辣根过氧化物酶

辣根过氧化物酶（HRP）

一种糖蛋白，由于在辣根中该酶的含量很高，故名。它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。通常用做光学和电子显微镜的组织化学示踪物。

简介：

过氧化物酶，通常来源于辣根（因此称辣根过氧化物酶），是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。

用途：

1) RZ>3 活性 >250u/mg，主要应用于免疫学，是高纯度的过氧化酶。采用特殊色谱纯化技术以除去会影响免疫学反应的同工酶B .

2) RZ>2 活性>180u/mg ，主要应用于临床化学，我们的客户也有将这个规格的产品应用于免疫学研究的。此时，一个标准化的分析方法就变得尤为重要。

3) RZ>1 活性>100u/mg，主要应用于血糖试纸和尿液分析试纸。

4) RZ>0.6 活性>60u/mg ，主要应用于尿液分析试纸。

实验原理：

过氧化物酶催化以下反应：

2 H2O2 ─→ O2+2H2O

这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质类(hemeProteins)。过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。

辣根过氧化物酶的作用机理可分以下几步：

第一步，形成绿色有活性的酶一底物复合物Ⅰ：

第二步，复合物Ⅰ转变成红色有活性的复合物Ⅱ：

复合物Ⅰ+AH──→复合物Ⅱ+A （AH：表示还原型氢供体。）

第三步，复合物Ⅱ被还原，释放出酶：

在一定程度上复合物Ⅱ可自发地分解成HRP和产物(P)，亦可与过量的过氧化氢形成无活性的复合物Ⅲ。

辣根过氧化物酶的活力测定方法有多种，主要原理介绍如下：

1、Rz值，提纯工作的后几步以及纯酶溶液可用Rz值表明酶的纯度。

403nm处的吸收代表血红素辅基的吸收，275nm的吸收是蛋白质的吸收，结晶的HRP的Rz值为3.04。测定时的酶浓度为1毫克蛋白/毫升。

2、愈创木酚法：测k4[见反应式(3)]。以愈创木酚(邻甲氧基酚，guaiacol)为氢给体，其反应如下：

四邻甲氧基连酚有色产物四邻甲氧基连酚(E470nm = 26.6mM－1〃cm－1)生成的速度(dx/dt)与底物过氧化氢以及氢供体愈创木酚的浓度有关。方程如下：

e—酶浓度；

α0—氢供体起始浓度；

x0为过氧化氢的起始浓度。

如果测定的条件选择成k4α0》k1x0，可以测得k1：

所以

所以：

—测定过程中底物减少的速度。

本实验是采用测定k4的方法来判断酶的纯度。

上述测定Rz值和k4值的方法虽然比较简单，但都不能测得酶的实际活力单位。测定过氧化物酶的传统方法是连苯三酚试验法，以过氧化氢为底物，在酶作用下，连苯三酚可形成红棓酚(Purpurogallin)，在430nm处测定产物的形成。用红棓酚值(PZ)表示酶的活力。PZ表示在标准测定条件下1毫克酶所形成的红棓酚微克数。