生物指纹图谱调研报告

中药生物指纹图谱调研报告

一、中药生物指纹图谱简介

中药生物指纹图谱（biological fingerprint of TCM）是利用基因组学和蛋白组学技术研究药材基因型特征和中药作用于特定生物细胞后引起基因和蛋白的表达的变化规律和作用机制，从分子水平上揭示中药、中药与生物的细胞作用后的基因与蛋白的表达特征，研究解决化学成分和药理作用、药效活性的相关性，是中药指纹图谱研究的一个重要方面和最高级阶段。主要包括中药基因组学指纹图谱、中药蛋白组学指纹图谱和中药材DNA指纹图谱[1]。

目前，由于宏观上中药作用靶点和作用机制的多样性及对基因作用的多样性，中药基因组学指纹图谱和蛋白质组学指纹图谱可反映中药制剂作用于某特定细胞或动物后所引起的基因或蛋白的特定构象的复杂变化情况。这两种指纹图谱可称为生物活性指纹图谱。这种指纹图谱不但包含了化学信息，也体现了和此相关的药效、临床疗效等生物医药信息，通过比较不同蛋白质、基因指纹图谱体现的不同药效结果，就可确定何种物质基础(化学成分群)是该中药制剂的最佳方式，而且为解决中药研究中缺乏标准品的难题提供了一条可行之路[1]。目前，中药基因组学和蛋白质组学有关指纹图谱的研究工作正在开展。中药蛋白质组学及基因组学指纹图谱可从分子水平上丰富整个中药指纹图谱研究体系。无论是中成药二次开发，还是中药新药研究，都有一个关键问题需要解决--逐步在分子水平上研究解决化学成分(物质基础)和药理作用、药效活性的相关性。而其中，通过蛋白质组学的研究得到的蛋白质组学指纹图谱又具有很高的说服力。

中药材DNA指纹图谱多运用聚合酶链反应(PCR)从不同生物样品中人工合成DNA片段,这种DNA片段的大小、数目因不同生物而异,因而称之为DNA指纹图谱。由于DNA分子标记技术直接分析的是生物遗传因子而非表现型,所以结果可不受环境因素、样品状态和材料来源等外界条件的影响,因此为中药品种鉴别中极为可靠的手段。随着分子生物学技术的发展,已有文献报道用DNA指纹图谱作为药材的鉴定方法.李晓波[2]等人的研究预示DNA指纹技术正在逐渐成为中药鉴定的一种新方法。DNA指纹图谱由于其特点，无法客观反映药用植物因外部环境影响基因表达造成的药效成分含量的差异，只能用于药材种质资源的考察。对于DNA指纹技术在中药材鉴定方面的推广和普及的关健是

降低检测成本和简化操作过程。目前，应用于中药质量研究的DNA分析技术主要有分子杂交和PCR两方面。前者有以低拷贝序列基因为对象的RFLP(限制性内切酶片段长度多态性),以中度重复序列为对象的卫星DNA指纹图，后者有RAPD(随机扩增多态性DNA)，AFLP(扩增片断长度多态性)和DNA测序等。

二、中药生物指纹图谱应用

中药谱效关系研究弥补了目前以化学指纹图谱控制中药质量时与药效脱钩的不足，可为中药质量控制提供更为科学有效的数据。但是中药谱效关系研究需要制备足够量的样品开展药理实验，因此不适于中药复杂体系效应成分的高通量筛选与确证。为此，高通量筛选中药效应成分的生物指纹图谱技术的出现为中药有效性评价提供了另一思路和方法。生物色谱法是应用最早的生物指纹图谱技术，包括分子生物色谱、生物膜色谱和细胞生物色谱等，其基本原理是将生物大分子或靶体甚至细胞(酶、受体、DNA、仿生物膜、细胞等)固着于色谱担体上，作为一种生物活性填料用于液相色谱，形成一种能够模拟药物与生物大分子、靶体或细胞相互作用的色谱系统，这样就可以利用色谱参数快速、精确、稳定地表征药物与生物大分子靶体或细胞间的相互作用。由于能与生物体系发生相互作用是化学成分发挥药效的前提，因此可借此从复杂的中药化学成分中筛选潜在的效应成分(组)。例如，孔亮等[3]根据不同药物与人血清白蛋白(HSA)结合力的差异，应用HSA分子生物色谱分析中药活性成分。在相同的色谱条件下，用HSA柱分别分离了当归、黄芪、川芎和赤芍四种单味中药的水提物，发现它们的分离情况各有特征。当归、黄芪谱图中各有4个明显的保留组分，赤芍谱图中有2个保留组分。与HPLC相比，HSA分子生物色谱排除了大量非作用成分的干扰，同时，与HSA的相互作用可表征化学成分在体内的分布、代谢及排泄等过程。为此，HSA分子生物色谱法可用于筛选中药中可能的生物活性成分。

目前，对中药生物指纹图谱的研究开展较少，较成熟的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）同工酶法和随机扩增多态DNA技术（RAPD）等方法。

石俊英等［4］在国内首先将PAGE法应用于植物、动物类中药材的真伪鉴别。

DNA指纹图谱技术比传统的四大鉴别方法更为准确、客观，适用范围更广，非常适合于近缘种、易混淆品种、珍稀品种、动物药材、破碎药材、陈旧药材、腐烂药材及样品量极为有限的植物模式标本、中药出土标本、古化石标本等珍贵

样品的鉴定[5]。它不仅能区分相近物种(同科、同属不同种)，而且可以检测外型极为相似的同种中不同变种、变型、品系、乃至个体之间的DNA的细微变异。这一技术近年来正越来越广泛地被应用于中药材鉴别，道地药材的鉴定以及动、植物中药种质资源和遗传育种的研究中,并且取得了令人瞩目的成果。Mizukami 比较分析了当归Angelica acutiloba(Sieb.etZucc.)Kitag.、三岛柴胡B upleurum falcatum acut.sin.non L.和珊瑚菜Glehnia littoralis Fr.Schmidt exMiq.的5S rRNA基因的间隔区的碱基序列，针对该DNA片断的序列差异，选用限制性内切酶HindⅢ消化PCR产物，所获得的图谱可鉴别此3种药材[6]。王建云等从鸡内金类药材中提取DNA，采用cyt2b基因PCR特异扩增,DNA测序得到约143个碱基的序列片断，其中36个碱基的差异可以明确区分外观十分相似的鸡内金与鸭内金[7]。王义权等在蛇类药材的cytb基因片断序列分析基础上，设计了金钱白花蛇PCR 鉴别的一对高特异性引物BuL-Ⅰ和BuH-Ⅰ，用此引物能在药材粉末中检测出被检样品中是否含有金钱白花蛇[8]。Hashimoto等[9]用PCR方法扩增了鹿茸、蝮蛇和海马的12S rRNA和cytb基因片断，并对鹿茸的PCR产物进行了测序，经电泳检测可达到鉴别的目的，同时还建立了制剂中鹿茸的检测方法。

中药材真伪鉴别及品种鉴定是目前DNA指纹图谱技术在中药研究中应用最多的一个领域。目前药材市场上还大量存在不同替代品混用的现象，不同地区同名异物入药，或是紧俏药材使用其近缘植物入药，甚至使用其它伪品假冒名贵药材。尽管药材在干燥过程中DNA有所降解，但干品仍然带有足够多的DNA信息特别是稳定的小分子带，可供鉴别药材使用[10]，因此，不论新鲜药材还是干品饮片，或是不同药用部位，通过DNA指纹图谱技术皆能准确予以鉴别。近年来这方面的研究较多，如人参、西洋参的鉴别[11]，西洋参及其伪品的鉴别[12]，人参不同栽培品种鉴定[13]，山参、园参与西洋参指纹图鉴别[14]，厚朴及其伪品的鉴别[15]，大黄正伪品的鉴别[16]，不同产地牛蒡子DNA指纹图谱鉴别[17]，金银花品种鉴定[18]。

中药材的质量除了与药材特定的生长环境和特殊的采收加工技术有关外，还与该药材产区内这一物种的地方种群或居群中遗传上的特殊性有关，这就是药材的“道地性”。但以前对道地药材“道地性”的研究仅限于化学、药理学方面。通过DNA分子手段和化学、药理学手段结合对道地药材进行研究，并进一步对遗传

因素和环境因素在药用植物有效成分形成中的地位及其相互作用的关系进行研究，能更好地对道地药材、名优药材进行品质评价，这对指导道地药材的科学栽培、饲养和药用优良品种的选育具有重要意义。李萍等［19］用SDS法提取金银花（FlosLonicera japonica）不同居群、外类群细毡毛忍冬（L．simitis）和山银花（L．confusa）的总DNA，进行5S-rRNA基因间区的PCR扩增和测序，并用软件Mega进行分析。结果显示，Lonicera L．属植物5S-rRNA基因间区约210bp，其中G+C含量较高，达70%左右；不同居群的L.japonica碱基序列有差别，通过测序可以进行鉴别。L．confusa与L．japonica间的遗传距离较大。种间5S-rRNA基因间区的序列差异大于种内；道地药材之间的遗传距离较小；道地与非道地药材之间的遗传距离大于道地药材之间的遗传距离。可见通过对道地药材DNA指纹的认定，还可提供划分药材档次的分子标记。

三、结语

化学指纹图谱反映中药的质量优劣，而生物指纹图谱反映中药的品种真伪。从中药的遗传物质到化学活性成分的系列研究，以生物遗传数据库、化学成分数据库为基础，运用数学方法建立多元统计模型，可体现出中药生物信息与化学信息的复杂关联，创立全新的中药鉴别和质量评价体系。

从中药新药研究出发，可在开始研究阶段，即同时进行化学成分指纹图谱和生物指纹图谱的研究，一举达到建立同时体现化学和分子生物指纹图谱。这样，中药新药开发研究乃至整个中医药理论将会增添更多的方法和内容，实现中医药理论质的飞跃。

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紫菀药材的高效液相色谱指纹图谱与定量分析讲解

生长在同一地段而致误采。其二是三脉叶马兰生长范围较广而且量多，某些药农见利忘义有意伪充。 ４．２ 药材切成饮片后，形状上较难分辩，但二者的 头状花序较易区分，刘寄奴的呈椭圆形，白色似米粒，小花全为管状花，其叶脉羽状，无离基三出脉。药材具芳香气，味淡。而三脉叶马兰头状花序呈半球形，较大，小花有舌状花和管状花，其叶有离基三出脉和羽状脉。气微，苦、辛。４．３ 二者的显微特征差别较大，刘寄奴药材表面 具“Ｔ”字形非腺毛，腺毛顶面观呈鞋底形；叶主脉底部钝圆略呈圆锥形，上表面稍突起，且中央微凹。叶 图６三脉叶马兰的粉末显微特征 １．非腺毛２．草酸钙针晶３．方晶４．腺毛５．簇晶６．花粉粒７．叶下表皮及气孔 肉组织与茎髓薄壁细胞中有草酸钙簇晶散在。三脉叶马蓝无“Ｔ”字形非腺毛，叶主脉上下面突起明显，底部钝圆呈半圆形。髓部薄壁细胞内含多数短小的草酸钙针晶。二者花粉粒的形态和大小，表面特征差异也较明显。 参 １ 处理２０ｍｉｎ，过滤，取滤液加９５％乙醇稀释至适量浓度。于岛律ＵＶ２４５０型紫外分光度计上，在２００— ４００ ｎｍ波长范围内测定其紫外光谱。结果：刘寄奴 考 文献 在３３０ｎｍ波长处有一最大吸收峰，在３００ｎｍ波长处有肩峰；而三脉叶马兰仅在３２９ｎｍ波长处有一最大吸收峰。 ４４．１ 中国医学科学院药用植物资源开发研究所，中国医学科学院药物研究所等．中药志．第四册．ｊＥ京：人民卫生 出版，１９８８：４３ 讨论 刘寄奴的混杂原因可能有二：其一是二者均 ２ 李时珍．本草纲目（校点本，上册）．北京人民出版社，

１９９ｌ：９５９ 来源于菊科植物，在开花之前茎叶的形状和色泽均有相似之处，其生长环境与习性相似，且二者常混杂 （２００３一１１—２６收稿） 紫菀药材的高效液相色谱指纹图谱与定量分析 周军辉１伍蔚萍１谢子民２孙文基ｈ （１．西北大学陕西省生物医药重点实验室，西安７１００６９；２．西安市药品检验所，西安７１００６８） 摘要目的：建立紫菀药材的反相液相色谱定性和定量鉴别分析方法。方法：Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ。。色谱柱（２５０ ｍｍ×４．６ｍｍ，５斗ｍ），流动相为甲醇－乙腈（１：２）－０．４％磷酸梯度洗脱，流速为１．０ｍｌ／ｍｉｎ，检测波长为３６０ｎｍ，柱温为２５℃。紫菀药材经８０％甲醇超声处理，进行指纹图谱分析，并对紫菀药材中的主要成分槲皮素进行含量测定。结果ｉ在该色谱条件下，６份不同紫菀药材的ＲＰ－ＨＰＬＣ指纹图谱中可检出１０个共有峰作为定性鉴别；紫菀药材中槲皮素的含量在０．１３５％一０．２４６％之间。结论：本方法样品处理简便，准确性好，可用于紫菀药材的质量控制。 关键词 紫菀槲皮素反相高效液相色谱法 紫菀为菊科植物Ａｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ￡的干燥根 在我们制定的紫菀指纹图谱中，含有分离较好的槲皮素色谱峰，这样，既可以得到指纹图谱提供的紫菀化学成分组成信息，又可测定槲皮素有效成分的含量。１ 及根茎，有润肺下气、消痰止咳的功能，用于痰多喘咳，新久咳嗽，劳嗽咳血，是许多常用的止咳平喘复方中药制剂中的重要药物之一。槲皮素（ｑｕｅｒｃｅ．ｔｉｎ）为紫菀中已知的有效成份之一，现代药理研究表明，它具有较好的祛痰、止咳和一定的平喘作用。 －５６２? 仪器与试药 ＢｅｃｋｍａｎＧｏｌｄ Ｓｙｓｔｅｍ高效液相色谱仪，包括

高效液相色谱法在中药指纹图谱中的应用现状及分析(一)

高效液相色谱法在中药指纹图谱中的应用现状及分析(一) 【关键词】高效液相色谱法 摘要：综述了高效液相色谱(HPLC)法指纹图谱在中药质量控制方面的应用，并通过供试品的制备、标准品的选择、结果分析方法来阐述中药指纹图谱的应用现状，指出高效液相色谱法应用于中药指纹图谱中现有不足之处和未来的发展方向。 关键词：高效液相色谱；中药指纹图谱ApplicationandAnalysisofFingerprintinTraditionalChineseMedicinebyHPLC Abstract:ThispapersummarizedtheapplicationoffingerprintoftraditionalChinesemedicinebyHPLCto thequalitycontrol.ItalsoreviewedtheactualityoffingerprintintraditionalChinesemedicinethroughth epreparationforsample,thechoiceforstandardsample,andthemethodofresultanalysis.Thenpointed outthemainproblemsatpresentandtheprospectivefutureinapplicationoffingerprintoftraditionalChi nesemedicinebyHPLC. Keywords:HPLC;FingerprintofTraditionalChinesemedicine 当前，中药指纹图谱技术在国内外已成为一种发展趋势。首先是美国食品与药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图。世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定：如果草药的活性成分不明，可以提供指纹图谱以证明产品质量的一致。欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制〔1〕。我国自200008国家药品监督管理局颁发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》(国药管注〔2000〕348号)以来，中药指纹图谱的研究成为中药研究的热点。国家药品监督管理局要求到2002年末，所有申报的中药注射剂均应有相关的指纹图谱资料，包括中药原料、提取物、产品3种图谱，3种图谱的峰形必须有较大的相关性，否则不予受理〔2〕。 1中药指纹图谱 中药指纹图谱是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别手段，用以对中药材和中成药进行鉴别真伪，评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性。其基本属性是“整体性”和“模糊性”。“整体性”是指完整地比较色谱的特征“面貌”；“模糊性”强调的是对照品与待测样品指纹图谱的相似性〔3〕。指纹图谱一般包含两层含义：1.必须反映出该药材(或成药)有别于其他任何物质；2.对于中药材，指纹特征还能反应出产地和采收期不同而造成的差异；对于中成药，则能反映出同一产品不同批次间的质量差异，差异越小说明药材(或成药)的稳定性越好〔4〕。 2HPLC用于中药指纹图谱的情况 文献分布表明，对中药指纹图谱的研究始于1993年，从1993～1999年共发表11篇〔5〕，指纹图谱的研究基本处于未开发状态。而从2000年开始，研究中药指纹图谱的文献呈直线上升趋势，尤以近2年发展最快，与指纹图谱相关的文献报道就有上百篇，其中又以高效液相色谱法研究的指纹图谱居多，高效液相色谱以其应用的广泛性，检测的精确性成为控制中药质量最主要的检测方法。至今已有50种中药材，21种中成药运用HPLC法测定其指纹图谱并发表。 据文献统计，目前已对下列中药材运用HPLC进行了指纹图谱研究：枸杞、柴胡、新疆雪莲、夏天无、延胡索、白芍、白鲜皮、板蓝根、补骨脂、黄芩、赤芍、川东獐牙菜、川芎、刺五加、大黄、丹参、当归、地黄、茯苓、麻黄、甘草、葛根、马甲、红车轴草、红花、厚朴、怀牛膝、鸡血藤、金银花、绿衣枳实、密花石斛、牛膝、秦艽、人参、西洋参、忍冬、山银花、山楂、芍药、水蔓菁、乌拉尔甘草、五味子、石斛、仙茅、旋覆花、淫羊藿、三七、泽泻、栀子、西红花。中成药中采用HPLC进行指纹图谱研究的有：咳必安胶囊、灯盏花素注射液、白屈菜注射液、板蓝根颗粒、补肾方、川芎制剂、丹参注射液、丹参葡萄糖注射液、复方丹参片、参麦注射液、红花注射液、红景天注射剂、黄连解毒汤、脉络宁注射液、人参

蜂蜜高效液相色谱指纹图谱的研究进展

摘要：指纹图谱技术在食品的质量控制中起着重要的作用。本文主要介绍了高效液相色谱指纹图谱在蜂蜜研究中的应用，以期为蜂蜜的鉴定、质量控制及标准的制定等方面工作奠定基础。 关键词：蜂蜜高效液相色谱指纹图谱 蜂蜜是一种传统的天然保健食品。它是由蜜蜂采集植物的甜味分泌物，通过蜂蜜自身的消化，转化作用及蜜蜂通过气流干燥作用，使水分从花蜜中含６０％以上降低到２０％以下。一般蜜蜂从采集花蜜到酿制为成熟蜜，正常情况下需要３～５ｄ时间［１］［２］。 糖类是蜂蜜的主要的成分，其中有单糖、双糖、低聚糖和多糖，单糖中的葡萄糖和果糖占蜂蜜总糖的５５％～７５％，而双糖和三糖的含量因蜜源种类的不同而变化。此外，蜂蜜还含有多种蛋白质、氨基酸、脂肪酸、维生素及人体所必须的矿物质及微量元素，营养十分丰富［２］［３］。多年来的科学研究与医学临床都证明，蜂蜜具有促进食欲、改善肠胃功能、促进消化吸收、镇静安神、提高肌体免疫能力，促进儿童生长发育等功效；它不仅对婴幼儿、运动员、老人及体弱多病者、重体力劳动者、高强度脑力工作者来说是一种直接有效的营养补充来源，而且对治疗烧伤、烫伤、溃疡愈合、促进伤口愈合及心血管病的辅助治疗等方面来说有很好的疗效［４］｛５］。 蜂蜜作为一种营养丰富、易被人体吸收的天然食品在国内外市场上深受消费者欢迎。为规范蜂蜜市场，保证消费者的利益，我国于１９８２年和２００２年分别颁布了蜂蜜行业标准和推荐性国家标准；但是目前就蜂蜜质量来说，全国各地在蜂蜜生产、流通中仍存在很多不规范的环节，更甚的是出现许多人为掺杂假使的行为，而当前的国家标准不能满足快速、准确的检测需要。 高效液相色谱指纹图谱技术已经广泛的应用于食品行业，特别是药物化学中的中药指纹图谱已经取得了重大的进展。在蜂蜜市场较为混乱且没有准确、快捷的检测方法的情况下，期望建立蜂蜜的高效液相色谱指纹图谱成为必然的趋势。 １．指纹图谱的含义 “指纹（Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ）”识别技术起源于１９世纪末２０世纪初的犯罪学和法医学。作为一种综合、宏观的和可量化的鉴别手段的指纹图谱，是指经过适当的处理后，采用一定的分析手段如光谱或图谱，得到能够标示该样品特征的色谱或光谱的谱图或图象。在完整地呈现出色谱的特征“面貌”的前提下，表达了对照品与待测样品指纹图谱的相似性，用以产品真伪鉴别，评价其质量的均一性和稳定性。 蜜源植物的花蜜是蜂蜜的主要来源，由于同种蜜源植物具有整体的遗传相似性，因此，同一种类的单一花蜜在成分上也具有相似性。同时，经采集、酿造后的成熟蜂蜜其成分除糖类的含量有明显变化外，来源于蜜源植物的次生代谢物质等微量活性成分一般不会发生较大的变化，这使指纹图谱技术应用于蜂蜜种类和真伪鉴别成为可能。借助于现代分析技术对蜂蜜中主要特征功效成分信息以图形（图像）的方式进行表征并加以描述，这就是蜂蜜指纹图谱的内涵［１８］。 ２．指纹图谱的种类 指纹图谱已广泛的应用于食品品种和质量的鉴别，其根据测定方法的不同，大体分为色谱指纹图谱、光谱指纹图谱和ＤＮＡ指纹图谱。其中，以高效液相色谱指纹图谱应用最为广泛。 ２．１色谱指纹图谱 色谱技术种类繁多，是获得指纹图谱的最常用的方法。其中，高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）是应用最多的一种方法，６０％～７０％的有机物均可应用，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点，是所有光谱色谱分析中最适合绘制指纹图谱的方法。近２０多年来，随着仪器和柱技术、样品预处理技术的发展成熟及仪器的日益普及，ＨＰＬＣ作为食品中的营养成分、功能因子、食品添加剂及污染物的一种快速、准确、易于自动化的检测手段，在食品分析中的应用发展很快；高效液相色谱－质谱（ＭＳ）联用，能够将未知成分的各峰进行归属；当前，高效液相色谱已经用于蜂蜜某些糖分的定量与定性的常规分析；反相液相色谱在类黄酮成分分析方面也有很多的报道［６］。 薄层色谱（ＴＬＣ）法出现于１９５６年，具有操作简单，展开剂组成灵活多样，色谱后衍生方便，可以提供色彩斑斓 蜂蜜高效液相色谱指纹图谱的研究进展 西南大学食品学院王文静