芳香族化合物降解菌PM8的分离鉴定及降解特性

几种真菌的分离与鉴定教学文案

常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。

石油降解菌的分离

从环境样品中分离筛选石油 降解菌的方案

引言 随着经济技术的迅速发展，石油日渐成为我过的主要能源，且需求量日益增大。研究表明，石油生产和运输环节会对土壤造成严重污染，且污染面积不断扩大。目前，我国石油行业每年产生的含油污泥多大八十万吨。由于石油的粘度大、粘滞性强，会再短时间内形成小范围的高浓度污染，长期的石油污染还会影响土壤的通透性，减少土壤肥力，阻碍植物生长。同时，石油中所含的多环芳香烃具有“三致”效应，一些挥发组分能引起人体麻醉、窒息和化学性肺炎等疾病。因此，石油污染对土壤生态系统的平衡和人体健康都有很大的危害。 目前，针对石油污染治理的方法主要包括：物理方法、化学方法以及生物修复法，但物理方法修复费用较高，耗材较多：化学方法会使用大量化学淋洗剂，很容易造成二次污染。相较而言，微生物修复技术由于生产费用低、不产生二次污染等特点而被视为一项最具有应用前景的修复技术。而且随着分子生物学的发展，无论是DNA文库的建立，还是多态性分析方法的进步，都为污染物的生物修复提供了全新的技术支持。既然生物修复法有诸多优点，那么就应该充分发挥其特性。本文则是着眼于环境样品，分离筛选其中的石油降解菌，以扩大培养进行更大规模的石油降解。 摘要 在长期被石油污染的土壤中，微生物可逐渐改变自身的代谢条件以适应环境。即以石油烃为碳源进行生长、繁殖，同时将石油烃降解。因此在这种土壤中存在着可降解石油烃的微生物，但石油烃降解菌的筛选、分离是生物法处理石油污染的关键。从这个角度考虑，以长期石油污染的土壤中微生物为菌源，从中筛选、分离出高效的石油烃降解菌。要降解哪里的石油就用哪里的土壤培养石油降解菌。目前，国内对极端条件下石油降解微生物研究较少，尤其是对低温、耐盐的石油降解菌，中国北方的大部分湿地，盐碱程度比较高，成年气温较低。无论是来源于海上还是来源于石油化工的污染都比较严重。本文针对大连开发区因石油泄露而被污染的白石湾，就地选取材料进行石油降解菌的筛选以及分离研究。

石油烃类的微生物降解研究

石油烃类的微生物降解研究 石油作为重要能源之一已被世界各国广泛使用，随之而来的石油烃污染已经对人类生存的土壤及水体环境造成了严重的危害，微生物降解是一种处理石油烃污染的理想方法。综述了降解菌种类和不同烃类的微生物代谢途径，分析了包括温度、营养物、氧和pH值等环境因素对石油烃降解的影响，为进一步的研究应用提供参考依据。 随着工业和经济的发展，人类对能源的需求日渐增多，促进了石油工业的飞速发展；在石油生产、贮运、炼制加工及使用过程中，不可避免地会有石油烃类的溢出和排放，造成土壤及水体的石油污染。据统计全球每年倾注到海洋的石油总量在200~1000万t之间。辽宁省环境中心监测站的化验结果显示，在辽河油田的重度污染区内，土壤中的含油量已达到10 000 mg／kg以上，是临界值(200 mg／kg)的50多倍，严重影响了油田附近的生态环境。 石油烃类物质引起的环境污染越来越引起人们的关注。利用物理、化学方法处理石油烃可以得到较受到了限制翻。生物处理方法是近年来发展起来的，具有处理效果好、费用低、对环境影响小、无二次污染及应用范围广等优点，是迄今为止处理石油烃污染比较好的一种方法。 1.降解石油烃类的微生物种类 国外在20世纪40年代就开展了细菌降解石油烃的研究，我国这方面的研究始于20世纪70年代末期。研究表明，在土壤和水体环境中存在着大量能够降解石油烃的微生物，主要是细菌和真菌；细菌在海洋生态系统的石油烃类降解中占主导地位，而真菌则是淡水和陆地生态系统中更为重要的修复因子。石油烃降解菌和藻类见表1。

大量研究表明，当菌群处于石油污染环境中时，利用烃类化合物的微生 物数量急剧增长，尤其是含降解质粒的微生物。Atlas报道在正常环境下降解菌一般只占微生物群落的1％，而当环境受到石油污染时，降解菌比例可提高到10％。含质粒细菌在石油烃污染环境中出现的频率和数量LL-t~污染环境高，说明质粒在石油烃的降解中可能起着重要作用。降解质粒的存在为降解工程 菌的构建提供了可能。 2.石油烃类的微生物代谢途径 2.1 直链烷烃 通常认为饱和烃在微生物作用下，直链烷烃首先被氧化成醇，醇在脱氢 酶的作用下被氧化为相应的醛，然后通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸；氧 化途径有单末端氧化、双末端氧化和次末端氧化[7]。在转化为相应的脂肪酸后，一种转化形式为直接经历随后的／3一氧化序列，即形成羧基并脱落2个 碳原子；另一种转化形式为脂肪酸先经历60一羟基化形成∞一羟基脂肪酸， 然后在非专一羟基酶的参与下被氧化为二羧基酸，最后再经历一氧化序列

高效石油降解菌的筛选

海洋中高效石油降解菌的筛选 楼浩 04016158

摘要 本研究利用原油为唯一碳源，采用富集培养分离的方法从象山港的表层海水和底泥混合物中筛选到两株石油降解菌株F3和F4。通过检测，两种菌株在油浓度为2000mg·L-1、温度为28℃的条件下培养七天后，降解率分别达到了48.1%和51.3%，与目前已筛选出的海洋石油降解菌相比较，F3、F4均属于降解率较高的菌株。本研究还对营养盐、原油浓度等影响F3、F4菌株生长和降解率的相关因素进行了初步探讨。结果表明：①氮、磷营养盐在较大程度上限制了F3、F4菌株对原油的降解率，是主要的限制因子。在氮磷浓度≥1.0m g·L-1时，F3菌株才能达到最大的降解效率48.1%，在氮磷浓度≥1.5m g·L-1时，F4菌株才能达到最大的降解效率57.3%。②F4菌株的降解率随原油浓度的降低而增加。在原油浓度为400mg·L-1时，F3、F4菌株的降解率分别达到57.6%和61.5%，而在油浓度为4000 mg·L-1时，F3、F4菌株的降解率仅为27.5%、11.2%，相比之下F3菌株对原油浓度的耐受能力更强。 关键词：石油降解菌；筛选；原油降解率；氮磷营养盐；原油浓度

ABSTRACT The use of oil as the sole carbon source, using enrichment culture method from the surface water and sediment which in the Xiangshan Port isolated two strains of oil degradation, Named as F3 and F4. To detect these two strains in the oil concentration was 2000mg/L, the temperature is 28℃ training seven days ,The degradation rate respectively reached 48.1% and 51.3%, compared with that which has been selected marine oil degrading bacteria, F3, F4 belong to the higher efficiency degradation of crude oil strain. The issue also conducted a preliminary test about nutrients, oil concentration and so on which Impact F3, F4 strain growth and the degradation efficiency. The results showed that: ①nitrogen and phosphorus nutrient limitation to a greater extent on the F3, F4 strains degradation efficiency , is the main limiting factor. In the concentration of nitrogen and phosphorus ≥ 1.0mg/L, F3 strain to achieve normal degradation efficiency 48.1%, the concentr ation of nitrogen and phosphorus in ≥ 1.5 mg/L, F4 strains to reach the degradation efficiency is 57.3%. ② the degradation of the F4 strain increasing when the concentration of oil reduced. in the concentration of 400 mg/L, The degradation rate of F3, F4 strains respectively reached 57.6% and 61.5%, the concentration of oil in the 4000mg/L, The degradation rate F3, F4 strains of was only 27.5%, 11.2%, but compared with F4, F3 strains better adapted to the higher concentration of oil. Key Words: Petroleum Degrading strains; Screening;Degradation of oil;nutrients of nitrogen and phosphorus; Oil concentration

石油烃降解菌的研究【文献综述】

文献综述 食品科学与工程 石油烃降解菌的研究 [摘要]石油烃降解菌，是一种能在油水表面上生长而降解石油的微生物，因土壤和近海中含有丰富的N、P等营养原料，所以在近海和土壤中的石油烃降解菌的密集度较高，然而，由于远海中会缺乏N、P等营养物质，所以石油降解菌的繁殖受到一定的制约。当海水一旦受到石油的污染后，降解菌就不能很快消除污染物，所以培养适应能力和降解率高的石油降解菌是解决石油污染的主要方法。 [关键词]石油污染；石油烃降解菌；石油烃（TPH），微生物 作为现代工业的关键燃料和原料，石油及其加工品广泛应用在生产和生活的各个领域，包括工业、军事、交通等各行业，但是随着石油工业的快速发展,石油同时也成为海洋环境的主要污染物.据初步统计,由于各种原因,全世界每年有约1.0×107t的石油进入海洋环境中,我国每年排入海洋的石油达1.15×105t[1]。 由于工艺水平的限制和处理技术的落后，大量含石油类的废水、废渣不可避免的被排入到生态环境中，严重了影响整个生态系统，尤其是土壤和海洋系统。虽然石油在人类社会发展提供有力的能源来源，但伴随带来的环境污染问题也日益加剧。土壤，是人类赖以生存的重要自然资源之一，要对受石油污染土壤进行完整的治理，并使它在短时间内达到可耕作的标准水平，对于保护生态环境、实现农业和工业的可持续发展具有非常重要的意义。在污染土壤的各种治理的方法中，微生物修复法对环境破坏性小而且消费低而受到人们的重视，近年来的发展尤为迅速，在一定程度上为污染土壤的修复带来技术上的更新，也为解决石油污染问题带来新的希冀。但是，从污染性质来看，即使油井关闭后，其对环境的影响仍会持续相当长的时间[2]。这些都引起了社会各界的普遍关注,近年来，从中央到地方各大主要媒体对这一问题均作了大量专题报道[3]。 一、土壤石油污染的来源 石油污染,一般指原油的初级加工产品(包括汽油、柴油等)以及各类石油的分解产物所造成的污染。在石油的开采、加工和使用的过程中，造成的石油溢出和泄漏，对环境（空气、土壤、海洋等）产生极大的负面影响。而土壤是作为物质流动和能量循环的重要环境，常常是污染物迁移、停留和积累的最终承受者。 石油污染物主要是通过五种方式进入到土壤中：⑴原油的泄漏和溢油意外引起的落地原油污染；⑵含油的矿渣、污泥和废物的堆放，导致石油向土壤渗透并向四周扩散；⑶使用含油污水灌溉农田；⑷汽车尾气的排放所产生的气态石油类污染物渗入到土壤中；⑸药剂污染，即作为各种杀虫剂、防腐剂的溶剂和乳化剂等的石油类物质随药剂使用而进入到土壤中。在这些因素中，前三个因素是引起土壤石油污染最主要的原因，造成污染的面积

微生物对石油烃的降解机理研究

云南化工Yunnan Chemical Technology Sep.2018 Vol.45，No.9 2018年9月第45卷第9期 石油是一种重要的能源，可以说是现代经济的血液。日常生活、工业生产、航天军工都需要石油作为能源和原料，是国家生存和社会发展不可或缺的战略资源。但是，与此同时石油在开采、运输、储存、加工和利用过程中的各种泄漏事故对环境造成的污染和破坏也是不可估量的，其对人类和其他生物的生存和发展也造成一定的威胁，并已成为全球范围内亟待解决的重要问题。了解石油烃污染物在自然界的生物降解转化规律，研究石油烃污染物微生物降解的技术和方法，培养可高效降解石油烃的工程菌，消除和减少石油烃在环境中的滞留，将有利于维护和创造高质量的人类生存环境。 1　石油烃降解菌的降解机理 微生物对石油中不同烃类化合物的代谢途径和机理是不同的。饱和烃包括正构烷烃、支链烷烃和环烷烃。通常认为，在微生物作用下，直链烷烃首先被氧化成醇，源于烷烃的醇在醇脱氢酶的作用下被氧化为相应的醛，醛则通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸。相同条件下，一般微生物对不同种类石油烃降解的倾向先后顺序是不同的。一般而言，石油烃被微生物降解的先后规律为：直链烷烃>支链烷烃>环烷烃>多环芳烃>杂环芳烃。在某石油烃降解菌修复不同碳链石油烃污染的研究中得出结论，该菌属对短链石油烃的分解率相对较高，而对芳香烃和润滑油组分的降解率较短链石油烃低。一般微生物降解正烷烃由氧化酶酶促进行。正烷烃第一步氧化为醇后，醇氧化成醛，醛再转化为相应脂肪酸，脂肪酸经 β-氧化为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进入三羧酸循环，分解成CO2和H2O，或进入其他生化过程。另外，链状烷烃可经脱氢步骤转变为烯烃，烯经氧化成为醇，然后醇可转化为醛，最后醛变为脂肪酸；链状烷烃还可通过直接氧化成烷基过氧化氢，然后经脂肪酸途径进行降解。有的可通过亚末端氧化成仲醇，再变成伯醇或脂肪酸进行氧化分解。还有些微生物可将烯烃变为不饱和脂肪酸，通过双键位移或甲基化等，变为支链脂肪酸，再进行降解。 2　石油烃降解菌的种类 2.1　普通石油烃降解菌 在受石油污染的土壤和水环境中存在许多能降解石油烃的微生物，细菌、放线菌、真菌、酵母、霉菌和藻类中均有能降解石油烃的微生物，据研究表明目前发现100余属、200多种石油烃降解微生物。不同种类的微生物对石油烃的降解能力不同，通常细菌比真菌、放线菌对原油的降解能力强。细菌中降解石油烃的主要有无色杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属、芽孢杆菌属、诺卡氏菌属以及微球菌属等。 2.2　特殊石油烃降解菌 2.2.1　低温石油烃降解菌 低温微生物在地球上广泛存在，一般分布于南北极、海洋深底、高原冰川以及冻土地区等低温环境中。目前发现的低温微生物种类繁多，通常为真细菌、酵母菌、蓝细菌、单细胞藻类等，这些微生物正逐渐引起科学家的广泛重视[1]。随着石油污染问题日益突出和国内外对低温石油烃降解菌研究的深入，低温石油烃降解菌修复 doi：10.3969/j.issn.1004-275X.2018.09.081 微生物对石油烃的降解机理研究 李　洲 （西安石油大学，陕西　西安　710065） 摘　要：随着工业和经济的发展，环境问题成为人们普遍关注的焦点，石油污染成了不可忽视的问题。微生物修复作为一种新型环保的生物修复技术，已成为石油污染生物修复的核心技术。对石油降解微生物的种类即细菌、蓝藻、真菌以及藻类进行了总结，对微生物对石油烃的降解途径与降解机理进行了综述。 关键词：微生物；石油烃；降解机理 中图分类号：X74 文献标识码：A 文章编号：1004-275X（2018）09-179-02 Study on the mechanism of microbial degradation of petroleum hydrocarbons Li Zhou （Xi’an Petroleum University，Xi’an 710065，China） Abstract：With the development of industry and economy，environmental problems have become the focus of attention，and oil pollution has become a problem that can not be ignored.As a new environmental protection bioremediation technology，microbial remediation has become the core technology of bioremediation of petroleum pollution.The types of petroleum-degrading microorganisms such as bacteria，cyanobacteria，fungi and algae were summarized.The pathways and mechanisms of petroleum hydrocarbon degradation by microorganisms were reviewed. Key wordss：microorganism；petroleum hydrocarbon；degradation mechanism；research ·179·

蒋勇 石油烃降解微生物研究进展

一前言 石油给人们带来巨大的利用价值和经济利益的同时,也对生态环境造成了巨大的威胁。在勘察、开采、运输以及储存过程中,油田周围大面积的受到严重污染。石油污染使得土壤理化性质发生改变,从而不利于农作物正常生长，石油类物质还通过地下水的污染以及污染的转移构成对人类生存环境多个层面上的不良胁迫。因此,治理石油污染具有重要意义。当今世界，治理石油污染具体措施中最安全、最环保、最经济的方法是生物修复技术，石油降解菌是一类具有分解矿化石油烃能力的微生物，在石油污染的生物修复中具有重要作用。本文就石油污染物生物降解方面的研究进行了综述及展望。

二本论 2．1 石油降解和菌的种类和分离 2．1．1石油降解和菌的种类 国外在20世纪40年代就开展了细菌降解油污的研究[1]，我国这方面的研究始于20世纪70年代末期[2]。已知降解石油的微生物共有70属200余种。细菌有28个属，霉菌30个属，酵母12个属。能够降解石油烃的细菌有假单胞菌属（Pseudomonas)、弧菌属（Vibrio）、不动杆菌属（Acinetobacter）、黄杆菌属（Flavobacterium）、气单胞菌属（Aeromonas）、无色杆菌属（Achromobacter）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae)、棒杆菌属（Coryhebacterium）、节杆菌属（Arthrobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、微球菌属（Micrococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、诺卡氏菌属（Nocardia）等；酵母菌有假丝酵母属（Candida）、红酵母菌属（Rhodotorula）、毕赤氏酵母菌属（Pichia）等；霉菌有青霉属（Penicillium）、曲霉属（Apergillus）、镰孢霉属（Fusarium）等[3]。 2．1．2 石油降解和菌的分离 石油降解菌一般从受石油污染的土壤、水中进行分离并筛选，为了进一步的应用，还要进行驯化。根据研究目的与要求不同，在筛选时往往控制不同的条件从而得到不同功能的菌落。以烷烃为底物筛选出的菌落，对烷烃的去除效率会较高，由于烷烃相对于芳烃较易分解，且大部分的石油降解菌对烷烃的降解效果均较好，因此专门以烷烃为底物进行的研究不多见，郑金秀[4]以烷烃为底物培养出分属于不同菌属的菌落，其中不动细菌菌属的菌株降解率为69%，芽孢杆菌属的菌株降解率为71%，假单胞菌属的降解率可达73%；以环烷烃为底物，得到不动细菌菌属与芽孢杆菌属的菌株，石油降解率均为67%。两种底物研究降解时间均为48h。由于芳香烃及多环芳烃降解难度大，且其危害比较大，对降解芳烃的研究比较多。 2．2 石油降解菌的降解机理与影响因素 2．2．1石油降解菌的降解机理 微生物对石油的降解作用存在选择性,优先消耗碳链长度中等(C10—C24)的n-链烷烃类分子，其规律为:小于C10的直链烷烃>C10—C24或更长的直链烷烃>单环芳烃>环烷烃>多环芳烃,同种类型的烃类中分子量越大,降解越慢[5]。 通常认为饱和烃在微生物作用下，直链烷烃首先被氧化成醇，醇在脱氢酶的作用下被氧化为相应的醛，然后通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸；氧化途径有单末端氧化、双末

【开题报告】石油烃降解菌的筛选

开题报告 食品科学与工程 石油烃降解菌的筛选 一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义 目前，常有有关石油及其产品的微生物降解方面的研究报道，但对这些研究大多数以分离鉴定微生物种类为主，对混合菌株性能评价以及它们对高含油量的油泥降解研究很少。 作为现代社会的最主要动力燃料与化工原料，石油及其产品广泛应用于生产和生活的各个方面，包括工业、农业、军事、交通运输等各个行业，因此人们将石油称作“黑色的金子”。但是随着石油工业的发展，由于工艺水平和处理技术的限制，在许多环境特别是海洋环境中，石油污染已经成为一个普遍而严重的问题，石油的主要成分是烃类，在一个典型的石油样品中，含有的烃类可达200~300种之多，石油进入海洋后，石油中的一些成分可直接挥发而进入空气；一小部分海洋表面的石油受到紫外线作用可发生光化学分解，但速度极慢；而绝大部分石油要通过微生物的降解作用才得到净化。石油烃降解菌是一类能在油水界面上生长繁殖而降解石油的微生物，在近海、海湾等处，因海水中含有丰富的N、P等营养物质，石油降解菌的数量较多，然而，由于外洋海水中N、P等营养组织的缺乏，石油降解菌的繁殖受到制约，一旦污染，不容易很快消除，所以培养石油降解菌成为治理海上石油污染的主要方式。 而且在污染土壤的各种治理方法中，微生物修复由于具有费用低、处理效果好并且对环境破坏性小等诸多优点而受到人们的重视。所以筛选和培养石油烃降解菌对减轻石油污染是一个非常有意义的事情。 二、研究的基本内容，拟解决的主要问题： 1、降解石油烃的菌类哪些比较常见 2、石油烃降解菌降解石油的情况是怎样，会不会对环境产生二次污染 3、石油烃降解菌降解石油的能力会受环境的哪些因素影响 三、研究步骤、方法及措施： 1.用牛肉膏蛋白胨培养基进行菌种分离纯化与斜面保藏。

病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备

一、实验目的 熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法，了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点，了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。 二、实验材料 患白内障病虎纹蛙（或其他患细菌性疾病的水产动物）、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌（虎纹蛙白内障病的病原） 三、实验药品、用具 2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机（包括离心管）、水族箱、记号笔 四、实验操作程序 （一）病原菌的分离与鉴定 1 ．培养基的制备 （ 1 ）普通肉汤培养基： 按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml 氯化钠 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6 初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待灭菌。 （ 2 ）普通营养琼脂培养基 普通肉汤 1000ml

琼脂 20g 琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后可凝固。在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培养基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％则成半固体培养基。 将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将 pH 调至 7 . 4 ～ 7 . 6 。琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。 加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤，固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布上），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。 盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触，若将瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平皿的合适温度（ 50 ～60 ℃ ），每只灭菌培养皿倒入约 15 ～ 20ml ，将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。 培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。 2 ．病原菌的分离与培养 分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物，病原菌的分离方法如下。 体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。 内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧

动物检验检疫学 实验一 动物病原细菌的分离与鉴定

实验一动物病原细菌的分离与鉴定 一、实验目的 了解动物病原细菌的分离、鉴定的常规程序与基本方法 二、实验原理 初步分离鉴定：利用细菌在特定的选择培养基上的生长特性，观察细菌培养特征； 确定细菌的血清型、毒力因子：血清学检测或PCR检测技术 大肠杆菌的培养特征：37℃,培养24h,各种培养基生长特征： 普通营养琼脂平板：白色圆形，隆起，中等大小 麦康凯琼脂：红色、圆形、隆起、光滑、湿润、边缘整齐、中等大小 糖铁琼脂斜面培养基：底层变黄，产酸产气 伊红美蓝培养基：黑色、金属光泽 革兰氏染色：革兰氏阴性、分散或成对排列、两端钝圆的短杆菌 血清学鉴定：玻片凝集实验：颗粒性抗原与相应抗体结合出现凝集沉淀。大肠杆菌中，为了避免K抗原对O抗原凝集的抑制作用，利用O抗原的耐热性高于K抗原，实验前进行、高压或煮沸处理。 三、实验材料 1）材料：可疑病料，需提前三天提供小鼠 2）菌株：致病性大肠杆菌菌株 3）试剂：营养肉汤、营养琼脂、CT-SMAC琼脂、TSI琼脂、伊红美蓝琼脂培养基、IMViC、大肠杆菌O157标准血清、生理盐水、吉姆萨染色液、酒精或棉球。 4）仪器：显微镜、37℃恒温培养箱、酒精灯、接种棒、剪刀、镊子、载玻片、记号笔、口罩、手套。 四、操作步骤 1.分离培养 第一天： 1.）处死小鼠，无菌解剖 2.）观察各脏器是否出现肉眼病理变化； 3.）无菌采集内脏病料，通过无菌操作划线接种于普通琼脂平板、改良山梨醇麦康凯（CT-MAC)琼脂平板各一块，37℃培养24h； 4.）同时无菌挑取一小块病料，直接涂片，吉姆萨染色，油镜观察组织中的细菌特征； 第二天 5.）挑取CT-SMAC典型单个菌落分别接种于TSI琼脂斜面、伊红美蓝琼脂和营养肉汤，37℃培养24h。挑取普通培养基上的菌落进行糖类发酵和IMViC生化实验。 糖（醇）类发酵实验：接种两只葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基，麦芽糖发酵培养基，一支接种，一支对照；接好后置于37℃温箱中培养24h。 吲哚（Indol）试验：接种到胰蛋白胨水（含色氨酸）培养基中，37℃培养24-48h。 甲基红（Methyl red)试验：将菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h。 VP(PVoges-Proskauer)试验：将菌种接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h。 硫化氢试验：将菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，37℃培养24h。 柠檬酸盐试验（Citrate utilization）：取少量菌种接种到柠檬酸盐培养基上，37℃培养24h。 第三天 １.观察现象，滴定检验

病原细菌的分离与鉴定

病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海，宽容作舟，泛舟于海，方知海之宽阔；生活如山，宽容为径，循径登山，方知山之高大；生活如歌，宽容是曲，和曲而歌，方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定 发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ] 一、实验目的 系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。 二、知识背景 细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项： 1．病料采集 （1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为： ①全身感染→血液及内脏； ②局部感染→病患部位； ③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织 （2）病料的采集时间也应特别注意： ①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化； ②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。 2．无菌操作 无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可

病原菌的分离鉴定

竭诚为您提供优质文档/双击可除 病原菌的分离鉴定 篇一：常见病原菌采样分离过程 金黄色葡萄球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）奶样的采集： 采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前LF、左后Lh、右前RF、右后Rh编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。 （2）乳房皮肤拭子 用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话先檫掉土。拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。 （3）鼻腔拭子 用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有 0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入冰盒中，迅速带回实验室

处理。 菌种的初步分离 首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（bhI）肉汤35℃培养18小时左右。 需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察，因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80℃（长期）或-20℃（临时）冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 肠球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）肛门拭子 以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅

肠道致病菌的分离与鉴定

肠道致病菌得分离与鉴定 一、实验目得 （1）掌握肠道致病菌得分离、鉴定得主要步骤 （2）掌握平板划线分离法 （3）掌握玻片凝集试验得操作方法以及实际意义 二、实验材料 （1）实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、（2）实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基（EMB）、克氏双糖铁培养基（KIA）、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基 三、实验流程 （1）肠道致病菌得分离 ①待测标本得制作：把接种环放置于点燃得酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌得接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水得试管中，混匀。 ②细菌得分离接种：用接种环取适量配置好得细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMB培养基。将培养基置于37℃培养18~24小时。 （2）肠道致病菌得纯化 ①单菌落接种：从已培养待测细菌得EMB培养基上用已灭菌得接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37℃培养18~24小时。 ②待测细菌得初步判断：取出已纯化培养待测细菌得KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌就是致病菌或就是非致病菌。

（3）肠道致病菌得鉴定 ①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内得小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌得接种针取已培养得KIA培养基上得培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37℃培养18~24小时。取出并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ②动力检查：用已灭菌得接种针取KIA培养基上得培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37℃培养18~24小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌得接种环分别取KIA培养基上得培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻摇动玻片，经1~2min观察两格中有无凝集现象。注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧得酒精灯附近进行实验操作。 四、实验结果与分析 （1）EMB培养基现象与分析： ①培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面有细菌明显蔓延生长。 ②分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基中得物质并产出硫化氢气体，由于培养基中含铁，因而硫化氢能够与

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肠道致病菌的分离与鉴定 一、实验目的 (1)掌握肠道致病菌的分离、鉴定的主要步骤 (2)掌握平板划线分离法 (3)掌握玻片凝集试验的操作方法以及实际意义 二、实验材料 (1)实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、 (2)实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基(EMB、克氏双糖铁培养基(KIA)、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基 三、实验流程 (1)肠道致病菌的分离 ①待测标本的制作：把接种环放置于点燃的酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌的接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水的试管中，混匀。 ②细菌的分离接种：用接种环取适量配置好的细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMBt养基。将培养基置于37C培养18~24小时。 (2)肠道致病菌的纯化 ①单菌落接种：从已培养待测细菌的EMB培养基上用已灭菌的接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37 C培养18~24小时。 ②待测细菌的初步判断：取出已纯化培养待测细菌的KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌是致病菌或是非致病菌。

（3）肠道致病菌的鉴定 ①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管 内的小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌的接种针取已培养的KlA 培养基上的培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37 C培养18~24小时。取出并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ②动力检查：用已灭菌的接种针取KIA培养基上的培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37 C 培养18~24小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基 中，并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌的接种环分别取KIA培养基上的培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻摇动玻片，经1~2min观察两格中有无凝集现象。注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧的酒精灯附近进行实验操作。四、实验结果与分析 （1）EMB培养基现象与分析： ①培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面有细菌明显蔓延生长。 ②分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基中的物质并产出硫化氢气体，由于培养基中含铁，因而硫化氢能够与其结合成硫化铁，出现黑色现象；而上部因重力含铁量较少，产生的硫化氢气体又部分挥