巢式甲基化特异性PCR检测不同类型组织标本中WIF_1基因启动子异常甲基化

巢式甲基化特异性PCR检测不同类型组织

标本中W I F21基因启动子异常甲基化

徐新娟　丁文柏

三峡大学第一临床医学院呼吸内科(宜昌443003)

摘　要　目的:采用一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法,即巢式甲基化特异性PCR法(nested2M SP,n M SP),检测外科手术切除新鲜组织、石蜡包埋组织及纤维支气管镜活检组织中W IF21基因启动子的异常甲基化状态。方法:将基因组DNA变性成为单链,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA,所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物,进行巢式PCR扩增,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果:在3种类型的原发性非小细胞肺癌标本中都检测出了W IF21基因启动子的异常甲基化。结论:巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化的分析。

关键词　巢式甲基化特异性PCR(n M SP);W IF21;基因;甲基化

D etection of Prom oter A bn orm a l M ethyla tion of W I F21Gen e

i n D ifferen t K i n d s of Sa m p les by Nested M ethyla tion

Spec if ic Polym era se C ha i n Reaction

Xu X in juan　D ing W enba i

D ep art m en t of R esp ira to ry D iseases,The F irst Co llege of C linical M edical

Science,Ch ina Th ree Go rges U niversity,Yichang443003,China

A b stra ct　O b jec tive:U se nested2m e thylation specific po ly m e rase chain re2

action(n M SP),a sensitive and sp ecific m e thod PCR2based fo r rap id analysis of the p romo ter m e thylation statu s,to detectW IF21gene p romo ter abno r m al m ethyla2 tion statu s in su rgical resected fresh tumo r tissue,p araffin2em bedded tissue and b i2 op sy samp les of fiberop tic broncho scopy(FB).M ethod s:Target DNA wa s dena2 tured by N aOH,then single strands DNA was mod ified by sodium b isulfite.A ll unm e thylated,bu t no t m ethyla ted cyto sines were converted to u racil.The p ri m ers sp ecific fo r m e thylated ve rsus unm ethylated DNA were de signed and amp lified by ne sted2PCR.The target frag m en t wa s ve rified by gel electropho resis.Resu lts:

通讯作者:丁文柏(1950～),男,主任医师,教授,硕士生导师。

The p romo ter abno r m al m ethylation of W IF21gene wa s de tec ted in all the three types of p ri m ary non2s m all cell lung cance r tissue s.C on clu sion s:n M SP is a si m2 p le,sen sitive and sp ec ific m e thod fo r rap id analysis of the p romo ter abno r m al m ethylation statu s of m any genes.

Key word s　nested m ethylation2spec ific PCR(n M SP);W IF21;gene; m ethylation

肺癌是严重威胁人类健康的重大疾病,肺癌已成为全球病死率第一位的恶性肿瘤。根据W HO估计,到2025年我国每年新增的肺癌病死例数将超过100万;到2030年全球每年将有1000万人死于肺癌。肺癌是预后最差的恶性肿瘤之一,虽经几十年的努力,投入大量的人力、物力到肺癌的诊治工作,但肺癌的总体5年生存率在美国仅为15%[1],我国则更低。要获得肺癌诊治的突破,从根本上说,需依赖于基础研究的深入和探索。近年来的研究显示肿瘤的发生与DNA甲基化模式的异常关系密切,Cp G 岛的异常甲基化是导致许多抑癌基因转录失活的一个重要机制[2]。已有研究发现W n t信号途径的紊乱与肿瘤的发生密切相关[3]。W n t抑制因子21(W n t inhibi2 to ry facto r21,W IF21)可与WN T蛋白直接结合并阻断W nt信号的传递,从而阻止因W n t通路紊乱而导致的肿瘤,甚至可逆转因W nt紊乱引起的恶性肿瘤[4]。

因此,本研究采用巢式甲基化特异性PCR(ne sted m ethylation2sp ecific PCR, n M SP)的技术方法,研究不同类型来源的原发性肺癌组织中W IF21基因启动子区域CpG的甲基化状态,探索该基因甲基化状态与肺癌发生的关系,旨在为探索肺癌的发病机制及其诊断、防治提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　标本收集

肿瘤组织标本来自三峡大学第一临床医学院(宜昌市中心人民医院),肺癌患者66例,其中30例为纤维支气管镜活检组织,25例外科手术切除的新鲜肺癌组织和癌旁组织,11例该期间病理科的存档石蜡包埋肺癌组织。肺部良性瘤样病变10例。新鲜外科手术标本的采集在肿瘤切除后即刻进行,并放入液氮保存,手术结束后移至-80℃冰箱保存。肿瘤组织采集时避开肿瘤的液化坏死部分,对应的正常组织标本距离肿瘤组织5cm以上。66例肺癌患者术前均未接受过放化疗,男性54例,女性12例,年龄36～77岁之间,平均年龄54.3岁。以上标本均经病理学确诊,其中鳞癌47例,腺癌8例,小细胞癌8例,大细胞癌1例,类癌1例,细支气管肺泡癌1例。10例肺部良性瘤样病变均经术后病理诊断为炎性假瘤。组织学分型根据《2004年W HO肿瘤分型:肺、胸膜、胸腺和心脏分册》。

1.2　方法

1.2.1　DNA的提取　采用经典的酚2氯仿抽提法提取组织DNA:组织匀浆后,置55℃水浴槽中经蛋白酶K消化2～3h (石蜡包埋组织须先经二甲苯脱蜡2次后进行),然后加入等体积酚/氯仿抽提,取上清用乙醇沉淀DNA,最后溶于50μl ddH2O中,-20℃保存。紫外分光光度计测定DNA的纯度及含量,各样本A260/280均在 1.5～2.0之间。

1.2.2　DNA的亚硫酸氢钠(sod ium b i2 su lfite)修饰　DNA经过亚硫酸氢钠修

饰,CpG中未甲基化的胞嘧啶将被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不发生变化。修饰过程如下:取3μg模板DNA,以ddH2O定容至50μl,加入2 mo l/L新配的N aOH 5.5μl,37℃孵育15m in后,加入新配的30μl10mmo l/L 的氢醌(Sig m a,H29003)和520μl pH 值 5.0的2mo l/L的亚硫酸氢钠(Sig m a, S29000),充分混匀后,上置矿物油,55℃孵育16h。以W iza rd DNA clean2up sys2 tem(P rom ega,A7280)纯化,修饰后的DNA稀释至50μl,并加入5.5μl3mo l/ L的N aOH,13000rpm4℃离心后,经无水乙醇沉淀,70%乙醇洗涤,以20μl无菌ddH

2

O溶解,-20℃保存备用[4]。

1.2.3　设立对照　a.阴性对照:正常人来源的外周血淋巴细胞DNA;b.阳性对照:经过SssI(SssI m e thyltransfe rase,DNA 甲基转移酶,N ew England B io lab s)处理的DNA;c.空白对照:双蒸水。同样按照上述方法修饰处理后,置-20℃保存备用。

1.2.4　PCR引物的设计　参照引物设计原则,根据各个基因的启动子DNA序列自行设计引物。每个基因分别设计三对引物,一对外侧引物,两对内侧引物(甲基化引物和未甲基化引物各一对),用以扩增基因启动子区域富含CpG的区域。所有引物均由上海生工生物工程公司合成。引物序列、退火温度、PCR循环数和扩增产物的长度如表1所示。

表1　W IF21基因的巢式甲基化特异性PCR引物序列

引物序列

退火

温度(℃)

PCR

循环数

产物大小

(bp)

外侧:内侧:TTY GTT YGT AGT GTT A GT A GG T A

CAA AAT A TC T AA CRA CRC CAA ATT

5338156

甲基化:5’-TGT TTT A G A GTT A G A GCG C-3’

5’-T AC G AC ACG AAA AAT TTT CCC G-3’

602097

未甲基化:5’-G A G G AT GTT TT A G A G TT A G A G TGT-3’

5’-AA T ACA ACA CAA AAA A TT TTC CCA-3’

6020101

1.2.5　巢式甲基化特异性PCR和电泳分析　25μl PCR体系包含10×B uffer 2.5μl(含M g2+),10mmo l/L的dN TP 1.0μl,Taq DNA聚合酶0.5μl(Fer m en2 ta s公司),10pmo l/L的一对外侧引物各0.2μl,亚硫酸氢钠修饰后的模板DNA 4.0μl,定容至25μl。同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照。外侧PCR循环参数:95℃5m in,1个循环;95℃30s, 53℃退火30s,72℃40s,38个循环; 72℃5m in。

第二轮PCR使用两对内侧引物分别扩增,25μl PCR体系包含10×B uffer 2.5μl(含M g2+),10mmo l/L的dN TP 1.0μl,Taq DNA聚合酶0.5μl(Fer m en2 ta s公司),10pmo l/L的甲基化和未甲基化上、下游引物各0.3μl,外侧PCR的扩增产物 4.0μl,定容至25μl。内侧PCR循环参数:95℃5m in,1个循环; 95℃30s,60℃退火30s,72℃延伸40 s,20个循环;72℃延伸5m in。

最后,取10μl PCR产物经 2.0%的琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭(EB)染色,稳压120V,20m in后于Kodak凝胶成像系统紫外光下观察结果。肉眼发现甲基化特异性引物扩增的条带则标本计为甲基化(M),未甲基化特异性引物扩增条带则标本计为未甲基化(U)。所有试验

均重复检测,且经两位以上研究人员判断结果,以确保结果的可重复性和准确性

。

I V D:阳性对照;NL:阴性对照;T1:肿瘤

组织1;T2:肿瘤组织2;T3:肿瘤组织3;

N1:正常肺组织1;N2:正常肺组织2;U:

非甲基化;M :甲基化

图1　肺癌及癌旁组织中W IF 21基因巢式

甲基化特异性PCR 产物电泳结果

1.2.6　统计学分析　采用SPSS 11.0

统计软件包进行统计分析,采用χ2

检验和F isher 精确概率法,双侧检验,以P <0.05表示有统计学差异。2　结果

2.1　n M SP 法检测

首先用W IF 21外侧引物扩增出1个156bp 的W IF 21基因启动子区片段,结

果全部DNA 标本中均可扩增出相应片段。然后分别用W IF 21的甲基化和非甲基化特异性引物进行第二次扩增,对于阳性(甲基化)标本,用甲基化和非甲基化引物扩增,都有特异性扩增产物;对于阴性(非甲基化)标本,只有非甲基化引物的扩增产物。3种标本中都可检测出W IF 21基因的异常甲基化(图1),而正常组织中则未发现。2.2　W IF 21的甲基化状态

本实验分别用n M SP 法检测了25对肺癌和癌旁组织、30例纤支镜活检肺癌组织、11例石蜡包埋肺癌组织以及10例正常肺组织中W IF 21的甲基化状态,检测结果为:肺癌组织中W IF 21基因呈中度异常甲基化,其甲基化状态与患者的性别、年龄、组织学类型等临床病理特征无明显相关性(P >0.05),但是在重度吸烟(吸烟指数>400支×年)患者肺

癌组织,W IF 21甲基化率明显增高,差异具有统计学意义(P <0.05),如表2所示。10例正常肺组织均为甲基化阴性;手术切除肺癌组织及癌旁组织分别有56.0%和28.0%异常甲基化,差异有统计学意义(P <0.05);纤支镜活检组织

有50.0%异常甲基化;石蜡包埋组织有

36.4%异常甲基化,3种不同来源肿瘤组织W IF 21基因异常甲基化的检出率无明显差别(P >0.05);所有肺癌组织总的异常甲基化率为50.0%(表2)。

表2　66例肺癌标本W IF 21基因甲基化

与临床病理特征的关系

临床病理特征N 甲基化率(%)

P

性别男

女541253.733.30.202

年龄(岁)

≥60<60

244258.345.20.306

组织学类型鳞癌

腺癌

小细胞癌478857.450.025.00.224

吸烟指数:

>400≤400

4125

61.032.0

0.022

吸烟指数=每日吸烟支数×吸烟年

数);

P >0.05;

P <0.05

3　讨论

目前用于DNA 甲基化检测分析最常用的方法是甲基化特异性PCR (m ethyla 2tion 2specific po ly m erase chain reaction,M SP ),其基本原理是首先用亚硫酸氢钠

处理基因组DNA ,使所有未发生甲基化

的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR 扩增,最后通过凝胶电泳分析,确定与引物互补的DNA 序列的甲基化状态。M SP 法灵敏度较高,对于任一Cp G 岛位点,可检测到1/1000的甲基化的等位基因,应用范围广,操作也比较简便[5]

。

在此基础上产生改进的巢式甲基化

特异性PCR(nested m ethyla tion2sp ec ific po ly m era se cha in reaction,n M SP),对待检测序列进行两次PCR扩增,降低了扩增多个靶位点的可能性(因为与两套引物都互补的引物很少),增加了检测的敏感性,又有两对PCR引物与检测模板的配对,增加了检测的可靠性,已逐渐被应用于甲基化启动子的分析和检测中,其灵敏度是M SP法的50倍,因此可以检测出1/50000的甲基化等位基因片段[6]。其次,DNA甲基化是一种比较稳定的DNA修饰,可以在子代细胞中保留,并且随癌变的进程有增强的趋势[7]。同时,对于抑癌基因来说,Cp G的胞嘧啶甲基化主要发生在启动子区域,而其他突变(如点突变等)经常发生在基因序列中的不同区域,因此检测相对简单。此外,DNA甲基化分析是一种正向检测方法,即:将甲基化异常的获得作为判断标准,分析结果不会受正常细胞存在的干扰,检测结果直观,降低了假阴性率和假阳性率,也使不同实验室的数据具有可比性[8]。由此可见,从基因甲基化入手寻找特异性的标志物,对于肺癌早期辅助诊断甚至高危人群的筛选,有着积极的意义。

本项研究结果表明,利用n M SP法进行检测的肺癌组织中W IF21基因呈中度异常甲基化,3种不同来源肿瘤组织W IF21基因异常甲基化的检出率无明显差别(P>0.05),因此可广泛应用于不同类型组织标本基因启动子甲基化的分析。由于纤支镜检查患者痛苦较小,依从性较好,而且对中央性肺癌的取材比外科手术更加方便、快捷,因此,纤支镜活检组织中W IF21基因的甲基化分析,有可能成为辅助肺癌诊断的分子生物学指标。但是,W IF21基因甲基化在我国非肿瘤患者以及吸烟等肺癌高危人群中的发生情况如何?其他抑癌基因的异常甲基化在中国人肺癌中的发生情况如何?这些重要的相关问题均有待进一步研究。

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(2007-11-15收稿)

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C. 用识别不同序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割 D. A和B E. A、B和C 正确答案：E 4. 减数分裂I 的前期中同源染色体间的两条非姊妹染色单体发生交换的时期为 A. 细线期 B. 偶线期 C. 粗线期 D. 双线期 E. 终变期 正确答案：C 5. 父亲并指（AD），母亲表现型正常，生出一个白化病（AR）但手指正常的孩子，他们再生孩子手指和肤色都正常的概率是 A. 1/2 B. 1/4 C. 3/4 D. 1/8 E. 3/8 正确答案：E 6. 下列哪一项不是XR特点 A. 交叉遗传 B. 系谱中男性患者远多于女性患者 C. 系谱中女性患者远多于男性患者 D. 致病基因位于X染色体上 E. 男性患者的致病基因是从母亲遗传而来

正确答案：C 7. 癌家族通常符合 A. 常染色体隐性遗传 B. 常染色体显性遗传 C. X连锁隐性遗传 D. X连锁显性遗传 E. Y连锁遗传 正确答案：B 8. 脆性X染色体的脆性部位位于 A. Xq24．3 B. Xq25．3 C. Xq26．1 D. Xq27．3 E. Xq29．3 正确答案：D 9. 癌基因erb产物是 A. 生长因子 B. 生长因子受体 C. 信号传递因子 D. 核内转录因子 E. 蛋白质酪氨酸激酶 正确答案：B 10. 在研究尿黑酸尿症的基础上，提出先天性代谢缺陷概念的是 A. Morgan

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什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。

荧光PCR检测原理

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。 其特点有： (1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。 (2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。 实时荧光定量PCR技术的基本原理 在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR 循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR 循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。 荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。 方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R2＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。 实时荧光定量PCR技术的应用 1. 基因工程研究领域 ①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。 ②转基因研究：利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因老鼠接合性。该方法为45个转基因动物的同型结合及异质结合提供了明确的鉴定结果。通过实时定量PCR检测，同型结合的异质接合动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大的用途。

pcr检测技术

《食品安全学》综述 PCR快速检测技术综述 1．前言 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，是肉眼能直接观察和判断；可从一根头发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几个星期才能做到的事情，用PCR几个小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 该酶促反应最基本的3个环节是：[1]模板DNA的变性，即在94℃下模板双链DNA变为单链DNA；[2]引物与模板链的特异性复性；[3]引物链的延伸。 2.研究的目的与意义 聚合酶链反应（PCR）技术建立以来，定性技术不断改进和完善，可以达到检测单个靶序列的水平、但实际工作中常需要定量检测标本中核酸，而不是某一特定序列存在与否，借助PCR对基因快速、敏感、特异而准确定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。定量PCR旨在评估样品中靶分子数，此测定可以是绝对的，如每微克样本中靶DNA的分子数；也可以是相对定

量，即与设定的内参照或外参照比较而言。鉴于PCR方法主要有5个，即对PCR产物的直接定量、极限稀释法、靶基因与参照基因的同步扩增、竞争性PCR和荧光定量PCR[1]。这几种放啊各有利弊，对其选择取决于靶基因的特性、对PCR产量的期望值、对准确度的要求、需要相对还是绝对定量。 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki 等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR 与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 3.国内外研究现状 3.1. 基础研究方面的应用 目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的： [1] 扩增目的基因和鉴定重组子； [2]克隆基因； [3]基因功能和表达调控的研究； [4]基因组测序； [5]制备单链模板； [6]致突变； 3.2. PCR在临床上的应用[2] [1]在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。 [2]在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR 技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。

等位基因特异性-PCR联合限制性内切酶消化法检测JAK2V617F突变(一)

等位基因特异性-PCR联合限制性内切酶消化法检测JAK2V617F突变(一) 作者：申徐良陈方平魏武张梅香史文芝秦小琪徐洪亮 【摘要】目的：建立敏感特异的JAK2V617F点突变的临床检测方法。方法：基因组DNA从HEL细胞或正常志愿者外周血中提取。采用等位基因特异性-PCR（Allelespecific-PCR，AS-PCR）和限制性内切酶消化的方法检测基因组中JAK2V617F突变。结果：本AS-PCR法可对JAK2基因扩增出364bp的内参照条带，当存在JAK2V617F突变时，又可以扩增出203bp的突变条带。只有野生型内参照条带364bp可被BsaXⅠ消化切割。结论：AS－PCR法和限制性内切酶法是检测JAK2V617F突变的敏感特异的检测方法，可以成功应用于临床检测。 【关键词】等位基因特异性-PCR；JAK2V617F突变；限制性内切酶BsaXⅠAbstractObjective:ToestablishasensitiveandspecifictestforJAK2V617Fpointmutation.Methods:Gen omicDNAwasisolatedfromHELcellsorPeripheral-bloodcellsfromnormalvolunteer.Allele-specificpol ymerasechainreactions(AS-PCR)andrestrictionenzymedigestionwereperformedtodetectthemutati oningenomicDNA.Results:Acontrolband(364bp)canbeobtainedbyAS-PCR,andamutedband(203bp) canbeobtainedonlywhenJAK2V617Fwaspresented.Onlywildtypecontrolband(364bp)canbedigeste dbyrestrictionenzymeBsaXⅠ.Conclusion:AS-PCRandrestrictionenzymedigestionweresensitiveand specifictestsforJAK2V617Fpointmutation,andcanbesuccessfullyusedforclinicaltest. KeywordsAllelespecific-PCR;JAK2V617Fmutation;RestrictionenzymeBsaXⅠ JAK2基因属JAKs(Januskinases/Justanotherkinases)家族成员，是胞浆非受体性酪氨酸激酶,在多种造血生长因子受体信号转导中发挥关键作用〔１〕。2005年，Baxter〔２〕和Kralovucs 〔３〕先后发现大部分骨髓增殖性疾病患者携带有一个获得性的JAK2基因突变-JAK2V617F，该基因突变位于JAK2基因第1849位，原来的鸟嘌呤（G）被胸腺嘧啶（T）所取代，导致原位于617位的缬氨酸错义编码为苯丙氨酸(G→T,JAK2V617F)。该突变的阳 性率在PV中高达65%～97%、ET为23%～57%和IMF为35%～57%，在AML/CML中有少量表达〔２～6〕。JAK2V617F基因突变的发现是近年来骨髓增殖性疾病发病机制的突破性进展，因此有学者将其称为骨髓增殖性疾病的“JAK2时代”。JAK2V617F的发现对于临床上骨髓增殖性疾病的诊断和鉴别诊断有非常重要的意义。为此，我们在临床上建立了两种敏感特异的JAK2V671F点突变的检测方法－等位基因特异性－PCR法（Allelespecific-PCR，AS-PCR）和限制性内切酶消化法。这两种方法的应用，有利于提高骨髓增殖性疾病的临床诊断水平。 1材料与方法 1.1细胞培养 HEL细胞株购自中国科学院上海科学研究院，培养于含10%胎牛血清(Hyclone)、100U/mL青霉素，100U/mL链霉素的RPMI1640(Gibco)培养基中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3d换液一次。待细胞生长至>80%汇合时以1∶3的比例传代，取对数生长期的细胞用作实验。 1.2基因组DNA制备 HEL细胞基因组和正常人血液基因组DNA用血液基因组提取试剂盒（上海生物工程公司产品）提取。 1.3AS-PCR及产物分析 PCR引物合成工作由北京奥科生物公司完成。各引物序列如下：公用反向引物(R1)5＇-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3＇、野生型正向引物(F1)5＇-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3＇（364bp）、突变特异性正向引物(F2)5＇-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3＇（203bp）。PCR反应体系为50μL,每管中加入80ngDNA 模板，公用反向引物(10μM)1μL，突变特异性正向引物(10μM)1μL或野生型正向引物(10μM)1μL，10XPCR缓冲液5μL，25mMMgCl23μL，10mMdNTPs1μL，5U/μL的Taq聚合酶1μL，

PCR技术在食品检测中的应用汇编

许昌学院食品与生物工程学院2015-2016学年第一学期《现代食品检测技术》课程论文 PCR技术在食品检测中的应用

PCR技术在食品检测中的应用 许昌学院食品与生物工程学院，河南许昌461000 传统检测食品中微生物的方法主要是分离和培养鉴别，该方法操作繁琐，有些微生物很难培养。尤其是针对检测食品中的弱势菌，使用传统的方法基本无法检测出来。聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，由于它可以将微量的DNA大幅增加的特点，所以能够比较准确地检测食品中微生物。本文主要介绍PCF技术的操作原理和目前运用到食品检测中的几种具体的PCR技术特点，包括：多重PCR技术、实时荧光定量PCF检测技术、免疫PCR检测技术。并且对PCR技术在食品检测方面予以展望，为解决食品安全问题和相关食品检测做出导向作用。 关键词：食品检测；微生物培养；聚合酶链式反应；食品安全问题

、、■ 刖言 食品⑴是指原料不经加工或经过加工或改变性状、具有一定营养价值、对人体无害、可供人类食用的物质。它不仅富含营养成分和水等物质更容易滋生微生物，而且它能最直接的与人体接触，进入人体的消化系统，所以食品安全问题[2-4] 不容轻视。现代食品行业，在生产、运输、销售过程中有很多有害的微生物，这将严重危害食品的品质和人们的健康，甚至会引起一些严重的疾病。现代食品检测技术⑸是对食品按其原定用途进行制作和食用时不会使消费者受到伤害的一种担保。为保证食品安全急需一些快速、敏感、特异的检测方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。PCR检测技术具有敏感性、 特异性、简便、快速的优点，现已广泛应用于微生物检测，尤其对培养困难的细菌检测和抗原结构复杂的细菌鉴定方面，具有常规方法无法比拟的优越性。 随着分子微生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，尤其是聚合酶链反应（PCR）成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于食品的检测，具有广阔的发展前景。 1 PCR技术的原理 PCR是在体外人为控制的合适条件下，以单链DNA或RNA为模板，以1 对人工合成的寡核苷酸序列为引物，在耐热Tap DNA聚合酶作用下特异性扩增基因片段的技术。整个反应过程除了需要加入待扩增的DNA片段和两个决定特 异性的引物外，还需加入适量的缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸溶液（dNTP）、Tap DNA聚合酶、Mg2+等。每个PCR循环包括模板DNA变性、模板DNA与引物的退火（复性）、引物的延伸3个基础步骤。反应时，首先将靶DNA双链加热变性为单链状态，然后降低溶液温度，加入2段人工合成的与靶DNA端邻序列互补的寡核苷酸片段作为引物，即左端引物和右端引物，使合成引物在低温下与其靶序列特异配对，形成部分双链。然后，在Tap DNA聚合酶和4种dNTP 底物存在的情况下，引物沿模板DNA链（靶DNA单链）按5 '末端向3 '末端方向延伸，自动合成新的DNA双链，新合成的DNA片段又可作为扩增的模板。如此重复改变温度，由高温变性、低温复性、和适温延伸组成一个周期，每个周

习题+答案

1.表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是 A.酵母表达体系 B.E.coil表达体系 C.昆虫表达体系 D.哺乳类细胞表达体系 E.大肠杆菌表达体系 2.下列哪种物质在 PCR 反应中不能作为模板：A．RNA B．单链DNA C．cDNA D．肽链 E．双链DNA 3.关于探针叙述错误的是： A．带有特殊标记 B．具有特定序列 C．必须是双链的核酸片段 D．可以是基因组 DNA 片段 E．可以是抗体 4.有关肿瘤病毒叙述错误的是： A．有 RNA 肿瘤病毒 B．有 DNA 肿瘤病毒 C．能直接引起肿瘤 D．可使敏感宿主产生肿瘤 E． RSV 是一禽肉瘤病毒 5.关于 p53 基因的叙述错误的是： A．基因定位于 17p13 B．是一种抑癌基因 C．编码产物有转录因子作用 D．其突变仅见于少数肿瘤 E．突变后可致癌 6.原癌基因发生单个碱基的突变可导致: A．原癌基因表达产物增加 B．表达的蛋白质结构变异 C．无活性的原癌基因移至增强子附近 D．原癌基因扩增 E．以上都不对 7.关于细胞癌基因叙述正确的是 A．在体外能使培养细胞转化 B．感染宿主细胞能引起恶性转化

C．又称为病毒癌基因 D．主要存在于 RNA 病毒基因中 E．感染宿主细胞能随机整合于宿主细胞基因 8.原癌基因广泛存在于生物界，在进化过程中高度保守，这类基因属于 A.细胞癌基因 B.病毒癌基因 C.管家基因 D.抑癌基因 E.抗性基因 9.关于生长因子概念的叙述不正确的是 A.与特异性受体结合产生功能 B.主要以旁分泌和自分泌方式起作用 C.生长因子受体存在细胞核内 D.其化学本质属于多肽 E.与癌基因有密切关系 10.Sanger双脱氧末端终止测序法的链终止剂是 A.2’，3’—二脱氧核糖核苷酸 B.2’，4’—二脱氧核糖核苷酸 C.3’，5’—二脱氧核糖核苷酸 D.3’，4’—二脱氧核糖核苷酸 E.2’，5’—二脱氧核糖核苷酸 11.目前普遍采用Southern印迹杂交进行DNA指纹分析，用于法医案检工作中的个体识别和亲子鉴定，其分子基础是 A.肽链的多态性 B.RNA的多态性 C.氨基酸残基多态性 D.DNA的多态性 E.表型的多态性 12.人类基因组包括 A.核基因组和线粒体基因组 B.核基因组和微粒体基因组 C.溶原态病毒基因组和核基因组 D.质粒基因组和核基因组 E.只含核基因组 13.下述哪项决定基因表达的时间性和空间性 A.特异基因的启动子（序列）和增强子与调节蛋白的相互作用 B.DNA聚合酶 C.管家基因

高通量测序相关名词

高通量测序相关名词 高通量测序时，在芯片上的每个反应，会读出一条序列，是比较短的，叫read，它们是原始数据； 有很多reads通过片段重叠，能够组装成一个更大的片段，称为contig； 多个contigs通过片段重叠，组成一个更长的scaffold； 一个contig被组成出来之后，鉴定发现它是编码蛋白质的基因，就叫singleton； 多个contigs组装成scaffold之后，鉴定发现它编码蛋白质的基因，叫unigene。 测序深度（Sequencing Depth）：测序得到的碱基总量（bp）与基因组大小（Genome）的比值，它是评价测序量的指标之一。测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。重测序的个体，如果采用的是双末端或Mate-Pair方案，当测序深度在10~15X以上时，基因组覆盖度和测序错误率控制均得以保证。 什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序）

Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分

生物信息学名词解释

行者 【转载】生物信息学名词解释----这个比较全 什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深 度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同 位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing）全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以 及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利 用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析 能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序（whole exon sequencing）

PCR及其改进技术在食品检测中的应用

PCR及其改进技术在食品检测中的应用Application of PCR and PCR improved technology for detection in foods 刘辉1，杨利平1，2，张滨1* Liu Hui1,Yang Liping1,2,Zhang Bin1* （1．长沙环境保护职业技术学院，长沙410004；2．湖南师范大学生命科学学院，长沙410081） (1.Changsha Environmental Protection and Professional technique College,Changsha410004,China; 2.Department of life science,Hunan normal university.Changsha410081,China) 摘要：在介绍传统PCR的基础上，简介实时定量PCR、多重PCR、PCR-DGGE等几种常用的PCR改进技术在食品检测方面的应用。 关键词：PCR改进技术；传统PCR；食品检测 Abstract:The methods were rapidly upgraded for detection in foods when the factors of food-pollution became more and more complicated.PCR improved technology gradually replace the role of traditional PCR for detection in foods.In this paper,we introduced the application of three PCR improved technologies for detection in foods on the base of introducing traditional PCR. The three PCR improved technologies include real-time PCR,MULTIPLEX-PCR and PCR-DGGE. Key words:Traditional PCR;PCR improved technology;Detection in 近年来,随着我国社会经济的快速发展，人们的生活得到很大改善，对食品质量的要求也越来越高。加入WTO以后，国外对我国出口食品的质量要求也越来越严格。食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题，随着食品生产的工业化和新技术、原材料、新产品的采用，食品污染的因素日趋复杂，因此食品安全检测的方法也需日新月异。自从1985年问世以来，PCR（Polymerase Chain Reaction）技术因其灵敏、快速、操作简便的优点，在食品检测领域具有广泛的应用。但是传统PCR检测技术一直面临着假阳性污染和定量准确度两大难题，用传统的PCR检测技术都依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，而这些处理过程很容易使数量巨大的PCR产物飞散到空气中形成气溶胶，使PCR假阳性污染成为可能，而且电泳所用染色剂EB（溴化乙锭）为强烈致癌物质，容易危害操作者的健康。近年来，PCR改进技术在食品检测中的应用研究得越来越多，本文将简介几种PCR改进技术在食品检测中得应用研究进展。 1传统PCR技术在食品检测中的应用及其缺点 PCR（Polymerase Chain Reaction）技术即聚合酶链式反应技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。该技术自从1985年问世以来，最早应用于基因克隆和转基因检测，但由于其精确、微量的特点，已经广泛应用到其他领域。随着对一些主要食品微生物遗传性质了解的逐渐深入，许多致病菌的遗传背景进一步明了，PCR技术在食品检测中也逐渐显示出其应用前景[1]。近年来，PCR技术在食品检测中的应用主要体现在如下几个方面： 基金项目：长沙环境保护职业技术学院生物化学精品课程建设项目资助（项目编号：？） 作者简介：刘辉(1976-),女,长沙环境保护职业技术学院讲师。Email:? *通讯作者，张滨

高通量测序常用名词解释

什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP 缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序（whole exon sequencing） 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。 什么是mRNA测序（RNA-seq） 转录组学（transcriptomics）是在基因组学后新兴的一门学科，即研究特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA（包括mRNA和非编码RNA）的类型与拷贝数。Illumina 提供的mRNA测序技术可在整个mRNA领域进行各种相关研究和新的发现。mRNA测序不对引物或探针进行设计，可自由提供关于转录的客观和权威信息。研究人员仅需要一次试验即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，并分析基因表达、cSNP、全新的转录、全新异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。简单的样

分子生物学试题

分子生物学试题 1．的特点不包括 A. 只需微量模板 B. 只需数小时 C. 扩增产物量大 D. 底物必须标记 E. 变性、复性、延伸三个步骤循环进行 2．目前检测血清中乙肝病毒最敏感的方法是A．斑点杂交试验 B．等位基因特异性寡核苷酸分子杂交 C．印迹 D．法 E．印迹 3．聚合酶链式反应扩增的大小取决于 A. 聚合酶 B. 引物 C. 模板 D. 循环次数 E. 三磷酸脱氧核苷 4．目前法医学中主要应用的基因诊断方法是A．基于印迹的操作 B．检测 C．基于的指纹技术

D．分析 E．变性高效液相色谱分析 5. 分子生物学检验技术主要包括那些技术?（） A. 核酸分子杂交技术 B. 测序技术 C. 技术 D. 重组技术 E. 以上全是 6. 下列哪项检测需应用分子生物学检验技术?（） A. 肝功能检测 B.乙肝两对半检测 C. 乙肝病毒()检测 D. 肿瘤细胞培养 E. 病原微生物培养 7.. 中，若以()为引物合成第一链，需要的模板是 B. C. D. E. 8核酸分子杂交的原理是 A．磷酸化 B．甲基化

C．抗原抗体结合 D．配体受体结合 E．碱基互补配对 9. 在提取和纯化过程中,为避免污染而导致的降解,应采取 （） A. 在洁净的实验室里操作 B. 带手套和口罩 C. 所用器材高压消毒或处理 D. 冰浴下操作 E. 以上皆是 10．技术容易出现 A．假阴性结果 B．假阳性结果 C．灵敏度不高 D．适用不广 E．操作繁冗 11.指出下列哪个是抑癌基因 A.生长因子 B.蛋白激酶 53 D. E. 以上都不是 12.以下哪一种不是癌基因产物（）

PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测

实验五 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 一、实验目的 1. 掌握PCR扩增技术的基本原理 2. 掌握PCR的常规操作 3. 熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用 4. 了解PCR技术的应用 5. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法 6. 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素 二、实验原理 1. PCR基本原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2. PCR反应体系 3. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA 片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的

PCR_技术的种类及其应用

PCR 技术的种类及其应用 1 PCR 技术的基本原理 PCR 技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下, 依赖于DNA聚合酶(T aq 酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。 2PCR技术的种类 2.1 反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技术 原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I)NA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。 该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶 切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。 2.2锚定PCR(Anchored PCR, APCR)技术 用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。 应用：它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。 2.3不对称PCR(asymmetric PCR)技术 两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。 应用：可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。 2.4反转录PCR(reverse transcription, RT- PCR)技术 当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT - PCR应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。 2.5修饰引物PCR技术 为达到某些特殊应用目的, 如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等, 可在引物的5’-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等。 2.6巢式PCR(NEST PCR)技术 先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二 次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR( drop-in, drop-out PCR)。上述三种方法主要用于极少量DNA模板的扩增。 2.7等位基因特异性PCR(Allele- specificPCR, ASPCR)技术 ASPCR依赖于引物3’- 端的一个碱基错配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板复合物的热稳定性。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。 2.8单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)技术SSCP- PCR是根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来