高效液相色谱法测定蜂蜜中_呋喃果糖苷酶酶活
蜜蜂杂志(月刊)JOURNAL OF BEE （Monthly ）NO.122011Dec.
收稿日期：2011-09-26
作者简介：王介平(1980-)，男，硕士，研究方向为蜂产品安全与质量控制。通讯作者：王永亮。
●实验研究报告
高效液相色谱法测定蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶酶活
王介平，郭
军，陈杨，王海燕，李睿，王永亮
(重庆市畜牧科学院，重庆
荣昌
402460)
摘要：建立了一种检测蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶酶活的方法，即样液中加棉籽糖作为反应底物，在pH 为5.4的缓冲液中，45℃摇床200r/m in 条件下反应2h ，测定样液中的密二糖含量。色谱条件为：Phenom enex N H 2L uan 5U 250×4.60m m ；流动相：乙腈∶水=80∶20；进样量：10μL ；流速：1.2m L /m in ；柱温：40℃；示差折光检测器，温度40℃。实验结果表明：β-呋喃果糖苷酶酶活在0.3～1.7U /m L 范围内线性良好，相关系数R 为0.99810。相对标准偏差为1.72%(n =5)，平均回收率为94.5%。该分析方法简便、准确、灵敏，重现性好，适用于蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶酶活的检测。
关键词：掺假蜂蜜；液相色谱法(H PL C )；β-呋喃果糖苷酶；棉籽糖
中图分类号：S896.8
文献标识码：A
文章编号：1003-9139(2011)12-0021-03
Assay of Beta-fructofuranosidase Activity in
Honey by High Cerformance Liquid
Chromatography
W A N G Jie-ping,G U O Jun,C H EN Y ang,W A N G H ai-yang,L I R ui,
W A N G Y ong-liang
(C hongQ ing A cadem y of A nim al Sciences,R ongchang,
C hongqing 402460,C hina)
Abstract:W e analyzed t he concent rat ion of m elibiose in t he sam ple solut ion,w hich react ed 2h af t er add raf f inose as react ion subst rat e (react ion condit ions:pH 5.4buf f er so-lut ion,45℃shaking t able 200r/m in).A t last ,A m et hod w as de-veloped f or t he det erm inat ion of bet a-f ruct of uranosidase act ivit y in honey.The sam ple w as separat ed w it h N H 2colum n (250×4.60m m ,5u)at 40℃,w
hich w as t hen elut ed w it h 80%acet onit rile aqueous solut ion at a rat e of 1.2m L /m in,and t he signal w as det ect ed by R ID .The result s show ed t hat t he linear range f or bet a-f ruct of uranosidase act ivit y w ere in t he range of 0.3-1.7u/m L w it h a correlat ion coef icient of 0.99810.The relat ive st andrd deviat ions f or bet a-f ruct o-f uranosidase act ivit y w ere 1.72%(n =5)and t he average re-coveries w ere 94.5%.This m et hod is sim ple,accurat e,sensi-t ive and bet t er reproducibilit y.
Key words:honey adult erat ed ；high perf orm ance liquid
chrom at ography ；bet a-f ruct of uranosidase ；raf f inose
β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidas)又称蔗糖酶或转化酶，广泛地存在于生物界，最新研究表明，β-呋喃果糖苷酶主要来自真菌、酵母菌和细菌等微生物[1]。该酶可将蔗糖水解为果糖和葡萄糖[2]，也可将棉籽糖水解成密二糖和果糖[3]，在工业上常应用于果糖和低聚果糖的生产[4-8]。
目前，蜂蜜掺假现象十分严重，尤其以掺入以陈米为原料生产的果葡糖浆为甚。陈米淀粉经糖化工艺处理后，加入β-呋喃果糖苷酶进行酶解生产果糖，由于β-呋喃果糖苷酶催化反应底物后，本身还是留在反应体系中，因此，在掺入这种果糖后的蜂蜜中就有β-呋喃果糖苷酶残留，而在天然蜂蜜中不含有该酶。在国内，本研究选用棉籽糖作为反应底物，利用掺假蜂蜜中的残存的β-呋喃果糖苷酶催化棉籽糖生成密二糖和果糖，用高效液相色谱方法检测密二糖的含量，确定β-呋喃果糖苷酶在蜂蜜样品中的酶活[9-16]。从而为鉴别掺假蜂蜜提供有力的技术支撑。1材料与方法
1.1材料与试剂
纯正蜂蜜样品：杭州天厨蜜源保健品有限公司蜂场自产；对照蜂蜜样品：超市购买；β-呋喃果糖苷酶（酶活为349.7U/mg ）：SIGM A 公司产品；D-(+)-五水棉子糖和D-(+)-密二糖为Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；乙腈（色谱纯），SIGM A 公司。
1.2仪器与设备
岛津LC-20A 液相色谱，配备LC-20AT 泵，RID-10A 示差检测器，CTO-20A 柱温箱，SIL-20A 自动进样器，CBM -20A 系统控制器，DGU-20A5在线脱气器，日本岛津仪器。电子分析天平（AB204-S ），梅特勒-托利多仪器公司；电热恒温水浴锅（W201S ），上海申生科技有限公司；pH 计（
DELTA320），梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；真空干燥箱（876），上海锦凯科学仪器有限公司；恒温摇床（M S-100），杭州奥盛仪器有限公司。
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JOURNAL OF BEE （Monthly
）蜜蜂杂志(月刊)2011年第12期1.3色谱条件
色谱柱：Phenomenex NH 2柱（Luan 5U 250×4.60mm ）；流动相：乙腈∶水=80∶20；进样量：10μL ；流速：1.2mL/min ；柱温：40℃；示差折光
检测器检测池温度40℃。
1.4方法
1.4.1标准曲线的绘制
取5支试管分别加入25%（W/V ）的棉籽糖标准溶液和pH 为5.4的柠檬酸缓冲液各2mL ，置于45℃摇床中保温10min ，然后分别加入0.02mg/mL 酶溶液50、100、150、200、250μL ，置于45℃摇床200r/min 反应2h 。最后将样品置于100℃水浴中10min 以终止反应。待样品冷却至室温后，用柠檬酸缓冲液（pH=5.4）定容至10mL ，样品通过0.45μm 微孔滤膜过滤后，用HPLC 法测定密二糖峰面积。以酶活为横坐标，密二糖峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。1.4.2蜂蜜样品处理
用试管取25%（W/V ）pH 为5.4的棉籽糖标准溶液2mL 和蜂蜜2g ，同时用试管取柠檬酸缓冲液（pH=5.4）和蜂蜜2g ，置于45℃水浴中预热10min 后，置于45℃摇床200r/min 反应2h 。然后将样品置于100℃水浴中10min 以终止反应。待样品冷却至室温后，用柠檬酸缓冲液（pH=5.4）定容至10mL ，样品通过0.45μm 微孔滤膜过滤后，用HPLC 法测定密二糖峰面积。1.4.3定量方法
将处理后的样品溶液进行液相色谱分析，以保留时间定性，外标法定量，测定蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶酶活。
2结果与分析
2.1标准曲线的绘制与检测限
以1.4.1中所述方法进行液相色谱分析，测定各
样品密二糖峰面积。结果见表1。以峰面积为纵坐标(Y)，酶活(U/mL)为横坐标(X)，作标准曲线，见图1，并进行线性回归。实验结果表明：酶活在0.3～1.7U/mL 范围内线性良好，相关系数R 为0.9981，回归方程为y =75443X +24197。以3倍信号比(S/N)为检出限(LOD)，酶活检出限为20U/kg 。
2.2精密度测定
取对照蜂蜜样品，进行精密度测定，按1.4.2所述方法处理，重复测定5次，记录峰面积。由表2可知β-呋喃果糖苷酶酶活5次重复测定的相对标准偏差（
RSD ）为1.72％，说明该测定方法精密度高。2.3回收率实验
在蜂蜜样品中添加不同体积的酶标准溶液，按1.4.2中所述样品前处理方法进行处理，分别进样10μL ，由回归方程计算回收率和相对标准偏差(RSD)。β-呋喃果糖苷酶的平均回收率为94.5％，RSD =1.14％。结果见表3。
2.4实际样品测定
取3个蜂蜜样品，按1.4.2样品前处理方法处理样品，进样10μL ，按1.3色谱条件进样分析，用外标法定量。结果见表4。
表1标准曲线绘制测定结果
样品号加酶液体积/μL
酶活/u ·mL -1
密二糖峰面积M 1500.349752320M 21000.699475748M 3150 1.0491103503M 4200 1.3988126087M 5
250
1.7485
159063
表3添加回收率实验结果（n =5
）样品号加入量/U ·mL -1测出量/U ·mL -1回收率/%平均回收率/%相对标准偏差
（RSD ）%H500.34970.326493.3H1000.69940.668395.6H150 1.04910.996795.094.5
1.14
H200 1.3988 1.303493.2H250
1.7485
1.6726
95.6
表4
蜂蜜样品测定结果
样品酶活/U.kg -1
纯正蜂蜜样品未检出市售蜂蜜样品1号36.22市售蜂蜜样品2号
117.30
图1β-呋喃果糖苷酶标准曲线、回归方程及相关系数
酶活浓度/U
·m L -1峰面积
y =75443x +24197
R 2=0.9962
表2方法的精密度实验结果(n =5)
样品号密二糖峰面积
相对标准偏差（RSD ）
F2
6759568326665976764865368
1.72%
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蜜蜂杂志(月刊)JOURNAL OF BEE（Monthly）NO.122011Dec.
治妇女面部色斑
女贞子1000g，水煎3次，3次药液合并浓缩成300g，对入500g蜂蜜，再文火煎30min，待凉后瓶储，每次2匙，温开水冲服，临睡前饮服。
赵国英荐自2011-07-20《中国剪报》
黄斑变性食疗方
黄斑变性是老年人常见的眼病之一，是眼底视网膜黄斑区的衰老性病变。中医认为，黄斑变性常与肝肾不足、气血虚弱有关，具有补益肝肾，益气养血，明目增视作用的食物，可以预防和缓解老年黄斑变性。
蜂蜜女贞桑葚膏
女贞子20g，桑葚80g，蜂蜜200mL。将女贞子、桑葚放入锅中，加适量清水煮开，然后加入蜂蜜，小火熬成膏状，出锅后晾凉，放置密封瓶中。每次取女贞桑葚膏20g食用，每日1～2次。此方具有滋补肝肾、养血明目的功效，特别适宜黄斑变性者长期食用。同时伴有糖尿病者应禁食。武娟/文
赵国英荐自2011-06-06《医药养生保健报》
3结论
初步建立了高效液相色谱法检测蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶酶活的方法，色谱条件参考GB/T18932所述条件，按此色谱条件分离样品中的各种成分，分离效果好，相对标准偏差为1.72%，样品前处理方法回收率为94.7%，可用于定量定性分析。用此方法检测了3个样品中的β-呋喃果糖苷酶酶活，结果显示，纯正蜂蜜中不含有β-呋喃果糖苷酶，而对照蜂蜜样品中的β-呋喃果糖苷酶酶活很高，分别为36.22U/kg 和117.30U/kg。由此可见：对照样品中掺入了其他的外来物质。综上所述，β-呋喃果糖苷酶酶活的检测可以作为判断蜂蜜是否掺入其他外来物质的一个重要的检测指标。
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含量的测定方法-液相色谱示差折光检测法[S].
图2样品的色谱图
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淀粉酶含量测定
淀粉酶(AMS)测定试剂盒说明书 (碘-淀粉比色法) 一、 原理： 淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，家人碘液与未水解的淀粉结合生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从而计算出AMS 的活力。 二、 试剂组成与配制：（100T ） 1、0.4mg/ml 底物缓冲液：60ml ×1瓶，4℃冰箱保存6个月。 2、0.1mol/L 碘贮备液：7ml ×1瓶，4℃避光保存6个月。 0.01mol/L 碘应用液的配制：将碘贮备液：蒸馏水=1:9稀释，现用现配4℃避光保存。 三、 操作表： 测定管（u 管） 空白管（0管） 底物缓冲液（ml ）37℃预温5分钟 0.5 0.5 待测样本（ml ） 0.1 混匀，37℃水浴，准确反应7.5分钟 碘应用液（ml ） 0.5 0.5 蒸馏水（ml ） 3.0 3.1 混匀，660nm 波长，1cm 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。 *注：不同样本批量测试前需要做预实验，确定最佳取样浓度，将 （空白OD-测定OD 控制在0.05～0.150之间） 四、 计算： 1、 单位定义：100ml 血清（浆）中的AMS ，在37℃与底物作用30分钟，水解10mg 淀粉为1个单位。 2、公式： 样本测试前稀释倍数空白管吸光度 测定管吸光度空白管吸光度样本测试前稀释倍数分钟分钟空白管吸光度测定管吸光度空白管吸光度??-=?????-=801 .01005.730105.04.0dl AMSu （此公式适用于测定血清中淀粉酶）
血清淀粉酶的含量测定 一、实验准备： 1、实验器材：移液枪（100~1000ul、10~100ul、1000~5000ul、2~20ul）、5mlEP管、0.5mlEP 管、比色皿、100ml烧杯、漩涡仪、水浴箱，分光光度计、计时器。 2、实验药品：NaCl、蒸馏水、0.4mg/ml底物缓冲液、0.1mol/L碘贮备液。 二、实验步骤： 1、0.01mol/L碘应用液的配制： 将碘贮备液：蒸馏水=1:9稀释，现用现配4℃避光保存。 2、生理盐水的配置： 称取9gNaCl置100ml烧杯，加入100ml蒸馏水，溶解即得。 3、样品最佳取样浓度摸索： 取待测血清用生理盐水稀释成不同比例（2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍等倍数进行稀释），取0.1ml进行检测。 取两个5mlEP管，标记为空白、血清所稀释的倍数，分别加入底物缓冲液0.5ml，其中带有倍数的EP管加入相应的稀释好的血清0.1ml，于漩涡仪上混匀，同时放入37℃水浴箱反应7.5分钟，取出后各加入0.5ml 0.01mol/L 碘应用液，空白管加入3.1ml蒸馏水，带有倍数的EP管加入3.1ml蒸馏水，混匀，蒸馏水调零，迅速于660nm波长测定吸光度，控制空白OD-测定OD在0.05~0.150之间。 4、样品测定： 将所需测定样品按摸索确定的倍数稀释，同法测定吸光度，记录数据。 5、数据处理：按给定公式计算待测血清淀粉酶含量。 注：加入碘应用液后不能长时间放置，否则碘见光分解后影响测定结果
直接滴定法测定还原糖的原理与主要影响因素
直接滴定法测定还原糖的原理与主要影响因素 日常食品检测中，还原糖是一个常规理化检验项目，涉及的样品种类很广，如乳制品、肉制品、发酵酒及果蔬制品叶等。目前还原糖的检测分二大类，一类是具体检测某一还原糖含量，如葡萄糖、果糖等；一类是测定还原糖总量，还原糖总量目前应用较多的是化学滴定法，食品检测中最常用的是国标GB/T 5009.7-2008中的第一法：直接滴定法。本文讨论的是后者。 检测原理 （1）碱性酒石酸铜甲液与乙液混合后，生成蓝色氢氧化铜沉淀，此沉淀立即与酒石酸钾钠反应生成深蓝色的酒石酸钾钠铜络合物。 （2）当碱性酒石酸铜甲、乙液与还原糖共热时，酒石酸钾钠铜被还原生成红色的氧化亚铜沉淀物，而还原糖的醛基或酮基则被氧化为羧基，生成还原糖酸。 （3）当还原糖将溶液中酒石酸钾钠铜耗尽时，稍微过量的还原糖可将亚甲基蓝还原而呈无色，指示滴定终点的到来。 （4）为消除氧化亚铜沉淀对滴定终点观察的干扰，在碱性酒石酸铜乙液中加入少量亚铁氰化钾，与红色的氧化亚
铜发生络合反应，生成可溶性无色络合物，利于终点的判定。
检测原理的补充性解释 酒石酸钾钠作用。既然实验须在碱性条件下进行，那么硫酸铜遇碱生成氢氧化铜沉淀后，不利于实验正常进行，必须使其（铜离子）在可溶状态下才行，酒石酸钾钠与铜离子络合物酒石酸钾钠铜是可溶的，从而达到了目的。 亚铁氰化钾作用。当样品中存在大量的如铁、锰、钴等金属离子，或样品处理时，沉淀剂乙酸锌过量了，都会消耗碱性酒石酸铜乙液中的亚铁氰化钾，当亚铁氰化钾被过量消耗时，不能有效络合氧化亚铜，致使滴定终点不显无色而显暗红色。可另配制亚铁氰化钾溶液，滴定时往锥形瓶中适量添加，标准与样液添加量一样。 定量标准物质。碱性酒石酸铜甲液中的硫酸铜的铜离子（Cu2+）为此滴定反应的定量标准物质，碱性酒石酸铜乙液中氢氧化钠提供了强碱性环境，故国标GB/T 5009.7-2008中5.2：“吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液”的体积量取精度应改为“5.00mL”，否?t检测结果的有效位数达不到该标准的要求：“还原糖含量≥10g/100g时计算结果保留三位有效数字”。 还原糖被氧化反应式。还原糖与酒石酸钾钠铜的反应，以葡萄糖为例，常见的有下面3式，（6）式中，电子转移数为2，葡萄糖被氧化为葡萄糖酸；（7）式中，电子转移数为6，葡萄糖被氧化为葡萄糖二酸；（8）式中，电子转移数为6，葡萄糖被氧化为葡萄糖酸，伴随脱羧基反应，有碳酸根产生。
植物中蔗糖酶的研究进展
植物中蔗糖酶的研究进展 司丽珍① 储成才② (中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京100101) 摘 要 在大多数高等植物中,蔗糖是碳水同化产物由源向库运输的主要形式。在库中,蔗糖酶可以把蔗糖水解为葡萄糖和果糖,以满足植物生长发育中对碳源和能源的需求。本文综述了近年来有关蔗糖酶的一些研究进展,包括蔗糖酶的分类、基本性质、基因结构、酶活性的调节以及功能等。 关键词 植物,蔗糖酶,活性调节,功能 0 引言 植物在叶片中(源组织)通过光合作用将C O2固定成碳水化合物,然后运向非光合组织(库组织)。植物大多以非还原性二糖如蔗糖的形式完成碳水同化产物由源到库的运输。在库组织中,蔗糖被分解为己糖,为植物生长发育提供碳源和能源。蔗糖分解主要由蔗糖合成酶(EC2.4.1.13)或蔗糖酶(E C3. 2.1.26)来完成。蔗糖合成酶是一糖基转移酶,在尿苷二磷酸(UDP)存在下把蔗糖转化为尿苷二磷酸葡萄糖和果糖。蔗糖酶是一水解酶,把蔗糖水解为葡萄糖和果糖。蔗糖酶有多种同工酶,分别处于不同的亚细胞位置,生化特性也不尽相同[1,2]。虽然对它们的功能特异性还不太清楚,但已确知蔗糖酶在植物中主要参与对蔗糖不同利用途径的调节。由于糖在植物中不仅是作为能源,而且也是基因表达的重要调节物质之一,因此蔗糖酶也间接参与细胞分化和植物发育的调控。鉴于此,蔗糖酶的研究无论在理论上还是在实际上都具有重要意义而备受重视。本文就近年来有关研究进展做一介绍。 1 蔗糖酶的分类 根据植物中蔗糖酶所处亚 细胞位置,蔗糖酶可分为液胞型 蔗糖酶、细胞质型蔗糖酶和细胞 壁型蔗糖酶。前两者又统称为胞 内蔗糖酶,细胞壁型蔗糖酶又被称为胞外蔗糖酶。不同的蔗糖酶进行反应所需的最适pH值也有所不同,由此蔗糖酶又可分为酸性蔗糖酶和中性/碱性蔗糖酶。液胞型蔗糖酶和细胞壁型蔗糖酶在pH4.5至5.0时催化效率最高,因此也称为酸性蔗糖酶。细胞质型蔗糖酶水解蔗糖的最适pH值为中性或略微偏碱性,因此称为中性/碱性蔗糖酶。而根据其溶解性,蔗糖酶又可分为可溶性蔗糖酶(包括液胞型蔗糖酶和细胞质型蔗糖酶)与非溶性蔗糖酶(细胞壁型蔗糖酶)。 2 蔗糖酶基本性质 大多数植物含有至少2种液胞型蔗糖酶,它们均以可溶性蛋白的形式存在。而细胞壁型蔗糖酶则以离子键的形式与细胞壁结合,并有多种同工酶存在。液胞型和细胞壁型蔗糖酶在pH4.5至5.0时效率最高,且从果糖残基攻击蔗糖,因而这类酸性蔗糖酶被称作β-呋喃果糖苷酶,也正因为如此,酸性蔗糖酶也可催化其他含有β-果糖的多糖,例如水苏糖、棉子糖的水解。目前已从多种植物中分离出酸性蔗糖酶,成熟多肽的分子量大多在55～70kD之间。在菜豆中,变性SDS凝胶电泳证明一70kD的液胞型蔗糖酶可以被水解成30kD的N-端和38kD的C-端两个片段。它们在蔗糖浓度很低时有一Km值,酶活性被重金属离子如Hg2+,Ag2+抑制,表明催化中心有巯基存在。酸性蔗糖酶也被其反应产物抑制,葡萄糖是非竞争性抑制剂,而果糖是竞争性抑制剂[3]。 另外,植物中至少含有两种细胞质型蔗糖酶,它们水解蔗糖的最适pH为中性或偏碱性。中性或偏 — 101 — ① ②联系人。 (收稿日期:2002-03-29) 女,1974年生,博士生;研究方向:分子遗传学
淀粉酶活力测定实验报告
淀粉酶活力测定实验报告 淀粉酶活力测定实验报告实验三、淀粉酶活性的测定实验报告 实验四、淀粉酶活性的测定 一、实验目的: 1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义; 2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。 二、实验原理: 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化;β-淀粉酶不耐热，70? 15min 则被钝化。测定时，使其中一种酶失活，即可测出另一种酶的活性。 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，测定其吸光度，从而确定酶液中淀粉酶活力(单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量)。 三、实验用具: 1、实验设备 研钵,具塞刻度试管,离心管，分光光度计，酸度计，电热 恒温水浴锅，离心机，电磁炉。 2、实验材料与试剂 (1)0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液:A液:称取柠檬酸20.01g，定容至 1000ml;B液:称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml;取A液55ml与B液145ml混匀。 (2)1%可溶性淀粉溶液:1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6
的柠檬酸缓冲液; (3)1%3,5-二硝基水杨酸试剂:称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入; (4)麦芽糖标准溶液:取麦芽糖0.1g溶于100ml水中; (5)pH 6.8的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用 0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至 6.8，加水稀释至1000ml即得。 (6)0.4mol/L的NaOH溶液; (7)1%NaCl溶液。 (8)实验材料:萌发的谷物种子(芽长约1cm) 四、操作步骤 1、酶液提取:取6.0g浸泡好的原料，去皮后加入10.0mL 1%的NaCl 溶液，磨碎后以2000r/min 离心10min，转出上清液备用。取上清液1.0ml，用pH 为6.8的缓冲溶液稀释5倍，所得酶液。 2、a- 淀粉酶活力测定 (1) 取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。 (2) 于每管中各加酶液lml ,在 70?士0.5? 恒温水浴中准确加热15min ,取出后迅速用流水冷却。 (3) 在对照管中加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 (4) 在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。 (5) 将4支试管置另一个40?士 0.5? 恒温水浴中保温15min ,再向各管分别加入40?下预热的1,淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入40?恒温水浴准确计时保温 5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶 活动,准备测糖。
试验2还原糖的测定方法
实验2 还原糖的测定方法 食物中还原糖的测定方法：高锰酸钾滴定法和直接滴定法。 一、高锰酸钾滴定法 1.原理 样品经除去蛋白质后，其中还原糖在碱性环境下将铜盐还原为氧化亚铜，加硫酸铁后，氧化亚铜被氧化为铜盐，以高锰酸钾溶液滴定氧化作用后生成的亚铁盐，根据高锰酸钾消耗量计算氧化亚铜含量，再查表得还原糖量。 2.适用范围 GB5009.7-85，本法适用于所有食品中还原糖的测定以及通过酸水解或酶水解转化成还原糖的非还原性糖类物质的测定。 3.仪器 （1） 滴定管 （2） 25ml古氏坩埚或G4垂融坩埚 （3） 真空泵 （4） 水浴锅 4.试剂 除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。 4.1 6 mol/L盐酸：量取50ml盐酸加水稀释至100 ml。 4.2 甲基红指示剂：称取10mg甲基红，用100ml乙醇溶解。 4.3 5 mol/L氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠加水溶解并稀释至100ml。 4.4 碱性酒石酸铜甲液：称取34.639g硫酸铜（CuSO4·5H2O），加适量水溶解，加0.5ml硫酸，再加水稀释至500ml，用精制石棉过滤。 4.5碱性酒石酸铜乙液：称取173g酒石酸钾钠与50g氢氧化钠，加适量水溶解，并稀释至500ml，用精制石棉过滤，贮存于橡胶塞玻璃瓶中。 4.6精制石棉：取石棉先用3mol/L盐酸浸泡2～3天，用水洗净，再加2.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡2～3天，倾去溶液，再用热碱性酒石酸铜乙液浸泡数小时，用水洗净。再以3mol/L 盐酸浸泡数小时，以水洗至不呈酸性。然后加水振摇，使成微细的浆状软纤维，用水浸泡并贮存于玻璃瓶中，即可用做填充古氏坩埚用。 4.7 0.1000mol/L高锰酸钾标准溶液。 4.8 1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g 氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml。 4.9 硫酸铁溶液：称取50g硫酸铁，加入200ml水溶解后，慢慢加入100ml硫酸，冷却后加水稀释至1L。 4.10 3mol/L盐酸：量取30ml盐酸，加水稀释至120ml。 5. 操作方法 5.1 样品处理： 5.1.1 乳类、乳制品及含蛋白质的食品：称取约0.5～2 g固体样品（吸取2～10 ml液体样品），置于250 ml容量瓶中，加50ml水，摇匀。加入10 ml碱性酒石酸铜甲液及 4ml1mol/L氢氧化钠溶液，加水至刻度，混匀。静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液滤液备用。（注：此步骤目的是沉淀蛋白） 5.1.2 酒精性饮料：吸取100 ml样品，置于蒸发皿中，用1mol/L氢氧化钠溶液中和至中性，在水浴上蒸发至原体积1/4后（注：如果蒸发时间过长，应注意保持溶液pH为中性），移入250ml容量瓶中。加50 ml水，混匀。以下按5.1.1自"加10ml碱性酒石酸铜甲液"起依法操
面粉改良剂中酶制剂的应用及最新发展趋势
面粉改良剂中酶制剂的应用及最新发展趋势 1 应用在面粉改良中的主要酶制剂 1.1 淀粉酶 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶(包括真菌α-淀粉酶和细菌α-淀粉酶)、β-淀粉酶、麦芽糖淀粉酶和糖化酶，常用的有α-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶。 1.1.1 真菌α-淀粉酶[1-13]真菌α-淀粉酶简称FAA，来源于米曲霉，是第一个应用于面包制作的微生物酶。由于传统使用的麦芽的淀粉酶含量不稳定，而且含有蛋白水解酶，所以不适合在工业化生产中应用。相比之下，真菌α-淀粉酶具有更稳定的活性且不含蛋白酶活性，因此在工业上的应用更为广泛。 真菌α-淀粉能水解直链淀粉和支链淀粉的α-1，42糖苷键生成麦芽糊精和麦芽糖。其最适pH值为4.0-5.0，最适温度为50-60℃。 实践应用结果表明，真菌α-淀粉酶作为面粉改良剂添加到面粉中后，主要起到以下几个作用：在面团中，大多数淀粉以结晶状态存在，淀粉酶不能分解天然状态的淀粉。然而在制粉过程中，部分淀粉颗粒被破坏形成破损淀粉。在加入真菌α-淀粉酶的情况下，这些破损淀粉颗粒被水解成麦芽糖(淀粉酶能内切直链淀粉成糊精，而糊精又在淀粉内切酶的作用下降解成麦芽糖)。麦芽糖又在酵母本身分泌的麦芽糖酶作用下，水解成葡萄糖供酵母利用，从而为酵母的发酵提供足够的糖源作为营养物质。 在面包中添加真菌α-淀粉酶可以使面包变得柔软，能够增强面团的延展性以及持气的能力，麦芽糖能被酵母利用产生CO2，从而使面包体积增大，糊精的存在使得面包纹理疏松，同时对改良面包外皮色泽有良好的效果，能出炉后制
成感觉良好的面包。实验还表明：真菌淀粉酶(FAA)能够降低小麦粉的粉质特性指标，提高而团的拉伸性能，它对馒头的作用效果较显著，能改善馒头的质量、风味、弹性和体积。 1.1.2 细菌α-淀粉酶细菌α-淀粉酶一般是耐热的枯草杆菌α-淀粉酶，在作用机理上与真菌α-淀粉酶有一定的差别。同样以可溶性淀粉作底物时，真菌α-淀粉酶的水解最终产物主要是麦芽糖和麦芽三糖；而细菌α-淀粉酶的最终产物主要是短链糊精。两者的性质差异也很大。其最适pH值为5.0，最适温度为80-90℃。 细菌α-淀粉酶具有防腐抗老化的能力，其机理是此酶能将淀粉分解生成分子量低的分支淀粉、干涉支链淀粉的重结晶。产生的糊精会干涉面包中膨胀淀粉粒与蛋白质网络结构的相互作用，而且支链淀粉和支链淀粉中裂开的键有助于支链淀粉-脂肪复合物的形成。 在面包的制备过程中，细菌α-淀粉酶的热稳定性较高，使得在烘焙中仍具有活性，从而使可转化的淀粉也相对较多。并且在烘焙中，淀粉糊化后更易水解，这会给面包成品质量带来不良影响。因此，在面包的烘焙中，要根据面包和烘焙的类型，控制好淀粉酶的添加量。 同时由于在烘焙时仍具有一定的酶活性，产生过多的可溶性糊精，结果使得成品发黏而不适合在面包加工中大量使用。但与真菌α-淀粉酶相比，它能产生很好的抗老化效果。而且对面包的弹性和口感都要优于真菌α-淀粉酶，因此小规模的使用及如何解决其耐高温特性而造成最终产品发黏的问题是十分重要的。 1.1.3 麦芽糖淀粉酶烘焙类面制品作为消费品，有其一定的货架期(保鲜期)，超过之后，容易因老化(也就是淀粉回生)造成品质下降，引起不必要的经济损失，为此人们不断研究各种添加剂以延长面包的货架寿命，在最大程度上降低
澳大利亚蜂蜜中的羟甲基糠醛与淀粉酶含量
澳大利亚蜂蜜中的羟甲基糠醛与淀粉酶含量 摘要 澳洲蜂蜜样品(加工及未加工)的质量是用来评估HPLC技术。羟甲基糠醛作为主要的质量指标。包括四个经过商业加工的蜂蜜样品（澳大利亚雨林,Beechworth、homebrand和Leabrook)和三个未加工的蜂蜜样品(Banksia、灰盒子和Mallee)。所有样品,除了Leabrook和Beechworth,中的初始羟甲基糠醛(HMF)含量低于法典委员会标准和国际蜂蜜标准(40毫克/公斤)外，其余样品都高出标准。Leabrook和Beechworth中的羟甲基糠醛分别为50.8±1.34毫克/公斤和74.9 ±234毫克/公斤。在85°加热未加工的蜂蜜2分钟造成显著(p≤ 0.05)蓄积的羟甲基糠醛含量。在85°C加热2分钟后Mallee的样品中羟甲基糠醛的量从34.0±0.31增加到42.3±0.37毫克/公斤。所有的蜂蜜淀粉酶活性样品显示超过最低限度(8 Gothes)。蜂蜜成品的理化性质的变化有明显的样品。结果显示,加热也并不是唯一的影响羟甲基糠醛(HMF)在蜂蜜中形成的因素,还有蜂蜜的成分、pH值和植物源可导致这些变化。因此,一定数量的羟甲基糠醛(HMF)可能不是一个唯一的蜂蜜质量指标。 关键词: 羟甲基糠醛;Gothe单位数,淀粉酶活性;加工过的蜂蜜；新鲜蜂蜜。 1．介绍 澳大利亚新西兰食品标准 (FSANZ,2006年)规定了蜂蜜的定义即蜜蜂是从花朵或植物的生命部位所分泌的物质中制造出的自然甜美的物质。它必须包含至少60%的还原糖和不超过21%的水分。蜂蜜成分是高度受到蜂蜜所采的花朵的类型、区域和气候条件的影响(门德斯,Proenca、费雷拉、和费雷拉,1998)。 澳大利亚是世界上第四大蜂蜜出口国。在澳大利亚蜂蜜行业每年至少价值达6500万美元。新南威尔士是蜂蜜的主要生产者,占总产量的45%。制造出的蜂蜜有一半是在国内消费的,而剩下的则出口(澳大利亚蜂蜜工业委员会,2004年)。在澳大利亚桉树代表了生产蜂蜜的主要本土植物(78%)（吉布斯和Muirhead，1998)。约有95%的桉树构成了安大利亚的植被,统治了森林植被中的约550-600个不同类型的物种和品种,还有许多杂交物种(凯莉,1983)。 加热新鲜蜂蜜通常是为了方便加工和保持良好的质量。然而过度热处理会形成羟甲基糠醛(HMF)以及降低蜂蜜质量。羟甲基糠醛的量在新鲜蜂蜜中几乎没有或很低 ,而在加热过的蜂蜜中含量很高,它们储存在不适当的条件,或搀假在逆变糖浆中(Nozal伯纳作了开题报告,Toribio,希门尼斯,马丁,先后,2001)。蜂蜜的理化性质如酸碱度,矿物含量和总酸度也会影响羟甲基糠醛含量。在有机酸存在和低水分活动的情况下,也会影响产品中的羟甲基糠醛含量 (Kalabova ,Borkovcova ,Smutna,和Vecerek,2003)。食品法典(2001)和国际蜂蜜委员会 (2002)设定了最大的羟甲基糠醛浓度：非热带地
实验七尿淀粉酶活性测定
实验七尿淀粉酶活性测定 淀粉酶（AMY或AMS在体内的主要作用是水解淀粉，它随机地作用于淀粉分子内的 a—1, 4糖苷键生成葡萄糖、麦芽糖、寡糖及糊精。血清中的淀粉酶主要有胰型（P型）和 唾液型（S型）及其亚型同工酶组成，P型淀粉酶主要来源于胰腺，S型淀粉酶主要来源于唾 液腺。正常淀粉酶因分子量小，故可从肾小球滤过而由尿中排出。 【目的】 1、验证淀粉酶的催化作用。 2、观察淀粉及其水解产物分别与碘反应呈现的颜色变化。 【原理】血清及尿中的淀粉酶来源于胰腺和唾液腺，正常血清与尿中有一定活性。 Winslow 氏法测定尿和血清中淀粉酶活性是将试样作等比稀释，观察一系列试样在规定的 37C、30分钟的条件下，恰好能将0.1%淀粉溶液1ml水解（指加入碘液后不再呈蓝色）的 酶量定为淀粉酶的一个活性单位，乘以尿的稀释倍数，即可得知每项ml 尿液中的淀粉酶活性。 【器材】 试管（10mn X 100mr）、试管架、电热恒温水浴箱、吸管、洗耳球、滴管。 【试剂】 1 、 9%NaCl 2、0.3%碘液 3、0.1%淀粉溶液 【操作】 1 、准备尿液（自备）。 2、取 10支试管，编号，用吸管向管中加入0.9%NaCl 1ml。 3、用1ml吸管（注意应用刻度到头的）向第一管加尿液1ml，混合，再将试管中的液 体吸起，然后任其流回试管，如此重复三次，以便全管混匀，并借此冲洗吸管内壁。吸出此混合液1ml 移入第二管中。 4、用同法处理第二管使之混匀，并取出1ml 置于第三管中。依此类推，如此继续稀释 至第九管后，吸出1ml混合液弃之，这样既可获得分别含原尿液为1/2ml,1/4ml,1/8ml, ... 1/512ml 的不同浓度的尿稀释液。第十管不加尿液作为对照管。 5、从第十管起依次向各管迅速准确加入0.1%淀粉液2ml，迅速摇匀（是否充分混匀往
农检2班 20117701201 梁丽嫦 项目10 直接滴定法测定还原糖含量(氧化还原滴定法)习题
碳水化合物的分析测定 一、填空题 1、用直接滴定法测定食品还原糖含量时，所用的裴林标准溶液由两种溶液组成，A（甲）液是碱性酒石酸铜钾液，B（乙）液是碱性酒石酸铜乙液；一般用葡萄糖标准溶液对其进行标定。滴定时所用的指示剂是亚甲基蓝，掩蔽Cu2O的试剂是亚铁氰化钾，滴定终点为溶液蓝色刚好褪去。 2、还原糖的测定是一般糖类定量的基础，这是因为，还原糖具有还原性，非还原性糖可以通过水解而生成相应的还原性单糖。 3、在直接滴定法测定食品还原糖含量时，影响测定结果的主要操作因素有反应液碱度，热源强度，煮沸时间，滴定速度。 二、名词解释 可溶性糖可溶性糖就是易溶于水的糖.常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖。 还原糖是指任何一种分子中含醛基或在溶液中能通过异构化产生醛基的糖。 总糖是多羟基醛(酮)及水解后能生成多羟基醛(酮)的一类化合物.总糖主要指具有还原性的葡萄糖，果糖，戊糖，乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖（水解后为1分子葡萄糖和1分子果糖），麦芽糖（水解后为2分子葡萄糖）以及可能部分水解的淀粉（水解后为2分子葡萄糖）。 膳食纤维膳食纤维是一种不能被人体消化的碳水化合物，分为非水溶性和水溶性纤维两大类。纤维素、半纤维素和木质素是3种常见的非水溶性纤维，存在于植物细胞壁中；而果胶和树胶等属于水溶性纤维，则存在于自然界的非纤维性物质中。 三、选择题 1、（ 1 ）测定是糖类定量的基础 （1）还原糖（2）非还原糖（3）葡萄糖（4）淀粉 2、直接滴定法在滴定过程中（ 3 ） （1）边加热边振摇（2）加热沸腾后取下滴定 （3）加热保持沸腾，无需振摇（4）无需加热沸腾即可滴定 3、费林氏A液、B液（ 3 ）。 （1）分别贮存，临用时混合（2）可混合贮存，临用时稀释 （3）分别贮存，临用时稀释并混合使用。（4）上述方法都可以 四、简答题 1、直接滴定法测定食品还原糖含量时，对样品液进行预滴定的目的是什么？ 答：一是直接滴定法对试样溶液中还原糖浓度由一定要求（0.1%左右），测定时试样溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可了解试样浓度是否适
qs2632al阿拉伯呋喃糖苷酶试剂盒说明书
货号：QS2632规格：50管/24样 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase,α -L-Af）试剂盒说明书 可见分光亮度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： α-L-Af是一种能够水解非还原呋喃阿拉伯糖残基的糖苷酶类，使细胞壁阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖等中性糖不断解离，促进果胶的增溶和降解。由于果实成熟过程中常常伴随着阿拉伯糖的丧失，该酶活性在果实成熟软化中的研究具有重大意义。 测定原理： α-L-Af分解对硝基酚阿拉伯呋喃糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-L-Af活性。 自备用品： 可见分光亮度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织， 加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光亮度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。
转化酶研究进展
转化酶研究进展 摘要转化酶是生物体内糖代谢的关键酶,综述了转化酶多态性及其活性表达调控、转化酶基因等方面的研究;用分子生物学手段研究了转化酶基因对植物糖分积累的直接作用;研究了逆境下转化酶多态性表达及生理调节、调控。 关键词转化酶;多态性;糖代谢;基因;活性 ResearchAdvanceonPlantInvertase GAO Yun (Pingliang Medical College,Pingliang Gansu 744000) AbstractInvertase plays an important role during the sugar metabolism in higher plant. The varieties,distribution,invertase expression,gene expression of the invertase in higher plant were introduced in this paper. The research on the direct function about invertase gene to plant sugar accumulation by molecule biology means and the research on invertase expression,physiological regulation under adversity stress were summarized. Key wordsinvertase;polymorphism;sugar metabolism;gene;activity 转化酶(invertase),又称蔗糖酶或β-D-呋喃果糖苷酶,是生物体内糖代谢的关键酶,在蔗糖代谢中催化如下反应:蔗糖+H2O→果糖+葡萄糖。由于糖代谢是生物体内物质代谢的中心,蔗糖是高等植物光合作用的主要产物,是碳运输、“库代谢”、糖积累、果实品质形成中的重要因子,还是细胞代谢的调节因子,可能通过影响基因表达发挥作用。因此,与蔗糖代谢和积累密切相关的转化酶是近年来生理生化、生理生态及分子生物学研究的热点之一。 1转化酶的多态性及在蔗糖代谢中的作用 转化酶是高度多态的,包括酸性转化酶(Acid Invertase,AI)、中性转化酶(Neutral Invertase,NI)和碱性转化酶。许多报道将中性转化酶和碱性转化酶看作同一种转化酶。酸性转化酶主要存在于液泡或束缚于细胞壁上,其最适pH值在3.0~5.0;中性和碱性酶位于细胞质中,最适pH值在7.0左右。报道的转化酶的分子量大小为50~80 kD,为单体或二聚体。生殖器官中均有液泡转化酶表达。栽培番茄、野生番茄及转基因番茄研究表明,在果实成熟后期,液泡转化酶的表达与否决定着果实可溶性糖的组分[1]。原位杂交研究表明,胞壁转化酶可能存在于维管束
(植物中)淀粉酶活性的测定
(植物中)淀粉酶活性的测定 一实验目的 本实验的目的在于掌握淀粉酶的提取及活性的测定方法。 二实验原理 植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解为麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中，有α－淀粉酶及β－淀粉酶，其活性因植物生长发育时期不同而有所变化，其中以禾谷类种子萌发时淀粉酶活性最强。 α－淀粉酶和β－淀粉酶都各有其一定的特性，如β－淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下容易发生钝化。通常酶提取液中同时存在两种淀粉酶，测定时，可以根据他们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可以测出另一种酶的活性。将提取液加热到70℃维持15分钟以钝化β－淀粉酶，便可测定α－淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6的醋酸在0℃加以处理，钝化α－淀粉酶，以测出β－淀粉酶的活性。 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5－二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原成3－氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可以求出麦芽糖到含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性大小。 三实验材料 萌发的小麦、大麦或者豆类等（芽长1cm左右） 四实验仪器和试剂 1．仪器： 电子天平、研钵、100mL容量瓶（1个）、50mL量筒（1个）、刻度试管[25mL（9个）、10mL（1个）]、试管6支、移液管[1mL（2支）、2mL（2支）、10mL（2支）]、离心机、恒温水浴锅、7220型分光光度计 2．试剂： 1％淀粉溶液、0.4mol/LNaOH、 pH5.6的柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸20.01g，溶解后稀释至1 000mL；B、称取柠檬酸钠29.41g，溶解后稀释至1 000mL；取A液13.70mL与B液26.30mL 混匀即是。 3,5－二硝基水杨酸：精确称取3,5－二硝基水杨酸1g溶于20mL1mol/LNaOH 中，加入50mL蒸馏水，在加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100mL，盖紧瓶盖，勿让CO2进入。 麦芽糖标准液：称取化学纯麦芽糖0.100g溶于少量蒸馏水中仔细移入100mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。 五操作步骤 1．酶液的提取： 称取萌发的水稻种子0.5g（芽长1cm左右，置于研钵中加石英砂研磨成匀浆，移入25mL刻度试管中，用水稀释至刻度，混匀后在温室下放置，每隔数分钟振荡一次，放置20分钟后离心，取上清液备用。 2．α－淀粉酶活性的测定： （1）取三支试管，编号注明1支为对照管，2支为测试管。 （2）于每管中各加入酶提取液1mL，在70℃恒温水浴中（水文的变化不应该超过±0.5℃），准确加热15分钟，在此期间β－淀粉酶受热钝化，取出后迅速在自来水中冷却。
直接滴定法测食品中还原糖实验报告
1.目的 掌握直接滴定法测还原糖的原理、操作、条件及注意事项。 2.原理 样品经前处理提取还原糖，在加热条件下，直接滴定一定量的碱性酒石酸铜标准溶液，以次甲基蓝作指示剂，根据样液消耗体积，计算样品中还原糖量。3.试剂 3.1碱性酒石酸铜标准溶液（还原糖因数f/mg·10mL-1） 3.1.1甲液:称取23.10g硫酸铜（CuSO4·5H2O）及0.05g次甲基蓝，溶于水中 并稀释至100mL 3.1.2乙液: 称取115.33g酒石酸钾钠及33.30氢氧化钠，溶于水中，用水稀 释至1000mL，贮存于橡胶塞玻璃瓶中瓶中 3.2乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌，加3mL冰乙酸，加水溶解并稀释至 100mL. 加水溶解并稀释至100mL 3.3亚铁氰化钾溶液（106g/L）：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释 至100mL 3.4盐酸 3.5葡糖糖标准溶液：精密称取7.0000g经过98~100℃干燥至恒量的纯葡 萄糖加水溶解，并以水稀释至1000mL.此溶液每毫升相当于7mg葡糖 糖 4.仪器 碱式滴定管、电炉 5.样品 硬糖（m样=5.8002g） 6.操作 6.1样品处理 称取样品5.8002g置于小烧杯中，加40mL水，40℃微热溶解，冷却后加40mL水，调节PH至中性，加水定容至100mL，过滤后收集滤液即为样品溶液。 6.2标定碱性酒石酸铜溶液 吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液及5.0mL乙液，置150mL三角锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，置于电炉上加热至沸（要求控制在2min内沸腾），然而趁热以每秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖的总体积。同时平行操作三份，取其平均值，计算每10mL（甲液乙液各5mL）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质
葡萄糖醛酸酶
α-葡萄糖醛酸酶的研究进展 摘要：α-葡萄糖醛酸酶是木聚糖类半纤维素完全降解过程中必不可少的重要酶，它在构建彻底降解半纤维素的基因工程菌和半纤维素酶制品的应用开发方面的生物技术潜力正在越来越受到人们的关注。本文从木聚糖的结构着重介绍α-葡萄糖醛酸酶的作用机理、酶活分析、酶纯化和基因克隆的研究进展。 关键词：木聚糖；α-葡萄糖醛酸酶；作用机制；基因重组技术 木聚糖类半纤维素是仅次于纤维素的第二个重要的异源多糖，它以其数量大，组分易提取成为最具潜力的可再生资源[1]。因此，各国政府都不断投入对木聚糖类半纤维素酶的研究。尤其是石油危机引起的价格战更促使了人们对半纤维素发酵生产燃料乙醇的研究。我国科学工作者在半纤维素酶方面已经进行了深入研究，并在食品加工、饲料、纸浆溶解及纸浆漂白上取得了可喜成绩。但主要是集中在内切木聚糖酶的研究上[1]。我国是一个农业大国，每年有大量的秸杆成为环保负担，而秸杆中约94%的半纤维素是阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖[1]。如果将其生物降解为木糖和少量其它单糖，可以用作基本碳源生产各种发酵产品，如有机酸、氨基酸、单细胞蛋白、糖醇、工业酶类、溶剂或燃料。但是，彻底降解木聚糖需要由多种水解酶组成的酶系统的协同作用。这个木聚糖降解酶系是由内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶组成的。α-葡萄糖醛酸酶在开发木聚糖类半纤维素中起着非常重要的作用，它的生物技术潜力正越来越受到人们的关注。目前，有关α-葡萄糖醛酸酶的研究在国内还未见报道，本文将从木聚糖类半纤维素的结构、酶作用机制介绍有关α-葡萄糖醛酸酶及其基因的研究进展。 1 木聚糖的结构 木聚糖是存在于植物细胞壁中最丰富的半纤维素，它是一个以β-1.4-糖苷键相连的木聚糖主链上带着一些不同的取代基像乙酰基、阿拉伯糖基、4-O-甲基葡萄糖醛酸和阿魏酸残基等而构成的[2]。为了保证植物细胞壁的刚性，木聚糖则与细胞壁聚合物果胶质和木质素相连接，其中阿魏酸与果胶质和木质素中的酚酸残基形成共价键，并通过阿拉伯糖基连到木聚糖主链上。细胞壁的木质素与4-O-甲基葡萄糖醛酸之间则通过4-O-甲基葡萄糖醛酸以酯键连接到木聚糖主链上[3]。大多数硬木半纤维素是O-乙酰基-4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖，它是一条约70个β-木糖吡喃型残基通过β-1.4-糖苷键相连的木聚糖主链（平均聚合度在150~200之间），平均每10个木糖残基就由α-1,2键连上一个4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基。硬木木聚糖被高度乙酰化，每十个木糖单位的C-3和C-2位置上带有7 个O-乙酰。用碱抽提木聚糖时，这些乙酰基很容易去除[4]。 软木和禾本科植物半纤维素中的木聚糖主要是阿拉伯糖-4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖（平均聚合度在70~80之间），平均每6个木糖单位带有一个4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基，每8~9个木糖残基带一个α-L-阿拉伯呋喃糖单元，与硬木半纤维素相比，是未乙酰化的[2,4]。秸杆半纤维素就属于此类。 2 α-葡萄糖醛酸酶在木聚糖水解中的作用机理
淀粉酶活性的测定
淀粉酶活性的测定 一、原理 淀粉酶（amylase）包括几种催化特点不同的成员，其中α－淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶；β－淀粉酶每次从淀粉的非还端切下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶；葡萄糖淀粉酶则从淀粉的非还原端每次切下一个葡萄糖。淀粉酶产生的这些还原糖能使3，5－二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3－氨基－5－硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。可以用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。几乎所有植物中都存在有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，主要是α－和β－淀粉酶。Α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；而β－淀粉酶不耐热，在70℃15min则被钝化。根据它们的这种特性，在测定时钝化其中之一，就可测出另一个的活力。本实验采用加热钝化β－淀粉酶测出α－淀粉酶的活力，再与非钝化条件下测定的总活力（α＋β）比较，求出β－淀粉酶的活力。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：萌发的小麦种子（芽长约1cm）。 （二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 离心机；3. 恒温水浴（37℃，70℃，100℃）；4.具塞刻度试管；5. 刻度吸管；6. 容量瓶。 （三）试剂（均为分析纯）：1. 标准麦芽糖溶液（1mg/ml）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml；2. 3，5－二硝基水杨酸试剂：精确称取1g3，5－二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用；3.01mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55ml与B液145ml混匀，即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液；4.1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100ml0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 三、实验步骤 （一）麦芽糖标准曲线的制作：取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表（详教材）加入试剂。摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制标准曲线. （二）酶液制备：称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨成匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数min搅动1次，使其充分提取。然后在3000rpm 下离心10min，将上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液10ml，放入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液。 （三）酶活力的测定：取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表（详教材）进行操作。（四）结果计算：淀粉酶活力=C×V T/(W×V s×T)(mg/g/min)。式中，C为从标准曲线上查得的麦芽糖含量（mg）；VT为淀粉酶原液总体积（ml）；Vs为反应所用淀粉酶原液体积（ml）；W为样品重量（g）；t为反应时间（min）。
总糖和还原糖的测定(费林试剂热滴定法)
总糖和还原糖的测定──费林试剂热滴定法 目的要求： 掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。 实验原理： 还原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的单糖和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。在碱性溶液中，还原糖能将Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金属离子还原，而糖本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类的这种性质常被用于糖的定性和定量测定。 本实验采用费林试剂热滴定法。费林试剂由甲、乙两种溶液组成。甲液含硫酸铜和亚甲基蓝（氧化还原指示剂）；乙液含氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。将一定量的甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：2NaOH + CuSO4 = Cu(OH)2+ Na2SO4在碱性溶液中，所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的络合物酒石酸钾钠铜： 反应生成的氧化亚铜沉淀与费林试剂中的亚铁氰化钾（黄血盐）反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点。 Cu2O + K4Fe(CN)6 + H2OCu2O + K4Fe(CN)6 + H2OK2Cu2Fe(CN)6 + 2KOH 滴定时以亚甲基蓝为氧化－还原指示剂。因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜离子全部被还原后，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算出还原糖含量。
试剂和器材： 一、试剂 费林试剂： 甲液：称取15g硫酸铜（CuSO4·5H2O）及0.05g亚甲基蓝，溶于蒸馏水中并稀释到1000mL。 乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g NaOH，溶于蒸馏水中，再加入4g亚铁氰化钾［K4Fe （CN）6］，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000mL，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。 0.1％葡萄糖标准溶液：准确称取1.000g经98～100℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000mL容量瓶中，加入5mL浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000mL。 6mol/L HCl：取250mL浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500mL。 碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。 6mol/L NaOH：称取120gNaOH溶于500mL蒸馏水中。 0.1%酚酞指示剂。 二、材料 藕粉，淀粉。 三、器材 试管3.0×20cm（×1）；移液管5mL（×2）；烧杯100m L(×1); 250mL锥形瓶; 调温电炉; 滴 定管25mL(×1)。 操作方法： 一、样品中还原糖的提取 准确称取1g藕粉，放在100mL烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加入约40mL蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。