细胞培养

第一章

1.原代培养：也称初代培养, 是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。

2.细胞系：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。

3.细胞培养与组织培养，泛指所有的体外培养，即器官、组织和细胞培养的总称。其本意是从活体内取出的组织或细胞，模拟体内生理环境，在体外建立无菌、适温和一定营养的条件，使细胞生存和生长，并维持其结构与功能的方法。

4.组织培养的方法主要有三种：

器官培养：培养物保持全部或部分体内组织结构，培养于液体／气体交接处。

原代外植块培养：将一小块组织放在玻璃或塑料培养器皿与液体交接处，待组织块粘着后，沿底平面移动生长。

细胞培养：将原代外植块生长晕用机械法或酶法分离细胞，作成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长或在培养液中呈悬浮状态培养。

5.传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。

当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。

第二章

1.细胞生长特点：大多数实体组织来源的细胞都以单层附着方式生长，除非发生转化和失去贴壁依赖性。从组织中分离出来或传代后，细胞会先附着在底面并在底面铺展，然后进行增殖。细胞的黏附是通过特异的细胞表面受体与细胞外基质分子结合实现的。

2.细胞外基质由胶原、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、透明质酸酶、蛋白多糖及膜结合生长因子（或细胞因子）等各种成分组成。ECM能提高细胞的生存、增殖和分化能力。

接触抑制：贴壁生长的体外正常细胞一旦汇合、相互接触后便停止了分裂增殖，不再进入S期，也不会出现交叉重叠生长。

3.有助于诱导细胞分化的条件：细胞密度高细胞与细胞、细胞与基质之间作用强培养基中存在各种分化因子

细胞分化常受到细胞增殖的拮抗

第三章

1.根据材料的要求采用不同的灭菌方法。

物理方法：湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线、射线、过滤、离心沉淀等；

化学方法：化学消毒剂、抗生素等。

高温干热消毒：一般在烤箱进行，主要用于消毒玻璃器皿、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。灼烧常利用台面上酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。高温湿热灭菌：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、玻璃器皿、金属器皿和某些培养液都可以用这种方法灭菌。煮沸消毒也较常用，条件简单、使用方便。

紫外线消毒：紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。紫外线通过破坏微生物的核酸及蛋白质等使其灭活，同时产生臭氧杀死微生物。

过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。

化学消毒：0.1%新洁尔灭水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒；75％乙醇。抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。通常是青霉素和链霉素联合使用。

第四章

常用的消化液有胰酶溶液和EDTA 溶液，有时也用胶原酶溶液。可分别单独使用或混合使用。

1.胰酶溶液：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解（作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健）从而使细胞离散。

因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

2.EDTA 溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间的连接，对细胞毒性小。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA 和胰酶的混合液进行消化。

EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。

EDTA 溶液用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。

3.胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对上皮细胞产生损伤。胶原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制。

4.培养基是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。

血清：最常用的天然培养基，含有丰富的营养物质，包括大分子蛋白质和核酸等，对促进细胞生长繁殖、黏附及中和某些物质的毒性有一定作用。

血清的主要成分

血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。

5.血清主要作用

（1）提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。

（2）提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。

（3）提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。

（4）提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。

（5）对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。使用血清可终止胰蛋白酶的消化作用。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子，在代谢解毒中起重要作用。

第五章

1.原代培养期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4 周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。

传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。

2.如何让接种的细胞尽快贴壁，是决定培养成功的关键步骤：

取决于适当的生长基质表面；可降低接种后培养液对细胞的浮力，如先少补加少量培养液，待细胞贴壁后再补足营养液继续培养；注意适当的细胞接种密度，一般105 个/ml 左右。

3.首次传代时一般要特别注意以下几点：

细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面（80%）；

传代时不同的细胞使用不同的消化时间，吹打细胞时动作要轻巧；

首次传代时细胞接种数量要多一些，是细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。

4.细胞传代方法：贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；悬浮生长的细胞采用离心分离后传代。

5.细胞冻存的理由：遗传不稳定导致基因漂移；衰老导致细胞系消失；生长特性转化；选择和去分化导致表型不稳定；微生物污染；其他细胞系交叉污染；粗心操作导致鉴别错误；培养箱故障；保存不立即使用的细胞系；细胞系的寄赠、交换和购买。

深低温保存法(－70℃~－196℃) ：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。

细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

6.为使细胞复苏时存活率最高，最佳的冷冻条件是尽可能地降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤。

缓慢冷冻，使细胞内水分离开细胞，但不可太慢以避免冰晶形成；用亲水的低温保护剂排除水分；在尽可能低的温度下保存细胞，降低高浓度盐对冰中蛋白质变性的影响；

快速复苏，减少细胞内晶体形成，以及细胞内残余的冰溶解时可溶性成分的产生。

7.冻存细胞应尽可能快的进行复苏，以减少升温过程中细胞内冰晶的生成。冻存和复苏的原则：慢冻快复。

可在盛有温水的桶中或水浴中进行。冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。复苏后缓慢稀释细胞悬液，因为快速稀释可降低存活率。大多数细胞不需要离心，贴壁细胞只需次日换液，悬浮细胞进行稀释即可；对DMSO敏感的细胞复苏后必须离心。

8.组织培养污染物包括：

生物（真菌、细菌、病毒和支原体）

化学物质（影响细胞生存、非细胞所需的化学成分）

细胞（非同种的其他细胞）

减少污染：通常选高压灭菌被污染的细胞，然后弃掉。如果有价值的细胞被污染，并且污染程度较轻，可以通过及时排除污染物，挽救细胞恢复正常。

常用的排除微生物污染的方法有以下几种：

抗生素排除法：抗生素是细胞培养中杀灭细菌的主要手段。

加温除菌：根据支原体耐热性能差的特点。

动物体内接种：受微生物污染的肿瘤细胞可以接种到同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭掉微生物，肿瘤细胞却能在体内生长，待一定时间，从体内取出再进行培养繁殖。

与巨噬细胞共培养。

第七章

肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增殖、遗传性状等方面都有显著的不同。

培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：

形态和性状：培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。

电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则。

生长增殖

肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。

癌细胞或发生恶性转化后的细胞，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。

癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。永生性：也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡。

浸润性：是肿瘤细胞扩张性增殖行为。

异质性：所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。

细胞遗传：大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。

依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。

第八章

1.干细胞是一种具有自我更新、高度增殖以及多种分化潜能的未分化细胞。

2.当受精卵分裂发育成胚囊时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。

定义：ES细胞一般是从发育早期的胚胎内细胞团中分离培养出来的一种具有自我更新、无限增殖能力的干细胞。

胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。

成体干细胞是指存在于组织中的未分化细胞，该种细胞能够自我更新并能够分化形成组成该类组织的细胞，包括间充质细胞、造血干细胞、神经干细胞等。

3.胚胎干细胞的性质：衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；永生化；

能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；

能参与胎儿所有组织的发育过程。

4.ES细胞系的生物学特性：无限增殖性：在不分化的前提下，ES细胞体外增殖迅速。

分化潜能性：ES细胞可以分化形成包括三个胚层在内的各种类型细胞；

当ES细胞培养体系中去除抑制分化因素时，便能自发分化为血细胞、内皮细胞、肌细胞和神经细胞等；ES细胞在体外某些物质的诱导下可以发生定向分化。

种系传递性：将ES细胞注入囊胚后发育可获得嵌合体，并参与生殖细胞的合成。

5.ES细胞的应用前景：ES细胞在生命科学各个领域都有重要的作用和影响，尤其在克隆动物，转基因动物生产，发育生物学，药物的发现和筛选，动物和人类疾病模型，细胞、组织和器官的修复与移植治疗以及组织工程等方面都有着诱人的应用前景。

建立哺乳动物发育的体外模型；生产转基因动物；基因和细胞治疗；器官培养等

6.干细胞和肿瘤细胞的相似性：自我更新；产生分化程度不同、表型特征不同、增殖潜能不同的细胞，以及构成组织；激活抗凋亡途径；迁移和转移。

成体干细胞的特点：数量少，难以识别、分离纯化；体外培养时不能长时间增殖

具有可塑性（神经干细胞—造血干细胞）；在完全分化前经历一个中间类型即祖细胞阶段

第九章

1.细胞活力测定：(1)染料排斥法

细胞损伤或死亡时，某些染料可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色；而活细胞能阻止这类染料进入细胞内。台盼蓝排斥试验原理：台盼蓝能使死细胞着色（淡蓝色），而活细胞拒染。

(2)染料摄取法：活细胞可以摄取二乙酰荧光素，并将它水解成荧光素，荧光素不能透过活细胞的细胞膜，活细胞发出绿色荧光；死细胞可以被碘化丙啶染色，发出红色荧光。

(3)克隆形成试验：是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一。精确、可靠，操作繁琐，常用于抗癌药物敏感性试验，肿瘤放射生物学试验等。

(4)四唑盐（MTT）比色法

测定细胞存活和生长。快速、简单、灵敏度高，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。

原理

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶物甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。

DMSO能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。

2.细胞凋亡的检测方法：细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。形态学观察；电泳法；酶联免疫吸附法；原位缺口末端标记法

3.染色方法：原理：使死细胞着色的大多数是酸性染料，它们不易穿透活细胞的质膜，进入胞内，却能渗进死亡的细胞，使死细胞着色。

(1)苏木素－伊红染色（HE 染色法）

原理

碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变折射率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像。酸性细胞核被苏木素染成蓝色，而碱性的胞浆被伊红染成红色。结果：胞核呈蓝色，胞浆呈红色。

(2)甲基绿－派诺宁染色法Giemsa 染色:结果核染色呈粉红或紫罗兰色，核仁呈蓝黑色，细胞质浅灰蓝色。

(3)瑞氏（Wright ）染色吖啶橙（ＡＯ）染色法活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光Hoechst33258 染色法