进行;③减少物理因素对核酸的降解,物理降解因素主要是机械剪切力,其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液震荡、搅拌,使溶液快速地通过狭长的孔道;细胞突然置于低渗液中;细胞爆炸式的破裂以及DNA样品的反复冻贮。这些操作细节在实验操作中应备加注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子,如真核细胞的染色体DNA。对分子量小的环状DNA分子,如质粒DNA及RNA分子,威胁相对小一些。高温,如长时间的煮沸,除水沸腾带来的剪切力外,高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中,常规操作温度为0~4℃,此温度环境降低核酸酶的活性与反应速率,减少对核酸的生

建立一个分子生物学实验室所需的仪器

分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术,这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝,从而可以深入分析基因结构与功能,并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线: 1) 分离制备目的基因或DNA片段; 2) 目的DNA与载体在体外进行连接; 3) 重组DNA分子转入宿主细胞; 4) 筛选及鉴定阳性重组体; 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器:

二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性,使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选,基因组中特定基因序列的定量定性检测,基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器: 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易,产量高和成本低廉等优点,使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是:表达缺乏翻译后加工,得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物,具有易培养,繁殖快,便于基因操作等优点,渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达

分子生物学实验报告

分子生物学实验 院系:生命科学与技术学院 专业:生物科学(基地) 班级: 201101班 学号: 姓名: 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力,生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备;DNA的重组;PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段,送进细胞中去进行繁殖和表达,需要运载工具,携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体(vector)。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子,载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖;(2)载体在受体细胞中能大量增殖,只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增;(3)载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点,便于外源基因的插入;(4)载体具有选择性的遗传标记,如有抗四环素基因(Tc r),抗新霉素基因(Ne r)等,以此知道它是否已进入受体细胞,也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件,它是基因工程中常用的载体之一。 质粒(plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小在1~120kb之间,具

有双链闭合环状结构的DNA分子,主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内,也可以整合到细菌染色体中,它离开宿主的细胞就不能存活,而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制,一般分为两种类型:严密控制型(stringent control)和松弛控制型(relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,染色体不复制时,它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制,在细胞里,它有许多拷贝,一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等,拷贝数较少,复制受到严格控制。小的质粒,如ColE Ⅰ质粒(含有产生大肠杆菌素E1基因),拷贝数较多,复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,染色体DNA复制受阻,而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12-16h,由原来20多个拷贝可扩增至1000-3000个拷贝,此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2%增加到40%-50%。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁,十二烷基硫酸钠(SDS)可使细胞壁解,经溶菌酶和阴离子去污剂(SDS)处理后,细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤,可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106-107范围内,如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106,质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内,共价闭环DNA(covalently closed circular DNA,简称cccDNA)常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,这种松弛型的分子叫做开环DNA(open circular DNA,简称ocDNA)。在电泳时,同一质粒如以cccDNA形式存在,它比其开环和线状DNA的泳动速度快,因此在本实验中,自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1.掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2.了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂

分子生物学实验复习题附答案(最新整理)

分子生物学复习题 实验一DNA的制备 (1)为什么分子生物学实施时要担心EB? 溴化乙锭(Ethidium bromide)是DNA诱变剂,溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配。具有高致癌性(接触致癌) (2)DNA加样缓冲液的用途是什么? 由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 (4)琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷,在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动,除了电荷效应以外,还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同,移动速度也不同,所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比,因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较,便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时,普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小,因此,就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时,分子大小不宜超过此值。 (5)琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的?为什么? 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间,形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下,呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA,可检出10-9g以上的DNA 含量。 (6)制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用? CTAB等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来 氯仿有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁 实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么?为什么? 应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途?制备的DNA通常又有哪些用途? 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的?从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏?为什么?

分子生物学实验技术考试题库

一、名词解释 1.分配常数:又称分配系数,是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析:确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志,分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶:指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交:在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭,用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR:是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达:外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除:是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因,从分子水平上设计实验,将该基因从动物的原基因组中去除,或用其它无功能的DNA片断取代,然后从整体观察实验动物表型,推测相应基因的功能。 8.物理图谱:人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”,以碱基对(bp,kb,Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图:不同质荷比的离子经质量分析器分开后,到检测器被检测并记录下来,经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光:激光束照射细胞时,光以90度角散射的讯号,用于检测细胞内部结构属性。

11.离子交换层析:是以离子交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解:从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移:用电泳技术将凝胶中的蛋白质,DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物,形成印迹。 15.多重PCR:是在一次反应中加入多对引物,同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签(Tag),表达产物为融合蛋白(有分N端或者C端融合表达),方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组:发生在DNA同源序列之间,有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map),它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”,以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子:广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光:激光束照射细胞时,光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性,信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合

分子生物学实验课件..

实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取 一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制,掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌(E. coli)DH5α菌株:R-,M-,Amp- 2、实验设备 恒温摇床,电热恒温培养箱,无菌工作台,高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏,蛋白胨,氯化钠,琼脂,卡那霉素 三、实验步骤 液体LB(Luria-Bertain)培养基配方: 蛋白胨(typtone) 1.0% (1 g/100 ml) 酵母提取物(Yeast extraction)0.5% (0.5g/100 ml) 氯化钠 1.0% (1 g/100 ml) PH 7.0 固体LB培养基:每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉 请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药,防止药品相互污染! (1)每组按上述液体LB培养基配方,以配制100ml的量称取药品放入烧杯。 (2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中,玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容 至100ml。 (3)pH试纸检测pH值,并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4)将100ml溶液分装入两个三角瓶,每瓶为50ml。 (5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中,以配制成两瓶50ml固体LB培 养基。 (6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。 (7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中,盖上锅盖,以对称方式拧紧锅盖,打开排气阀通电加

热,至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时,关闭排气阀。当高压锅温度(气压)指示器指示锅内温度升高至121℃(0.1Mpa)时,调节电压(或利用手动开关电源的方式)使高压锅稳定在该温度(压力)下20 min,然后断开电源。待指示器指示压力降为0时,方可打开排气阀,然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 (8)取出三角瓶后,在酒精灯火焰旁进行下述操作。 (9)取其中的一瓶直接倒培养皿,每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。 每组倒1块培养皿,在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。 (10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时(刚能感觉不烫手),向培养基中加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青霉素(Amp)溶液,使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿,在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。 (11)接种环蘸取菌液,密密划线。 (12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。 (13)一天后观察菌落。 四、思考题 (1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号:“R-,M-,Amp-”,这告诉我们关于该菌 种的什么信息? (2)在步骤7中,为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀?当灭菌完 毕,为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅,而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖? (3)在步骤12中,为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养?为什 么不是正放呢? (4)你预计该实验结果是什么,即两种培养基上菌的生长情况如何? 实验二碱裂解法小量提取质粒DNA 一实验目的 了解少量质粒制备方法与原理,掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。 二实验原理 本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来,因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜,但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉,因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA

分子生物学实验

分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上,开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性,把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的;另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理,进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的,提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容:分子生物学基本实验技术简介和实验准备(清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌) 教学要求: 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范; 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点:学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容:质粒DNA的提取与定性分析;PCR基因扩增及扩增产物的回收;DNA重组(酶切、连接、转化与筛选) 教学要求: 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶(限制性内切酶、连接酶、Taq酶)的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术; 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想, PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素;

分子生物学实验项目三

分子生物学实验项目三

实验三植物基因组DNA的提取 实验目的 通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法。 实验原理 利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。细胞提取液中含有SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜,使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白,得到的DNA溶液经乙醇沉淀。 仪器、材料与试剂 (一)仪器 1低温离心机 2 恒温水浴锅 3 台式离心机 4 琼脂糖凝胶电泳系统 5 微量加样器 (二)材料与试剂 1 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 2 乙二胺四乙酸(EDTA) 3 氯化钠(Nacl) 4 β-巯基乙醇 5 氯化钾(KCl) 6 异丙醇

7 乙醇 8 琼脂糖 9 十二烷基硫酸钠(SDS) 10 50mL离心管 11陶瓷研钵 12 吸头、小指管 13 细胞提取液 100mmol/L Tris.HCl(PH 8.0) 5 mmol/L EDTA(PH 8.0) 500 mmol/L Nacl 1.25% SDS 1 mmol/L β-巯基乙醇 14 5 mol/L KCl 15 TE缓冲液 10 mmol/L Tris.HCl(PH 8.0) 1 mmol/L EDTA(PH 8.0) 16 哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsis Columbia)三周幼叶。 17 TIANGEN基因组DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit)(离心柱型)。 实验步骤 一、自配试剂提取步骤

1 取4g新鲜叶片,在液氮中充分研磨成粉末状(越细越好)。 2 将研磨好的粉末转移至50mL的离心管中,加入16mL细胞提取液,充分混匀,65℃水浴保温20min。 3 从水浴中取出离心管,加入5mL5mol/L的KCl溶液,混匀,冰浴20min。 4 4000r/min离心20min。 5 降上清液转移到另一50mL的离心管中。 6 加等体积的酚/氯仿混匀,12000 r/min离心5min,取上清。 7 加等体积氯仿,混匀,12000r/min离心5min,取上清。 8 加入0.6-1倍体积的异丙醇(沉淀DNA),混匀。 9 离心获得沉淀,加70%乙醇洗涤3次,风干沉淀。 10加入500μLTE缓冲液,溶解DNA。 11取3 mL上清液,琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。 二植物基因组DNA提取试剂盒提取步骤 1、拟南芥基因组DNA的提取 以野生型拟南芥(Arabidopsis Columbia)2周幼叶为材料(称取叶片约100毫克),用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit)(离心柱型)按以下步骤提取基因组DNA: 1) 取干净幼叶100mg,加入液氮充分研磨。 2) 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1加入巯基乙醇,使其终浓度为0.1%),迅速颠倒混匀后,将离心管放在65℃水浴中20分钟,水浴过程中颠倒离心管以混合样品数

分子生物学实验技术全攻略

分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应(PCR)技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取

实验七、聚合酶链式反应(PCR)技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中,细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化;基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时,其开始裂殖前,先进入一个滞后期。然后进入对数生长期,以20~30min复制一代的速度增殖。最后,当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时,菌体密度就达到一个比较恒定的值,这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基,也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 (一)实验材料 大肠杆菌 (二)试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物

分子生物学实验方法与步骤

表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理 细菌体中含有大量蛋白质,具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用,通过加热使蛋白质解离,大量的SDS结合蛋白质,使其带相同密度的负电荷,在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上,不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色,可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量,可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液:丙烯酰胺(Acr)29.0g,亚甲双丙烯酰胺(Bis)1.0g,混匀后加ddH2O,37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0:Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8:Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。 4、10% SDS:电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。 5、10电泳缓冲液(pH 8.3:Tris 3.02 g,甘氨酸 18.8 g,10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 6、10%过硫酸铵(AP): 1gAP加ddH2O至10ml。 7、2SDS电泳上样缓冲液:1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml,-巯基乙醇1.0ml,SDS 0.6 g,甘油 2.0ml,0.1%溴酚兰 1.0ml,ddH2O 3.5ml。 8、考马斯亮兰染色液:考马斯亮兰 0.25 g,甲醇225ml,冰醋酸 46ml,ddH2O 225ml。 9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。 二、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置 (一)聚丙烯酰胺凝胶的配制

分子生物学试验基础知识

分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的,以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科,在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程(基因技术,基因重组)是目前分子生物学研究热点,这些技术可以改造或扩增基因和基因产物,使微量的研究对象达到分析水平,是研究基因调控和表达的方法,也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化(trans formation)、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式,也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆(gene clone),基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化,得以增量,便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化(transformation),以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染(transfection)。利用载体(噬菌体或病毒)把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导(transduction)。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位(transposition),这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 (一)载体 载体(Vector)是把外源DNA(目的基因)导入宿主细胞,使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒(plasmid)、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒(粘粒)、病毒等。载体具有能自我复制;有可选择的,便于筛选、鉴定的遗传标记;有供外源DNA插入的位点;本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌,是染色体(核)以外的独立遗传因子,由双链环状DNA组成,几乎完全裸露,很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制,一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制,一个细胞可复制30-50个质粒,如果用氯霉素可阻止蛋白质合成,使质粒有效利用原料,复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多,常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因,如复制起动区(复制原点Ori),便于复制扩增;抗抗生素标记(抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等)或大肠埃希菌部分乳糖操纵子(E.coli LacZ)等,便于基因重组体的筛选;基因发动子(乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等)和转录终止序列,便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点,即基因插入位点,又叫基因重组位点,基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统;双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点,便于选择,灵活应用。 (二)工具酶

分子生物学实验设计实验

分子生物学实验 设计实验 题目:在大肠杆菌中表达绿色荧光基因(EGFP ) 学院:生命科学学院 专业:生态学 教师:吴传芳 姓名/学号:余光辉/20 方成/20

一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,其基本原理为:当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后, 质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeast extract)5 g,NaCl 5g, 琼脂(固体培养基)15g,用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ:50mmol/L 葡萄糖, 10mmol/ EDTA-Na, 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ:0.4mol/L NaOH , 2% SDS 临用前1:1配制。 溶液Ⅲ:5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液(饱和酚:氯仿:异戊醇=25:24:1 ) 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O

3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 (1)将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中(加氨苄青霉素50μg/mL),37℃培养过夜 (2)取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中,10000rpm×2min,弃上清液 (3)加入100μL溶液I,漩涡器上充分混匀,在室温下放置10 min (4)加入200μL新配制的溶液Ⅱ,轻轻翻转2~3次,使之混匀,冰上放置5 min (5)加入150μL冰冷的溶液Ⅲ,加盖后温和颠倒数次使混匀,产生白色絮状物,冰上放置15 min (6)10000rpm×5 min,取上清液于另一干净的离心管中 (7)向上清液中加入等体积(约400μL)酚/氯仿/异戊醇(25:24:1,v/v),振荡混匀,10000rpm ×10 min,将上清液转移至新的离心管中(8)加入等体积(约370μL)氯仿/异戊醇(24:1),混匀,离心2min ,取上清液于新离心管中 (9)向上清液加入2倍体积无水乙醇,混匀,-200C放置1h (10)12000rpm × 5 min,倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体 (11)加0.8mL70%乙醇,离心1 min,倒去上清液,真空抽干或室温自然干燥30min (12)加30μL ddH2O ,-200C保存备用 5.注意 (1)饱和酚(取下层)单独吸200μL,氯仿:异戊醇(24:1)吸200μL (2)制备质粒过程中,所有操作必须缓和,不要剧烈振荡(特别是加入溶液II 和III ),以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中,由于操作原因,提取的质粒可能有三种:线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度:闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况,因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view(DNA染料) 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液(6×) 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ,琼脂糖,锥形瓶,一次性手套,胶铲,封口膜,

分子生物学实验指导-3

北京化工大学分子生物学实验指导

实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 (1)了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 (2)掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 (3)学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒(plasmid)是一种双链的共价闭环状的DNA分子,它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构,能够在细胞质中独立自主地进行自身复制,并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看,没有质粒存在,基本上不妨碍细胞的存活,因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性,通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法,使重组到质粒的某种基因(如干扰素基因)带进受体细胞(如具有一定特性的大肠杆菌细胞等)表达它的遗传性质,改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物,或产生新的物质(如干扰素)。目前,质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体,同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中,质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右,但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制,一般分为两种类型:严密控制(stringent control)复制型和松弛控制型(relaxed control)复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制,染色体不复制时,质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子(即有1个或几个拷贝)。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,当染色体复制已经停止时,该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝,一般在20个以上,例如col E1 质粒(含有产生大肠杆菌素E1 基因)及其衍生质粒,在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多,例如碱溶裂法(alkaline lysis)、热裂解法(boiling method)、氯化铯(CsCl)纯化法,及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA,使两者双股打开呈单股状态,再加酸中和,使单股回复为双股DNA,同时在急速中和反应中,染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对,形成杂乱无序的巨大分子,对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反,质粒DNA因分子小,两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中,所以只要经过离心,即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因,会产生peripasmic酶,进行蓝白斑筛选,抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法:本实验是以alkaline lysis的方法进行,其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解,并使蛋白质及DNA变性,然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状,但大部

分子生物学实验技术实验内容

2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR (一)总 RNA的提取 实验安排:每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间,各组样品请一起离心。 操作步骤: TM(苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中,再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物)。 2、将样品剧烈混合后,在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿,颠倒Ep 管混和两次,并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下,以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中,加入等体积的异丙醇(Isopropanol)并混匀,然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下,以10000×g离心15min 后,小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥(不能完全干燥)处理后,用10μl 无RNase污染的水(RNase- Free Water)将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项: 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料,如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC,在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制,然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作,并戴一次性口罩、手套,实验过程中手套要勤换。 二)反转录 实验安排: 每人做一管反应体系(20μ l):按下列顺序加样 μl4 5× Buffer

分子生物学大实验报告

分子生物学实验 : 专业: 学号:

目录 实验一细菌培养 实验二质粒DNA提取 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验五聚合酶链式反应(PCR)技术体外扩增DNA 实验六地高辛标记的Southern杂交

实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中,细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化;基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时,其开始裂殖前,先进入一个滞后期。然后进入对数生长期,以20~30min复制一代的速度增殖。最后,当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时,菌体密度就达到一个比较恒定的值,这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基,也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 (一)实验材料 大肠杆菌 (二)试剂 1. 胰蛋白胨 2. 酵母提取物 3. 氯化钠 4. 1mol/L NaOH 5. 琼脂粉 6. 抗生素(氨苄青霉素、卡那霉素等) (三)仪器 1. 培养皿 2. 带帽试管 3. 涂布器 4. 灭菌锅 5. 无菌操作台(含酒精灯、接种环、灭菌牙签等) 6. 恒温摇床 四、操作步骤 (一)LB培养基的配制 配制每升培养基,应在950m1去离子水中加入: 细菌培养用胰蛋白胨10g 细菌培养用酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解,用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。加入去离子水至总体积为lL,在15 lbf/in2 (1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20分钟。 这样得到是LB液体培养基。LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。 (二)细菌的培养 (1)在液体培养基中培养

医学分子生物学实验技术

1、基因:是遗传的物质基础,是DNA 或者RNA分子中携带遗传信息的特定核苷酸序列。 2、基因组:是指单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA 或RNA分子,每个生物的基因组携带者构成和维持该生物体生物形式所必需的所有生物信息。 3、逆转录:以RNA为模板,由反转录酶催化四种dNTP聚合,产生DNA的过程。 4、聚合酶链反应:是一种由引物介导利用DNA聚合酶在体外扩增目的基因的方法,也叫基因扩增技术。 5、限制性核酸内切酶:是一类能识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 6引物:是一种与DNA模板链互补的线性核苷酸变短,其3’末端为游离的-OH,细胞内复制所需的引物是一小段RNA。催化游离dNTP之间相互聚合。 7、TaqDNA聚合酶:从一种嗜热菌株中分离得到的耐热的DNA聚合酶。 8、退火:热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性,这一过程成为退火。 9、启动子:是位于转录起始点附近,且为转录所必需的序列元件。 10、DNA变性:当DNA收到某些理化因素作用时,DNA双链互补碱基对之间的氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏,DNA分子被解开成单链,逐步形成为无规则线团的构象,不涉及核苷酸间共价键的断裂。

1、RT-PCR的基本原理 将RNA反转录与PCR过程结合的一种PCR技术,在反转录酶的作用下,以mRNA为模板,反转录生成DNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增。 2、DNA电泳的基本原理,按照支持物不同可以分为几类 基本原理:核酸是两性电解质,在中性或偏碱性的pH溶液中均带负电,在电场中向正极泳动,不同的核酸在相对分子质量、分子形状等方面各有不同,在凝胶的空隙中泳动时电泳迁移率各不相同,因此借助电泳即可使其得到分离。 分类:1琼脂糖凝胶电泳AGE 2聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE 3 毛细管电泳 3、总RNA提取后,如何鉴定RNA的纯度 (1)紫外分光光度法:先通过A260与A280的比值判断核算的纯度,纯RNA的A260与A280的比值等于2.0,比值升高或降低均表示样品不纯。 (2)琼脂糖凝胶电泳法:基因组DNA的分子量远远大于RNA,两者之间电泳迁移率存在很大差别,用荧光染料EB为示踪剂的AGE即可观察到RNA分子中是否含有DNA,细胞RNA的琼脂糖凝胶电泳一般可见三条条带,条带模糊比例不合适及弥散明显说明RNA有严重降解。

相关文档
相关文档 最新文档