产纤维素酶菌株的筛选及酶学性质研究

产纤维素酶菌株的筛选及酶学性质研究

自然界中的纤维素资源极为丰富,如果能对这些纤维素资源加以利用,不仅保护了环境,又可实现资源回收利用,因此国内外对于纤维素酶的研究一直是个研究热点。本研究从腐植土里筛选出具有降解纤维素酶能力的放线菌一株,通过单因素及正交试验确定其最适的产酶发酵培养基;用生理生化及分子生物学方法鉴定该放线菌;对该纤维素酶进行酶学研究;最后通过分离纯化以获得较高纯度的内切酶。

研究为放线菌所产纤维素酶的特性提供理论依据,对高纯度纤维素酶的获取及开发利用具有指导意义。1.试验通过对腐植土中具降解纤维素能力的菌进行筛选,最终确定筛得放线菌一株,并编号NO.11,其在CMC-Na液体培养基中,内切型-β-葡聚糖酶酶活为30.06U·mL-1,外切型-β-葡聚糖酶酶活为10.40U·mL-1,β-葡萄糖苷酶酶活为8.05U·mL-1,FPA酶酶活为 13.88U·mL-1。

2.通过对菌株NO.11进行生理生化及分子生物学鉴定,最终确定该菌为暗灰链霉菌。

3.通过正交实验,得出菌株NO.11最适的产酶培养基配方为:0.2%的牛肉膏,2%的稻草粉,初始pH7.5,0.3%的KH2PO4,接种量为6%,发酵温度为32℃,发酵时间为5 d。

在此条件下菌株NO.11的CMC酶活力为55.28 U·mL-1,其产酶能力明显提高。4.为获得更高纯度的纤维素酶,试验通过硫酸铵分级盐析、透析、葡聚糖凝胶G-100柱层析分离纯化纤维素酶。

试验结果显示,最终纯化得到的酶液酶活为53.09U·mL-1,比活力为211.22 U·mg-1,纯化倍数为1.90倍。通过SDS-PAGE可知,该放线菌所产CMC酶的分子量在65kDa左右,经硫酸铵盐析、透析、Sephadex G-100柱层析后,电泳检测其

可达到电泳纯。

5.在菌株NO.11所产内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶的酶促反应中,其最适pH值为4.5;滤纸酶、外切酶及β-葡萄糖苷酶的最适反应温度均为50℃;内切酶的最适反应温度为55℃;内切酶在pH值4.0-

6.5间其相对酶活在70%以上;在30-60℃的反应温度下,其相对酶活在70%以上;金属离子Mg2+,Ca2+,Mn2+对各酶均有激活作用。Zn2+对外切酶有激活作用,但对内切酶、β-葡萄糖苷酶都产生抑制作用。

Fe3+对β-葡萄糖苷酶有抑制作用。