组织培养

体细胞胚胎发生及农杆菌介导转化

摘要：通过直接和间接的手段（介导的愈伤组织）为Bixa orellana的建立，维护，再生，改造体细胞胚已经实现，Bixa orellana是一种热带植物，其种子生产市售食用红木色素，而食用红木色素主要构成apocarotenoid称作安必信。愈伤组织介导的方法被认为是短时间内生产大量细胞胚的最有效的方法。未成熟的合子胚接种在Murashige和斯库格（MS）培养基上，培养基中包含有0.44微莫的苄基腺嘌呤（BA）、0.054微莫α-萘乙酸（NAA）、2.89微莫赤霉素（GA3）、0.02微莫三碘苯甲酸（TRIA）。在生长到16-18周的时候有最多28个体细胞肧产生。愈伤组织通过下胚轴吸收MS培养基中的营养，培养基中加有4044UMBA，40UMAgNO3和0.011UMTRIA。体细胞胚在含有0.44-0.4UMBA，0.54-2.69NAA，4.96UM钙，0.21UM生物素，227.7UM一水半胱氨酸盐酸和108.6UM腺嘌呤硫酸盐。农杆菌GV3101含有P CAMBIA1305.2二元载体介导的稳定转化体。胚胎展示出了2.56%的转化率。由于体细胞胚在任何与商业化和科学性相关的多年生体系中都是非常有用的，基于这个体细胞胚的途径，对商业上重要的燃料高产的热带植物B2奥雷利亚纳进行基因工程改造是有用的。

关键词：农杆菌、红木素、再生、生根、三十烷醇

缩略词：

BA：苄基腺嘌呤

GA3：赤霉素

IAA：生长素-3-吲哚乙酸

MS：Murashige-Skoog培养基

NAA：萘乙酸

PGR：植物生长调节剂

TIBA：2，3，5-三苯基甲酸

TRIA：三十烷醇

介绍

体细胞胚胎对任何植物转化来说都是主要的工具，不管是农杆菌介导还是基因枪这两种主要的植物转化方法，因为最初的是通过基因工程试验来改造农作物基因的。相似的，植物组织学上，体细胞胚扮演者一个比任何其它器官部分都重要的角色。红木色素主要是构成安必信和norbixin种子上的假种皮部分。(2n = 2x = 14)。他们也被称为含氧的类胡萝卜素。这两个主要着色成分红木色素的脂溶性diapocarotenoid90顺安必信，一个norbixin的甲基酯，二元酸的水溶性90-norbixin 顺。基于结构特征，他们被列为异戊二烯衍生物（哈日等，1994）。欧盟已批准作为食品添加剂43着色剂，被分配一个不同的'E的数量每个着色剂，其中17个是人工合成的，剩下的都是自然或自然衍生化合物（道纳姆和柯林斯2000年）。红木色素的E-号码或EEC（欧洲经济共同体）数量E160b。体细胞胚胎发生的标准化有助于保持和增强乘法利益的精英克隆更高的生产率和经济效益，也为建立和实用工具转变为基因工程研究协议来调节生物合成途径（Kumar等，2006年，2007）。奥雷利亚纳在B，由于种子活力低（20％）和贫困发芽（5％），具有商业价值（D'Souza和沙龙2001），在体外研究。如2,4-D的一些植物生长调节剂，是众所周知的发挥重要作用，在众多的植物物种的体细胞胚的诱导和建立。诱导体细胞胚胎发生在少数几个物种，如咖啡树属（Giridhar等，2004），番木瓜（查亚和其他植物生长调节剂，如三十烷醇（TRIA）和2,3,4 - 三碘苯甲酸（TIBA）Bhattacharya 和Khuspe2000年）。在这项研究中，其中一些植物生长调节剂诱导体细胞胚胎发生和红木再生的影响进行了研究。此外，体细胞胚胎用于发展中国家的红木农杆菌介导转化协议。

材料和方法

外植体的准备和体细胞胚胎的建立

B.，奥雷利亚纳研究（Bixaceae）未成熟的果实（50-60日龄）共收集2006年9月期间，从5岁的植物，在植物细胞生物技术系中央食品技术研究所（CFTRI），迈索尔，印度。收集水果，70％的乙醇浸泡5分钟，其余所有程序使用空气层流无菌条件下进行的。发展中国家的种子取出未成熟的水果，70％的乙醇冲洗1分钟，洗净，用无菌蒸馏水和干燥印迹两次。这些未成熟合子胚全部或胚胎的茎被用来作为单独作为主要的直接体细胞胚胎发生的诱导外植体。

初级细胞胚的诱导

外植体两种类型，即，未成熟合子胚和幼胚柄（缺乏子叶部分），分别接种到Murashige和斯库格（MS）辅以B5的维生素（Gamborg等1968），0.027-0.540.22-4.44 LM苄基腺嘌呤（BA），LM-萘乙酸（Murashige和斯库格1962）酸（NAA），2.89 LM赤霉素（GA3），0.02 LM三碘苯甲酸（TIBA）和0.011 LM 烷醇（TRIA）的培养基上诱导初级的体细胞胚。除了MS培养基中生长调节剂，还包括蔗糖（3％W / V）和0.01％W /V肌醇，培养基的pH值调整到5.7，使用琼脂（0.68％）固化。40毫升到150毫升的烧瓶或玻璃瓶在1.21公斤/厘米-2的压力和121 C温度下灭菌20分钟。一百未成熟合子胚（每瓶10）和100不成熟的胚胎茎（每瓶10）被用于实验。

二次的体细胞胚的建立和维护

主体胚胎获得和二次的体细胞胚的生产分别接种在补充有BA（0.44 LM），萘乙酸（0.054 LM），赤霉素（2.89 LM），TIBA（0.02 LM），TRIA（0.011 LM）而不含琼脂的新鲜的固体和液体MS基本培养基中，分别为，此后，植物生长调节剂组合将简称为RBANGT。

间接体细胞胚胎发生

愈伤组织，辅以1.07-2.14 LM NAA和10.2 LM BA或0.45-0.90 LM 2，4-D和10.2 LM BA的MS培养基上提出建立从体外胚轴接种幼苗。如表2给出了用于本实验的50外植体（每盘10个）为每个植物生长调节剂组合。从1.07 LM NAA和10.2 LM BA的MS基本培养基中获得四个星期的软易碎愈伤组织培养进一步细分到相同培养基进行维护。因此，获得愈伤组织被用于介导的愈伤组织体细胞胚的生产。愈伤组织建立和维护上述次培养到MS基本液体培养基愈伤组织介导的体细胞胚胎发生与BA（0.44-4.44 LM），硝酸银（40LM），TRIA（0.011 LM）补充;这一媒介成分叫做BAT。

体细胞胚胎在体外培养生根

二次体细胞胚培养到MS基本培养基液体与BA（0.44 LM），萘乙酸（0.11 LM），赤霉素（2.89 LM），TIBA（0.02 LM），和TRIA（0.011 LM）。RBANGT和生根培养基之间的唯一的区别是，生长素（NAA）的浓度增加了一倍。五十胚胎的团块（* 4个胚胎丛生），用于在体外生根诱导。

从根再生体细胞胚植株

植根胚苗接种到MS基本固体和液体的媒体辅以BA（0.44-4.4 LM），萘乙酸（0.54-2.69 LM），2IP（4.92 LM），钙的D-泛酸钙（2.1 LM），生物素（0.21 LM），半胱氨酸盐酸盐一水合物（227.7 LM），腺嘌呤硫酸盐（108.6 LM）为他们的进一步增长。

农杆菌体外介导法

体细胞胚接种到含有不同浓度的潮霉素（2，4，6，8，10，12，14，16，18和20毫克的L-1）的RBANGT培养基用于药敏试验。过滤灭菌的潮霉素20毫克每毫升被用来准备RBANGT中潮霉素不同浓度（Duchefa，荷兰），培养保持在黑暗中的初期为1周。

细菌培养转化的准备

农杆菌GV3101中菌株含有的二元载体pCAMBIA1305.2用于标准化改造协议。隔夜生长培养物被用于接种25毫升含卡那霉素的LB，生长保持在28℃和120转速（Gyrotory振荡器SI-600R，Jeiotech，实验室助理，韩国），直到在600 nm 处的吸光度为1.0OD值，这些培养物被用于改造与体细胞胚。

共培养体细胞胚胎

体细胞胚胎生长到1.0外径共培养，农杆菌GV3101中（25毫升的生长密度1.0 OD 值）和乙酰丁香酮溶液与100 LM（30,50 - 二甲氧基-40-羟基- 苯乙酮，Sigma-Aldrich公司，美国）一次震动45分钟，每次间隔10分钟。这些共同培育的体细胞胚印迹干燥下使用层流无菌滤纸，接种到含有10 LMOF乙酰丁香酮RBANGT介质和在黑暗中培养2天。后来，他们组织培养部分中提到的一个正常的光照下保存。一旦细菌过度生长成为可见的，它们分别洗净，用无菌dH2O 含有500毫克L-1浓度的头孢噻肟（Duchefa，荷兰）。因此，洗净体细胞胚胎印迹干燥用无菌滤纸和接种RBANGT含有潮霉素（10毫克L-1）和头孢噻肟（250毫克L-1）的培养基上，培养的步骤，选择在生长室。

转化子的选择和确认

为转化确认，确认使用GUS和hptII的分子引物聚合酶链反应（PCR）的进行，同时，还组织化学GUS测定采用X-glcA确认转基因胚胎的性质。下一步的分子确认和组织化学确认的详细情况。

利用PCR和Southern分析分子转化确认

从二次体细胞的选择培养基中生长的胚胎的基因组DNA，用于PCR分析确认的T-DNA在植物genome.Forward和反向引物特定部分潮霉素磷酸转移酶（hptII）和葡萄糖醛酸酶（GUS）基因的存在Primer3软体（蔷薇和Skaletsky2000）设计和合成，美国Sigma-Aldrich公司。引物序列如下：

HptII F: 5-GAT GTT GGC GAC CTC GTA TT-3ˊ

HptII R: 5′-GTG TCA CGT TGC AAG ACC TG-3′

Gus F: 5′-CCG TCC CAA GCA GTT ACA AT-3′

Gus R: 5′-TTC GGA ATC TCC ACG TTA CC-3′

扩增反应在量的为25.0 ll，每个含16.0 ll灭菌双蒸水，2.5ll 109缓冲液与15毫摩尔氯化镁，1.0ll的dNTP（dNTP混合液各2.5毫米），2.0ll向前反向引物，Taq 聚合酶0.5 ll（* 2.5U）（班加罗尔阁内，班加罗尔，印度），1.0ll模板DNA，扩增反应使用0.2 ml PCR管（爱思进公司）进行一个Eppendorf Mastercycler个人编程的（Eppendorf公司，德国）30个周期进行放大，包括在94°C30s，在55°C 30s，在72°C 1分30秒30，分别称作变性，退火，延伸。这些周期进行之前在94 C有一个2min的初始变性。30个循环后的初始变性2分钟之前，有一个最后延伸72℃5分钟，然后保持在4℃直到电泳。解决扩增产物，其分子量的基础上，由1.0％琼脂糖凝胶基质上运行的产品，使用19 TAE缓冲潜艇电泳（E861康索特，德国），5伏/CM。3 kbp的梯形（MBI的Fermentas公司，德国）被用来确定存在的扩增所需的大小。凝胶染色，并认为在紫外透射。插层剂乙锭

溴（310-320纳米）紫外光照射后发出荧光的橙色。使用Herolab文件单位（Herolab 易通442 K时，德国），凝胶图像已经被记录在案。

假定转化的基因组DNA（约40 LG数量），用EcoRI酶消化Southern blot分析见于Sambrook等人的报告（1989年）。BioBond-PLUS尼龙膜（美国Sigma公司）和600 bp的GUS基因探针杂交。GUS基因探针的制备用补骨脂生物素标记试剂盒（Ambion公司，美国）。杂交信号进行检测，使用非同位素BioDetect套件（Ambion公司，美国）。

使用GUS分析组织化学确认

二次体细胞选择培养基上生长的胚胎用于组织化学GUS测定。GUS检测解决方

案是从杰斐逊等做了轻微的修改。（1987年），代替磷酸钠缓冲，钾磷酸盐缓冲用来准备的GUS检测解决方案。GUS的检测解决方案假定二次体胚培养在37?在杂交炉（1004-2E，谢尔实验室，美国）2天。术后第2天，体细胞胚胎转移至脱色解决方案，以避免叶绿素和其他成分的背景效果可视化蓝色清楚。他们使用尼康数码相机拍摄的。

统计分析

实验重复3次。复制值平均五个观测和数据进行分析，采用方差分析（ANOV A）（Stell torrie1980）。平均值±标准错误结果的平均值（SE）值在本文表。

结果与讨论

在本研究中，未成熟合子胚茎和从下胚轴愈伤组织介导的体细胞胚形成的直接体细胞胚胎发生的高重复性和高效率的协议，发展与稳定转化为B的协议，orellana.Direct体细胞胚胎发生。

直接诱导体细胞胚胎被发现未成熟合子胚茎（从50-60日龄的水果）时，对植物生长调节剂组合优化培养。十六至十八周后接种，RBANGT介质包括MS无机盐，B5的维生素补充0.44 LM的BA，NAA的0.054 LM，2.89赤霉素LM，0.02 LM TIBA，和0.011TRIALM，这些未成熟合子胚胎茎生产较其它植物生长调节剂的浓度（表1，图1A，B）时，最大的28初级的体细胞胚。根据我们的初步研究，这些植物生长调节剂组合进行了优化。同样，TRIA（0.011 LM）ourearlier 研究的关TRIA对咖啡树属植物体细胞细胞胚胎发生影响的研究的基础上。（Giridhar等，2004）。

图1初级Bixa奥雷利亚纳未成熟合子胚茎植体细胞胚胎的形成a横视（15mm）b俯视（30mm）

表一在体外培养16周后未成熟合子胚茎植的直接体细胞胚胎发生

随着不同浓度的BA和NAA，赤霉素2.89 LM，0.02 LM TIBA，和0.011TRIALM被纳入所有处理浓度

值表示平均值±标准误差的平均值（SE）（值是五次的平均重复）

**显著的P\0.01

*显著的P\0.05

利用未成熟合子胚被视为可靠来源的外植体体细胞胚胎发生（邓斯坦等，1995）。2,4-D和激动素的组合一般推荐几个被子植物的体细胞胚胎发生（邓斯坦等，1995），因此，B.奥雷利亚纳早期的研究体细胞胚胎发生是基于2,4-D和激动素（帕维亚内托等人，2003年a）。当成熟合子胚作为外植体，体细胞胚胎发生，没有注意到，但其中大多数是细长的茎，叶，和根发芽。可能，合子胚的发育阶段是非常重要的体细胞胚胎发生（帕维亚内托等人，2003年a）。BA，NAA的

应用比2,4-D的，激动和活性炭更加有优势。（2003年）如无异常是有凹槽和融合体细胞胚。

TIBA存在是体细胞胚胎生产的重要因素，因为TIBA是闻名于世的生长素抑制剂。由于生长素的存在抑制了体细胞胚的形成，TIBA调节体细胞胚的形成（兰詹等，2003），它是在B奥雷利亚纳展出。在其他植物中的类似报告（Bronsema 等2001;。Ramarosandratana和Van施塔登2004）进一步证实了在我们的研究体细胞细胞胚胎生产的TIBA意义。一个非常小的NAA量为0.054 LM补充，以保持经济增长的内源性生长素水平。

获得未成熟合子胚茎的主体细胞胚胎被用来生产接种到同一二次的体细胞胚胎RBANGT介质液体和固体形式。二次体细胞胚的形成在6个星期，被看作是非常健康的，大约10-12中学的体细胞胚胎形成从每所小学的体细胞胚（图2a）根据液体培养基RBANGT。然而，在RBANGT固体培养基接种到主体细胞胚胎的情况下，他们生产的超过35二次体细胞胚（图2b）。这种差异，尽管在相同的培养基组成，可能是由于连续晃动，使新形成的胚胎分离并形成独立的团块和进一步扩散产生二次的体细胞克隆胚胎（图2）。二次体细胞从RBANGT介质产生的胚胎被保持到同一介质中，每6-8周子培养大多是附近发生比主体细胞胚的根部分的先端部分的体细胞胚胎形成开始，图2c中可以看到。

图2a-h 二级体细胞胚胎从初级的体细胞胚形成。a10-12在液体RBANGT介质次生体胚形成（标尺10毫米）。b35-40次生体细胞胚胎固体RBANGT介质形成（标尺5毫米）。c启动次生体细胞胚胎从主体细胞胚（栏1毫米）。d-h单丛二级体细胞胚胎在液体RBANGT培养基中（标尺3毫米）。

间接体细胞胚胎发生

愈伤组织的诱导

1周的培养和进一步的愈伤组织生长，辅以1.07-2.14 LM NAA和10.2 LM BA的MS培养基上，下胚轴外植体ICallus开始明显突出了2周（表2，图3a）。他们每4周一次次培养以获得柔软和易碎愈伤组织。1.07 LM萘乙酸纳入沿10.2 LM BA，在MS培养基诱导下胚轴（图3a）与淡红色的色调棕色颜色愈伤组织，而从获得的愈伤组织，当相同的植辅以0.45-0.9 LM2,4-D和10.2 LM BA的MS培养基上接种了愈伤组织（图3b），如萘乙酸的好。愈伤组织的形成从1.07 LM NAA 及10.2 LM学士学位显示斑点时，在显微镜下观察（图3c）。一个可能的原因为在MS培养基上形成的色素在2,4-D与NAA单独，而不是补充，可能是不同的机制，通过不同的植物生长调节剂的行为。正如早些时候兰詹等报道的。（2003年），颜料生产的2,4-D的影响下，由于事实，即它基本上是一种除草剂，具有不同浓度的生长素财产将受到抑制。

表二愈伤组织的诱导下胚轴Bixa奥雷利亚纳

图3A-C使用NAA和2,4-D诱导B的奥雷利亚纳愈伤组织的下胚轴。从1.07 LM NAA和10.2 LM BA（杆10毫米）的下胚轴的愈伤组织诱导。B从0.45 LM2,4-D和10.2 lMBA（杆15毫米）的下胚轴愈伤组织诱导。c在光学显微镜下观察，从1.07 LM NAA和10.2 LM BA获得的愈伤组织色素的生产（杆500LM）

愈伤组织介导的间接体细胞胚胎发生

保持辅以1.07 LM NAA和10.2 LM BA的MS培养基上的愈伤组织被用来建立体细胞胚。MS液体培养基中与体细胞胚的生产优化的植物生长调节剂的浓度为0.44-4.4 LM BA，40 LM银，和0.011 LMTRIA的补充。MS无机盐和维生素，4.44 LM BA，40 LM硝酸银，0.011 LMTRIA在3个月（图4a，b）的培养基上形成球状阶段的体细胞胚胎。这种培养基组成以下简称为最佳可行中等。这些体细胞胚胎从愈伤组织产生，每6-8周一次次培养到同一介质中的二次体胚的培养。液体培养的显微观察发现，在1毫升培养，164-220胚胎被发现，其中大部分是球状的阶段，并随后将其转移到同一介质中与琼脂领先鱼雷形胚和进一步再生。生长素和硝酸银的结合存在刺激体细胞胚胎器官发生，在canephora有报告（富恩特斯等al.2000，Sridevi等2010）。在体细胞胚愈伤组织的初步建立的情况下，他们略有褐色变成了绿色，而他们当上二次的体细胞胚的生产和保养（图4C，D）同一介质中的子二次的培养。从主体细胞胚（栏1毫米）的体细胞胚。D-H 单丛（栏3毫米）在液体RBANGT介质二次体细胞胚胎。

图4a-f愈伤组织介导的间接体细胞胚胎发生。对BA T利用细胞悬液（杆10毫米）的介质中的体细胞胚诱导。bBAT中等体胚诱导球状阶段（杆10毫米）。C生产BAT中等中学的体细胞胚（杆10毫米）。d维护（插图单一球状体细胞胚体细胞胚）（杆5毫米）。e，f鱼雷阶段体细胞克隆胚胎（杆8毫米）

这些绿色球状体细胞胚，进一步代同一介质上时，在2个月内生产鱼雷阶段的胚胎。在这个阶段，他们要么被代在RBANGT介质，或在BAT介质为进一步保养或进一步利用再生，并在体外转化。

体细胞胚胎在体外培养生根

二次体细胞未成熟合子胚茎或愈伤组织建立胚用于生根。生根体细胞胚胎在体外实现翻一番RBANGT中等NAA浓度。在体外的生根，在2个星期（图5A-C）。在RBANGT介质，NAA浓度为0.054莫耳浓度，而体细胞胚胎生根，NAA浓

度增加至0.11 莫耳浓度。

图5A-C在体外培养的体细胞胚胎生根。A，B诱导生根体细胞胚（杆10毫米）。C单体细胞胚在体外形成主根（杆7毫米）

从根再生体细胞胚植株

如上所述的根植体细胞胚胎被用来只体细胞胚胎发生再生协议的一部分，以获得再生植株。不同植物生长调节剂使用浓度，根体细胞，接种到液体介质，包括MS无机盐和维生素补充BA（2.22 莫耳浓度），萘乙酸（1.07 莫耳浓度），2IP （4.92 莫耳浓度），钙Dpantothenate（2.1 莫耳浓度）的胚胎，随着多芽（表3，图6）从根二次体胚素（0.21 莫耳浓度），半胱氨酸盐酸盐一水合物（227.7 莫耳浓度）和腺嘌呤硫酸盐（108.6 莫耳浓度），以下简称为ABI的介质，产生再生6个星期。钙D-泛酸钙，维生素B5和维生素B7，这是植物生长的重要的水溶性维生素如生物素行为的行为，（Giridhar等，2001）。如腺嘌呤硫酸盐具有细胞分裂素活性用于再生体细胞胚，早些时候已被C.阿拉比卡和canephoraC证实（萨姆森等，2006）。

表三6周的二级Bixa奥雷利亚纳胚胎根的再生

图6A-E根再生的体细胞胚。一个有根的体细胞胚胎在ABI介质产生的微芽（杆10毫米）。b升高观根再生体细胞胚胎ABI介质（杆10毫米）产生的微芽。c拍摄的再生体细胞胚胎ABI介质（杆20毫米）的延伸。d拍摄培养基上再生的体细胞胚的伸长率分别为4.44和0.54 BA和NAA的LM，以及与其他组件（杆10毫米）。e根再生的体细胞胚在ABI的固体介质芽伸长（杆10毫米）

在我们目前的研究中，我们有标准化的另一个再生培养基（BAB）的，以尽量减少ABI的培养基的组成部分。由于有两个ABI的介质中使用的细胞分裂素，细胞分裂素2IP被淘汰，它的生长素（NAA）的，因此，降低BA浓度。修订后的培养基进行了测试1.11 莫耳浓度BA一起从ABI的中等浓度增加钙的D-泛酸

和生物素的比例。半胱氨酸盐酸盐一水合物和腺嘌呤硫酸盐的浓度保持在ABI 的介质的情况下。体细胞胚，接种到固体以及液体的BAB介质包括MS无机盐和维生素，补充钙的D-泛酸钙（42.0 莫耳浓度），BA（1.11 莫耳浓度），生物素（4.1 莫耳浓度），盐酸半胱氨酸一水（227.7 莫耳浓度），腺嘌呤硫酸盐（108.6 莫耳浓度）在1个月（图7a，b）的再生，并在同一介质在一个月一次，直到硬化次培养。从结茎尖外植体或体细胞胚再生植株的正常器官相同的介质回应。

图7A，B体细胞胚在BAB介质再生。一个多芽再生的体细胞胚胎丛（杆15毫米）。b瘦长的芽多芽再生的胚胎（杆20毫米）

农杆菌体外介导法

建立的体细胞胚（无论是从胚胎秸秆或愈伤组织），用于在体外转化研究。与潮霉素的灵敏度studiesfor体细胞胚胎表明，不同浓度测试（2-20毫克的L-1），它被发现，10毫克L-1是在体细胞胚胎开始在4周内褐变的最小浓度，完全死亡在6个星期。然而，所有的培养被确认为保持了2个月。

共同培育和选择

农杆菌株GV3101含有pCAMBIA1305.2载体用于改造。用细菌侵染的密度为1.0（OD600nm），瞬态GUS基因表达频率为86.7％，15个中的13个被测样品呈蓝色。乙酰丁香酮的共培养介质中的存在提高了转化效率早些时候报道（Humara 等人，1999年；Song和Sink 2005年）。2个月后，合作培养外植体的稳定表达研究进行了分析，用117外植体和稳定转化的频率被认为是2.56％。然而，所有这些体细胞生产转化的体细胞胚的胚胎后的GUS组织化学分析（图8）表示蓝

色和使用部分GUS和hptII的引物通过聚合酶链反应分析进一步证实。（图9a，B）。

图8A-I从再生的体细胞胚胎2个月后，在选择培养基（RBANGT与潮霉素的培养基10毫克L-1和头孢噻肟钠250毫克的L-1）的GUS表达。丛（球状阶段）一个次要的体细胞胚再生体细胞胚外植体（杆1毫米）。b鱼雷再生体细胞胚阶段从体细胞胚胎植下选择培养基（杆1毫米）。c从中学的体细胞胚再生启动（杆2毫米）。d二级体细胞胚在再生阶段（杆2毫米）。e单体细胞胚叶开始（杆2.5毫米）。F的单体GUS表达的胚胎侧视图上发起的叶子（杆3毫米）。：g再生（杆4毫米），从体细胞胚。h叶的再生植物转化体细胞胚（杆8毫米）。i非转化体细胞胚（杆5毫米）

从潮霉素的选择培养基获得的体细胞胚胎保持在RBANGT液体培养基与抗生素的浓度降低（5毫克L-1和头孢噻肟钠125毫克的L-1）的体细胞胚的进一步发展。在第三次培养中完全消除了抗生素，维持二次体胚的进一步生产。Southern 杂交分析，基因组DNA，转化分离到基因组酶切证实（图9C）EcoRI和稳定的转基因的整合。在对照组（未转换），无杂交信号检测。以前试图一个红木改造协议，但它只是一个短暂的表达研究涉及作为一个转型标记（帕维亚内托等人，

2003b）的甘露糖。然而，在这项研究中，B。奥雷利亚纳利用农杆菌介导转化取得了体细胞胚。

总之，我们为B奥雷利亚纳已经制定了一个有效的方法，直接和介导的愈伤组织体细胞胚胎。在液体培养基中，特别是在愈伤组织介导的体细胞胚胎发生是最好的部分协议，可以实现体细胞胚的大力生产，。此外，为第一次，一个非常能干的体细胞胚的农杆菌介导的稳定转化为标准化的，具有广泛的应用在通过基因工程提高红木色素。

致谢

作者对印度政府的科学与技术部门的研究资助表示非常的感谢。同时，对印度新德里科学与工业研究会的研究资金非常的感谢。

植物组培培养基的成分

植物组培培养基的成分 培养基是人工配制的，满足不同材料生长，繁殖或积累代谢产物的营养物质。在离体培养条件下，不同种类植物对营养的要求不同，甚至同一种植物不同部位的组织以及不同培养阶段对营养要求也不相同。筛选合适的培养基是植物组织培养极其重要的内容，是决定成败的关键因素之一。 大多数植物组织培养基的主要成分是无机营养物质（大量营养元素和微量营养元素）、碳源、有机添加物、植物生长调节剂和凝胶剂。一些组织可以生长在简单的培养基上，这些培养基只含无机盐和可利用的碳源（蔗糖），但大多数组织必须在培养基中添加维生素、氨基酸和生长物质，而且经常还将一些复合的营养物质加入到培养基中，这种由“化学定义”的化合物组成的培养基称为“合成”培养基。 人们已设计了许多培养基用于特殊组织和器官的培养。 怀特培养基是最早的植物组织培养基之一，最初作为根培养的培养基。为了诱导培养组织器官发生和再生植株，广泛使用含有大量无机盐成分的MS（Murashige和Skoog，1962）和LS(Linsmaier 和Skoog，1965)培养基。原本为细胞悬液或愈伤组织培养而设计的B5培养基，经过改良后，被证实有利于原生质体培养。同时，B5培养基也被用于诱导原生质体再生植株。尽管Nitshch(1969)为花药培养设计的培养基仍然使用频繁，但另一个称为N6的培养基，专门用于禾谷类花药培养和其他组织培养。类似的，N6培养基越来越多地

用于大豆、红三叶草和其他豆科植物的培养。该培养基营养成分促进胚性细胞和原生质体再生细胞快速生长。使用这些培养基成功的原因很可能是营养元素的比例和浓度基本上满足不同培养体系中细胞或组织生长和分化的最适需要。 植物组织培养基中无机和有机成分的浓度用质量浓度（mg/L 或ppm，但现在习惯用mg/L）或物质的量浓度(mol/L)表示。按照国际植物生理学协会的推荐，应该用mol/L表示大量营养元素和有机营养成分浓度，用μmol/L表示微量营养元素、激素、维生素和有机成分浓度。用物质的量浓度的优点是，每一种化合物每一摩尔的分子数是常数，所以按照特定培养基配方配制培养基时，无论无机盐化合物的水分子数为多少，原物质的量浓度都可以使用。但是，用质量浓度来表示浓度的话，就不能不考虑无机盐化合物的水分子数目了。 1、水分 水分是植物体的主要组成部分，也是一切代谢过程的介质和溶媒，在植物生命活动过程中不可缺少。配制培养基母液时要用蒸馏水或纯水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程中发霉变质。研究培养基配方时尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。而在大规模工厂化生产时，为了降低生产成本，常用自来水代替蒸馏水。如自来水中含有大量的钙、镁、氯和其他离子，最好将自来水煮沸，经过冷却沉淀后再使用。

论植物组织培养学习心得

论植物组织培养学习心得 摘要：经过大三一个学期，我有幸选修了一门有关丁植物组织培养的课程，作为一个人文院法学学生，我对丁理科，尤其是农学方面了解甚浅。我怀着无比激动和忐忑的心情上了这门课，毕竟对我来说这就像是开启了一个新世界的大门，所有一些知识都对我来说是新鲜的。经过一个学期的学习，我也掌握了一些植物组织培养方面的知识，虽然说并不是太多，但是我觉得这都对我以后的发展和开阔视野都提供了很大的帮助。 关键词：植物培养；植物组织与法学的关系；对自己的帮助 一、植物组织培养的学习内容 1、组织培养 植物组织培养，主要的原因有两个，第一个是为了基因转化做基础，还有一点是为了开发药用植物。 植物组织培养概念乂叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。植物组织培养概念（狭义） 指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。 它的作用大致分为三点：①组织培养是研究植物生长和分化规律的重要手段组织培养是在人工控制条件下培养外植体再生器官或植株的技术，可以在不受植株体其它部分干拢下研究被培养部分生长和分化的规律，并可以利用各种培养条件影响它们的发育进程。②组织培养是开展生物工程的基本技术各种基因转移和基因重组技术是组织培养基础上建应的。③组织培养可快速繁殖植物种苗目前组织培养在无性系的快速繁殖、无病蠹种苗培育、新品种的选育、人工种子和种

质保存、药用植物和次生物质的工业化生产等方面的应用已十分广泛。 2,马铃薯的脱蠹 脱蠹种薯是指马铃薯种薯经过一系列技术措施活除薯块体内的病蠹后, 获得 的无病蠹或极少有病蠹侵染的种薯，它具有早熟、产量高、品质好等优点。马铃薯 的产量和质量与种薯密切相关。种薯不行，产量和质量就会大打折扣，病蠹一旦侵 入马铃薯植株和块茎，就会引起马铃薯严重退化，并产生各种病症，导致马铃薯产 量大幅下降。因此，要经过一系列物理、化学、生物等技术活除薯块体内病蠹的种薯。这项技术我国早在6年前就在马铃薯主产区推行，通过这项技术可以实现大田 平■均增产30吩50% 那么到底是怎么脱蠹的呢？首先，应该做的是取材与消蠹。将欲脱蠹的品种块茎催芽，芽长4?5cm时，剪芽并剥去外叶，自来水下冲洗40min, 丁无菌室内用漂白粉溶液消蠹后，无菌水冲洗2?3次。其次第二个就是应该剥离和接种：在无菌室内，丁40倍的解剖镜下,剥取带1个叶原基的茎尖，接种丁M*尖培养基的试管中。试管中的M弘尖培养基包括大量元素、微量元素、有机成分和生长素、细胞分裂素、蔗糖和琼脂,pH值为5.8,经高压灭菌后使用，每试管接种1个茎尖。再次是有一个合适的培养条件，接种的茎尖培养丁25C、1500?3000lx光照条件下培养室内，3个月则长成3?4片叶的小植株。在无菌条件下，进行切段扩繁1 次，取部分苗进行病蠹检测。最后是病蠹检测，病蠹检测是茎尖脱蠹不可缺少的步骤，常用鉴别寄主即指示植物或血活学方法进行检测。经多次检测，及时淘汰血活学阳性反应或在指示植物上有症状的茎尖苗，无任何反应的茎尖苗即脱蠹苗用作繁殖。 3,植物组织培养应用在哪几个方面？第一点是植物组织培养是转基因技术不可或缺的技术。在我们现代科技，转基因技术是现代科技必不可缺的一项技术， 它应用丁现代生活的各个领域。尤其在植物组织培养方面很需要转基因技术。第二点，染色体不同倍性的多倍体植物产生。第三点是杂交离体培养可以克服受精前的 障碍，比如说对丁幼胚的培养，体细胞的融合。第四点是对植物进行的脱蠹。对植 物进行一系列的活除措施来使植物能大幅度的提高产量和植物的等级，让植 物长得更加健康。例如马铃薯，草莓，苹果，橘子都可以进行脱蠹。第五点是节约 地面积，并不受季节的限制。在我们学习过植物组织培养之后，我们通过技术的学习，可以对植物的种植面积进行更好的分配，而且也可以种植一些耐寒植物等都可

植物组织培养MS培养基配方

植物组织培养MS培养基配方 （一）母液配制与保存 配制培养基时，如果每次配制都要按着杨成分表依次称量，既费时，又增加了多次称量误差。为了提高配制培养基的工作效率，一般将常用的基本培养基配制成10～200倍，甚至1000倍的浓缩贮备液，即母液。母液贮存于冰箱中，使用时，将它们按一定的比例进行稀释混合，可多次使用，并在配制较多数量的培养基时，降低工作强度，也提高试验的精度。 基本培养基的母液有四种：大量元素（浓缩20倍），微量元素（浓缩100倍），铁盐（浓缩200倍），除蔗糖之外的有机物质（浓缩100倍） 1大量元素 配制大量元素母液时要分别称量，分别溶解，在定容时按表1中的序号依次加入容量瓶中，以防出现沉淀。倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保存。 表1大量元素母液（配1L20倍的母液） 序号成分配方浓度/（mg.L-1）称取量/mg 配1mL培养基吸取 量/mL 1 硝酸铵NH4NO3 1650 33000 50 2 硝酸钾KNO 3 1900 38000 3 磷酸二氢钾KH2PO 4 170 3400 4 七水合硫酸镁MgSO4.7H2O 370 7400 5 氯化钙无水CaCl2 440 6644 2微量元素母液 在配制微量元素母液时，也应分别称量和分别溶解，定溶时不分先后次序，可随意加入溶量瓶中定容（表2），一般不会出现沉淀现象。倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保有存。 表2微量元素母液(配制1L100倍母液) 成分配方浓度/(mg.L-1) 称取量/mg 配制1L培养基吸取 量/mL 碘化钾KI 0．83 83 10 硫酸锰MnSO4.H2O 22．3 2230 硼酸H3BO3 6．2 620 硫酸锌ZnSO4.7H2O 8．6 860 钼酸钠Na2MoO4.2H2O 0．25 25 硫酸铜CuSO4.5H2O 0．025 2．5 氯化钴CoCl2.6H2O 0．025 2．5 3铁盐母液 由于铁盐无机化合物不易被植物吸收利用，只有基螯合物才能被植物吸收利用，因此需要单独配成螯合物母液表3）。 配制方法：称取5.56g硫酸亚铁和7.46g乙二胺乙酸二钠，分别用450ml的去离子水溶解，分别适当加热不停搅拌，分别溶解后将硫酸亚铁溶液缓缓加入到乙二胺四乙酸二钠溶液中，将两种溶液混合在一起，最后用去离子水定溶于1000mL，倒入棕色贮液瓶中，贴好标签和做好记录后放入冰箱内保存。

植物组织培养的培养条件

植物组织培养的培养条件 在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、PH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。 一、温度(temperature) 因为温度是植物组织培养中的重要因素，所以植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能表现良好，大多数植物组织培养都是在23～27℃之间进行，一般采用 25±2℃。低于15℃时培养，植物组织会表现生长停止，高于35℃时对植物生长不利。但是，不同植物培养的适温不同。白鹤非的最适温度是20℃、月季是25～27℃、番茄是28℃。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28℃为最好，在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。 不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30℃以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率比在25%以下的高。桃胚在2～5℃条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3～5d，可得到无病毒苗。 二、光照(light) 组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光照时间方面： 1、光照强度(light intensity) 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。 2、光质(light wave) 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。 3、光周期(light period) 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而

植物组织培养的培养基

植物组织培养的培养基中，需要添加糖类作为碳源物质，因此糖类是影响植物组织培养成功与否的关键之一。高中生物教材中明确指出，植物组织培养的培养基中添加的糖类是蔗糖。那么为什么不添加葡萄糖呢？很多资料上解释为蔗糖较葡萄糖便宜，易被植物细胞吸收。其实并非如此。之所以以蔗糖作为碳源，主要有三个方面的原因： （1）同样作为碳源为植物细胞提供能量来源，蔗糖较葡萄糖能更好地调节培养基内的渗透压。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显低于葡萄糖，因此若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可相对长期的保持稳定。 （2）植物组织培养过程中，要时刻注意防止培养基受到微生物的污染。微生物生长所需的碳源最常用的是葡萄糖，一般很少利用蔗糖。因此，采用蔗糖作为培养基的碳源，可一定程度上减少微生物的污染。 （3）诱导作用。在培养基成分中，增加生长素的浓度，导致木质部形成，增加蔗糖浓度则导致韧皮部形成。当生长素水平恒定时，2％蔗糖使分化出的全部是木质部，4％蔗糖使分化出的几乎全部是韧皮部，3％蔗糖则可以分化出两者。所以，生长素和蔗糖浓度决定愈伤组织中维管束的类型与数量。因此，在植物组培中要选用蔗糖而不选用葡萄糖。 通过细胞膜内外的液体的浓度差来调节 当细胞膜内的浓度小于细胞膜外的时候蔗糖救能进入细胞中了 植物细胞培养中最常用的培养基的碳源是蔗糖，已知葡萄糖和果糖也能使某些植物生长得很好。植物细胞可以分解蔗糖，蔗糖是由一分子果糖和一分子葡萄糖组成的，蔗糖是可以直接进入细胞的，蔗糖跨质膜从质外体进入细胞是由载体介导并需要消耗能量的质子-蔗糖共运输机制进行的，另外，植物能够利用的某些其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖等。葡萄糖更不稳定，培养基需添加葡萄糖一般都在灭菌后再兑换。实在要添加葡萄糖那么灭菌温度一般控制在108~110左右，120度灭出来的就有一定程度的碳化了。所以用蔗糖更简单 动物细胞只能吸收葡萄糖，二糖蔗糖是无法吸收的。 以蔗糖为植物培养基碳源有两个原因: 1.抑制杂菌生长.细菌等不能直接以蔗糖为碳源,故可起抑制其生长的作用 2.蔗糖被植物细胞利用机理目还无定论.主要有以下两个学说(1)植物细胞先以次级主动运输的方式在细胞内外形成质子梯度,然后蔗糖就会利用这个梯度被吸收进细胞. (2).植物的细胞壁中含有能分解蔗糖的相关酶,蔗糖先在细胞膜外被分解为单糖,然后这些单糖再以主动运输的方式进入细胞,从而被细胞利用.

兰花组织培养技术

兰花组织培养技术 摘要：在适宜的条件下，将兰花植株的外植体在无菌环境中应用人工培养基，通过外植体的采集与处理、培养基的制作、外植体的接种、继代增殖以及驯化移栽等操作技术，可在短期内获得大量幼小的无病毒植株，从而达到增殖扩繁的目的。组织培养技术是经济有效快速繁殖优良品种的方法，也是产生脱毒苗的重要途径。 关键词：组织培养兰花外植体试管苗 花属兰科多年生草本植物，中国兰花为兰科属中的地生兰。其香味怡人，花色淡雅，品种丰富，素有“花中君子”之称。具有很强的观赏价值和经济价值，深受人们的喜爱。此外，其也是目前世界上栽培较广的切花材料之一，兰花的切花生产，需要大批量的种苗，要获得优质高产，兰花种苗必须具备种性一致，生长齐一，长势旺盛的特点。在种苗生产上运用最广泛的是组培快繁和分株。生产实践证明，运用组织培养快繁技术生产种苗，其长势旺盛，品种复壮，抗病性强，切花质量好，对加快优良品种的培育，挽救珍惜濒危种类等起到十分重要的作用。 兰花在植物分类学上属于单子叶植物中的一个科，为多年生草本植物，附生、地生或腐生。兰花根呈圆柱状，属肉质组织，茎很短，高度约为2～3cm，兰叶大多叶边全缘，有的略有锯齿。其花属于不整齐花范畴，总状花序。兰属植物的果实为蒴果，呈三角或六角形，俗称“兰荪“。 一、无菌培养物的建立 （一）培养容器的洗涤及培养基的制作 1.培养容器的洗涤 容器的洗涤是否干净直接影响组织培养的成败，为保证培养材料在瓶内生长健壮，在培养前期一定要对容器进行彻底的洗涤与灭菌。以达到“瓶壁锃亮、水膜均匀，不挂水珠”为标准。洗涤时用洗衣粉水洗刷，再用清水冲洗3～4次，干燥后备用。 2.培养基的制作 培养基是植物组织培养的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到外植体的生长于分化。组培快繁中最常用的培养基主要是MS培养基。母液要根据药剂的化学性质分别配置，一般配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素类母液。其配置方法是先进行大量元素的配置，称量时应注意多余的药品不能回放在瓶中，应做其它处理。电子天平在使用时先对其进行调平，然后进行微量元素母液、有机物母液的配制。 当MS母液配好以后，则可进行培养基的制作，继之对琼脂和蔗糖进行称取、溶解，琼脂呈现半透明状时将糖加入容器中溶解，再加入事先吸取好的各类母液混合均匀后转入1L容量瓶中对其进行定容，然后根据培养基的要求对PH进行调整（PH值控制在5.6～5.8测定不得少于3～4次）。进行分装时，一般以培养瓶的1/4～1/3为宜，分装后立即进行灭菌。

植物组织培养教学设计说明

课题1 菊花的组织培养 ★课题目标 （一）知识与技能 1、熟悉植物组织培养的基本过程 2、理解细胞分化的概念及离体植物细胞的脱分化和再分化 3、通过联系农业生产实际，培养学生活学活用，理论联系实际的能力[来源:学|科|网] （二）过程与方法 归纳MS培养基的配制方法，并设计表格比较微生物培养基与MS培养基的配方的异同。 （三）情感、态度与价值观 通过阅读植物组织培养技术的发展史，课下查阅植物组织培养技术在生产实践中应用的资料，关注学生科学态度的教育，拓展学生视野，感受科学技术在生产实践中的重要价值。★课题重点 植物组织培养过程中使用的无菌技术 ★课题难点 植物组织培养过程中使用的无菌技术 ★教学方法 启发式教学 ★教学工具 多媒体课件 ★教学过程 （一）引入新课 上节课我们探讨学习了如何从土壤中分离出尿素分解菌和纤维素分解微生物及其计数方法。这节课我们来学习研究植物的组织培养技术。

（二）进行新课 1．基础知识 知识回顾：联系“植物细胞工程”，回答下列问题： 1．1具有某种生物全套遗传信息的任何一个活细胞，都具有发育成完整个体的能力，即每个生物细胞都具有全能性。但在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在特定的时间和空间条件下，通过基因的选择性表达，构成不同组织和器官。 1．2植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。 活动1：阅读“植物组织培养的基本过程”，讨论并完成以下问题： 1．3细胞分化：个体发育中细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。 〖思考1〗细胞分化是一种持久性的变化，它有什么生理意义？ 使多细胞生物体中细胞结构和功能趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。 1．4愈伤组织是通过细胞分裂形成的，其细胞排列疏松而无规则，高度液泡化呈无定形状态的薄壁细胞。 〖思考2〗填表比较根尖分生组织和愈伤组织的异同： 1．5植物组织培养的过程可简单表示为： 活动2：阅读“影响植物组织培养的条件”，讨论并完成以下问题： 1．6材料：植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开化植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。

百合的组织培养

百合的组织培养 【摘要】将百合鳞片的不同部位接种于加油不同激素和不同浓度BA和NAA 的6种培养基上，一周后接种的百合鳞片开始变绿，2周后，鳞片的受伤部位出现绿色的愈伤组织,，再经2—3周培养，产生愈伤组织的部位逐渐形成小鳞茎，并开始有叶片长出。其中2号培养基MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L的分化率最高。实验结果表明，鳞片的不同部位分化能力也有差异，其中下部分化效果最好；激素6-BA和NAA浓度的配比，与鳞片分化小鳞茎的速度、数量和质量有着重要的关系。 【关键词】百合；鳞茎；组织培养 1.百合的简介 百合是百合科百合属（LiliumL.）各个种、杂交种、园艺品种的总称。它是著名的球根花卉，其地下部分为众多肥厚鳞片组成的鳞茎。百合花花姿优美，花大色艳，历来深受世界各国人民的喜爱，为世界名贵切花之一，广泛用于盆栽、花坛、花境及专类园。从考古文物中发现百合花用作观赏已有三千六百五十多年的历史。此外，多种百合的鳞茎、茎、花、种子均可入药，百合的鳞茎及花营养丰富，可制作多种美味佳肴。芳香的百合可提取芳香油制成香料。全世界百合属植物约一百种，起源于我国的就有四十七种和十八个变种，占世界百合属植物的一半以上。 1.1实验目的和意义 传统的花卉繁殖是靠播种、扦插、分株、压条、嫁接这些措施来实现的，然而在花卉业迅猛发展的今天，传统的育种技术已经无法满足生产需要，因而人们对花卉的繁殖技术提出了更高的要求。在世界各国植物生理工作者的努力下，利用组织培养进行花卉繁殖的技术日趋成熟。目前已有很多花卉可以利用组织培养为花卉提供种苗。今天，我们所享用的花卉产品之所以能够如此之高的品质，与花卉组织培养的应用不无关联。 百合植物资源丰富，栽培历史悠久，花色多样，它不仅适用于庭院栽培，布置花境，也可盆栽观赏，并早已成为花卉研究领域的佼佼者。百合虽然观赏性很高，但大多抗性很弱，尤其抗寒性。一般在东北地区种植商品百合时，每年秋季必须起球，窖藏或者冷库存放，这大大增加了百合的生产成本，限制了东北地区花卉业的发展。随着百合在国内外鲜切花市场的走俏，百合花生产和消费逐年增加，但由于百合种球繁殖率底，病毒侵染造成退化，难于满足切花生产需要。目前主要采用组织培养进行百合脱毒和快繁，以促进百合商品种球的生产。但是百合试管苗小鳞茎较小，结鳞茎时间较长，移植成活率低，制约了工厂化商品生产。 目前国内繁殖百合主要通过进口鳞茎进行繁殖。但是市场售价较高，而且有时鳞茎质量难以保证、繁殖率低易造成鳞茎退化。采用组织培养的方法在很短时

实验一 植物组织培养基母液配制的若干关键环节

实验一、植物组织培养基母液配制的若干关键环节目的与要求： 熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法. 植物组织培养（plant tissue culture）是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化形成完整植株的过程.植物组织培养具有取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制等特点.因而被广泛应用于各种植物的快速繁殖之中. 为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。现将培养液中各类物质制备母液的方法说明如下。 以MS培养基为例，其母液的配制包括大量元素、微量元素、铁盐、维生素、氨基酸、植物生长调节物质和有机附加物等种类.(见表1) 表1 MS培养基母液的配制 成分规定用量 /mg.L-1 扩大倍 数 称取量/ mg 母液定溶 体积/ml 配1LMS培 养基吸取量 /ml 大量元素 KNO3 NH4NO3 MgSO4·7H2O KH2PO4 CaCl2·2H2O 微量元数 MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O 1900 1650 370 170 440 22.3 8.6 20 20 20 20 20 1000 1000 38000 33000 7400 3400 8800 22300 8600 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 50 50 50 50 50 1 1

植物组织培养实验室(组培室)规划设计

植物组织培养实验室 (组培室规划设计 2009年 05月 31日星期日 10:18一、实验室要求 理想的组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染源的地方, 最好在常年主风向的上风方向, 尽量减少污染。规模化生产的组织培养实验室最好建在交通方便的地方, 便于培养产品的运送。 实验室的建设均需考虑两个方面的问题:一是所从事的实验的性质, 即是生产性的还是研究性的, 是基本层次的还是较高层次的; 二是实验室的规模, 规模主要取决于经费和实验性质。 无论实验室的性质和规模如何,实验室设置的基本原则是:科学、高效、经济和实用。一个组织培养实验室必须满足 3个基本的需要:实验准备 (培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌、无菌操作和控制培养。此外,还可根据从事的实验要求来考虑辅助实验室及其各种附加设施,使实验室更加完善。 在进行植物组织培养工作之前,首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解, 以便因地制宜地利用现有房屋, 或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的,实验室规模太小,则会限制生产,影响效率。在设计组织培养实验室时, 应按组织培养程序来没计, 避免某些环节倒排, 引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件, 需要一定的设备、器材和用具, 同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。 二、实验室组成 (一基本实验室 基本实验室包括准备室、洗涤灭菌室、无菌操作室、培养室、缓冲间,是组织培养实验所必须具备的基本条件。如进行工厂化生产,年产 4万 -20万, 需 3-4间实验用房,总面积 60平方米。

植物组织培养步骤

植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。植物组织培养概念（狭义）指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。 组织培养的步骤 一、培养基配制 配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。 自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。 1、配制几种母液 （1）配制MS大量元素母液 一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。 分别称取 NH4NO3 165g KH2PO4 17g KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g MgSO4·7H2O 37g 各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 （2）配制MS微量元素母液 一般将微量元素配制成100倍母液。 依次称取 KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g ZnSO4·7H2O 0.86g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。 分别称取 CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g 各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。 （3）配制MS有机母液

植物组织培养的相关研究

植物组织培养 作者 摘要 关键字 植物组织培养既是一种基础性研究，又是一种极具普及意义的生物技术。它具有 耗费母株材料少，繁殖速度快，繁殖率较高，用嫩茎组织培养法可以得到无病毒植株， 减轻病毒对花卉的影响，以及定向培养植物优良品种等方面的优势。植物组织培养的 基础是植物细胞的全能性理论，它从诞生到现在经历了4个时期，即理论准备和实验 开创期;研究发展时期;生产应用时期;“克隆”生物时期(肖杰，2004)。如今植 物组织培养技术已经成为农林业中极具普及意义的生物技术之一，而芍药组织培养目 前处于理论准备和实验开创期。但是对芍药进行组织培养，应用植物激素控制分化过 程及分化数量可达到繁殖目的，并节省人力物力，是芍药批量生产的最佳方法(胡映 泉，2003)。 近年来中外学者对芍药的组织培养进行了大量的研究工作，主要集中在以种子为 外植体的组织培养方面(BrukhinvB，一994;KimYS，1995年;BuchheimJAT，1994)，也利用花药(LeeB，1992)培养诱导形成单倍体植株或胚状体。众所周知，常规方法育种周期长、见效慢，极大地限制了新品种的研制与开发。 而利用植物组织培养中的花粉、花药进行单倍体育种结合温室育苗技术，可以大大缩 短育种年限，实现早期选择、提高选择效率。利用体细胞来培育新品种已成为当今育 种领域的趋势之一，对于无法结实的多倍体花卉来说，采用组织培养技术则能为其提 供一条具体的繁殖途径。对于那些产生芽变的种类来说，由于变异部位太小，难以进 行传统的扦插或嫁接繁殖，无法使这些新出现的宝贵种质保留下来;如果将发生变异 的细胞进行分离，并培养成苗则可以选育出许多新的品种，这无疑为花卉新品种的培 育提供了广阔的空间。 影响外植体污染的因素较多，除要求操作人员严格按照无菌操作程序操作外，还 与外植体的种类、取材季节、预处理方法、消毒方法、杀菌剂的使用等因素有关。在 植物组织培养中，造成污染的病原主要是霉菌、细菌和酵母菌三大类，霉菌和酵母菌 引起的污染很容易观察到，初代培养就能在外植体周围或培养基表面形成明显的菌 落，而细菌污染则存在一定的潜伏期。如果外植体培养3一5d内未表现污染症状，而 以后不断出现污染现象，表明污染主要由内生菌引起(Leifert，1990;柴向华，周俊 辉，2003)。抗生素抑菌在动物细胞培养中早己被广泛应用，在植物组织培养中尚处于开始阶 段。近年随着植物基因工程的开展，转基因过程中的除菌和抑菌越来越离不开抗菌素 所以使用抗菌素逐渐成为植物组织培养中的灭菌技术之一。在抗菌素的使用上， Falkiner(1990年)提出3个条件，即必须弄清楚要抑制菌的种类，使用的抗生素是否 对培养的植物组织有不良影响，还要确立抗生素的使用浓度、处理时间的长短。因 没有一种抗生素能对所有引起污染的微生物都有效，所以抗生素也不能完全代替灭菌 技术，最好加在培养基中，作为一种辅助防止污染的措施。 植物组织培养中外植体种类的选择以污染少、易启动为原则。带芽的外植体，如 茎尖、侧芽、带芽茎段，培养成功率高，变异率小，容易保持材料的优良特性。其中， 顶芽芽体饱满，营养丰富，侧芽较瘦弱，所以顶芽启动快，分化率高;继代培养中由 于顶端优势的作用，腋芽的生长受到抑制，生长势弱于带芽茎段。因此，用顶芽作为 外植体时，培养基中常加入细胞分裂素打破顶端优势作用，促进腋芽大量萌发，提高 繁殖系数(裘文达，1986)。据分析，外植体取材的季节以材料积累了较丰富的营养

植物组织培养技术

楚雄师范学院化学与生命科学系 生物技术专业《植物组织培养技术》课程教学大纲 一、课程基本信息 课程代码：031106014 课程中文名称：植物组织培养技术 课程英文名称：Plant Tissue Culture Technology 课程性质：专业选修课 使用专业：生物技术专业、葡萄与葡萄酒工程专业 开课学期：第7学期 总学时：36+27 总学分：3 预修课程：植物学、植物生理学 课程简介 植物组织培养技术是将植物的离体材料(器官、组织、细胞、原生质体等)无菌培养，使其生长、分化，进而再生完整植株的无性繁殖技术，是实践性较强的专业课之一。本课程在介绍了组织培养的含义、特点及其意义；组织培养的概念、类型、特点；组织培养技术的基本原理及操作规范；组织培养的发展简史、发展趋势及其应用。通过本课程的学习，使学生掌握组培实验室、家庭组培室、组培育苗工厂的组成、设计原则与设计要求；熟练掌握各种培养基的特点与应用；熟练掌握茎尖、茎段、叶及花器官培养消毒灭菌、接种及培养的技术；理解种质资源离体保存的意义，掌握种质资源离体保存常用方法；掌握一些常见植物的组培脱毒与快繁技术的应用。 教材建议 《植物组织培养原理与技术》，李胜、李唯主编，化学工业出版社，2008年。 参考书 《植物细胞组织培养》，刘庆昌编著，北京：中国农业大学出版社，2002年，标准书号：7-81066-529-4。 《植物组织培养(第三版)》，潘瑞炽编著，广州：广东高等教育出版社，2003年，标准书号：7-5361-2501-1。 《植物组织培养教程》，李浚明编著，北京：中国农业大学出版社，1996年，标准书号：7-81066-466-2。

植物组培培养基及其配制

植物组培培养基及其配制 培养基好比土壤，是组织培养中离体材料赖以生存和发展的基地。因此，在组织培养基的各个环节中，应着重掌握培养基，了解它的组成和配制方法。 一、组成培养基的五类成分 目前，大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。 1.无机营养物 无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。而钙、钠、镁的需要则较少。培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与Na2—EDTA(螯合剂)的混合。

2.碳源 培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。培养基中的碳水化合物通常是蔗糖。蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起重要作用。 3.维生素 在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基中的维生素属于B族维生素，其中效果最佳的有维生素B1、维生素B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。 4.有机附加物 包括人工合成或天然的有机附加物。最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸等。另外，琼脂也是最常用的有机附加物，它主要是作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。 5.生长调节物质 常用的生长调节物质大致包括以下三类： (1)植物生长素类。如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。 (2)细胞分裂素。如玉米素(Zt)、6-苄基嘌呤(6-BA或BAP)和激动素(Kt)。

白芨组织培养实施方案

白及组织培养实施方案一、白及简介 白及为兰科白及属多年生草本植物，又名甘根、连及草、地螺丝、羊角七、皲口药、利知子、刀口药、鱼眼兰等。分布在中国、日本以及缅甸北部，主产于贵州、四川、湖南、湖北、安徽、河南、浙江、陕西等地。其味苦、甘、涩,性凉,归肺、胃、肝经。以块茎供药用，能收敛止血，消肿生肌；治肺结核咳血，支气管扩张咯血、胃溃疡吐血、尿血、便血等症。外用治外伤出血、烧烫伤、手足皲裂等症。块茎含黏液质和淀粉等，可作糊料，在生物医药、保健食品、纺织印染、特种涂料和日用化工等方面有巨大的商业利用价值。又因白及为地生兰的一种，花开艳丽，被作为庭院、居室及园林景观绿化苗木大量应用。 白及一般生于海拔110——3200m的山野、山谷较潮湿处或林下半遮阴地带，喜温暖、稍阴湿的环境，耐阴性强，忌强光直射，需排水良好、富含腐殖质的砂质土壤，稍耐寒，冬季可在地下越冬。白及能产生大量的种子(每个蒴果10～30万粒)，但这些种子没有胚乳，自然萌发率极低，繁殖困难，但白及胚的薄壁细胞贮存大量的蛋白质、油脂和碳水化合物，可作为种子萌发的营养成分，因此白及种子在保湿的情况下可以萌发，是兰科植物中种子易萌发的类型。传统的白及繁殖方法大多以分株为主，即将块茎分成小块种植，但繁殖系数低，大面积发展对种源消耗大，不宜推广且难以满足市场需求。 采用白及组织培养可在短时间内大量获取种苗，且成本相对较低，是提高白及产量的强有力措施。目前，国内研究资料报道的白及组织培养方法各异，所采用的外植体各不相同，且培养基及其中所加的植物生长调节剂种类和规格也千差万别。 二、白及组织培养技术路线 参照植物组织组织培养获得再生植株的方式，可通过4种途径获得白及再生植株：一是由愈伤组织形成不定芽再生植株；二是愈伤组织产生胚状体而再生植株；三是由侧芽或顶芽再生植株；四是由茎尖产生原球茎而再生植株。4种方式各有利弊，传统认为采用侧芽或顶芽发育途径获得的后代性状较稳定，但因为白及原球茎带有大量共生菌，组培过程中容易出现污染。

植物组织培养的培养基配制

植物组织培养的培养基配制、分装与灭菌 一、实验目的 1.配制培养基母液是植物组织培养的基本技术。掌握植物组织培养基母液的配制方法和分装原则与方法。 2.掌握大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物质、植物激素的配制和灭菌方法。 二、仪器设备及试剂 电磁炉天平(0.0001 g) 高压灭菌锅、量筒: 10ml、20ml、100ml、500 ml烧杯: 1000ml、500 ml、250 ml 、移液管: 1ml、2ml、5 ml 吸管若干、记号笔、三角瓶或试管、试管架锡铂纸、玻璃棒配制好的各种母液，如大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物、生长调节剂等，个别生长调节剂要随配随用。蒸馏水、pH试纸蔗糖、琼脂等 1 molL NaOH溶液、1 mol/L HC1溶液。 三、方法和步骤 1.量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配1升培养基,先量取约700 m1体积的水。 2.根据培养基配方，用量筒量取所需要的各种元素的母液。 物质加入体积或重量大量元素母液(10x)100ml 、微量元素母液( 100)1 ml有机物质母液(200x)5ml 、铁盐母液(200x)5 ml、肌醇(200x)5 ml、蔗糖30g、琼脂7g

吸取母液时,注意应先将几种母液按顺序排好,不要弄错以免使培养基中药品成分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素，如培养康乃馨侧芽或茎段时加入1ml的1mg/ml 的6 BA;而胡萝卜愈伤组织培养中应加入2ml的1mg/ml 的24-D。加入一种母液后应先搅拌均匀,避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀,琼脂可在加入蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌,以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。 3.调节培养基的pH值，用pH计或pH试纸测定 培养基的pH按照培养材料的要求分别用1moILNaOH溶液、1molL HC1溶液来调节所配制培养基的pH值，- -般培养基的pH值约为5.8,培养的材料不同，对培养基的pH值要求也不同 4.分装 加热至沸腾片刻,以使琼脂充分溶解,检查时可注意烧杯内溶液是否透明。将配制并加热好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶,用封口膜封口，注明标签,然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌。 5.培养基的灭菌 一般用医用高压锅来灭菌(方法略)，本实验采用全自动高压灭菌锅。 5.培养基的保存 毒过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，一般应在消毒后的两周内用完,最好不要超过一个月。 四、注意事项

M519 植物组织培养基

MS培养基 MS培养基是目前普遍使用的培养基。它有较高的无机盐浓度，对保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。 MS固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养，它的液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显成功。这种培养基中的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，无须再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。与其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的**盐、钾和铵的含量高，这是它的明显特点。 Phytotech是美国著名的植物培养基供应商，公司集研发、生产、销售为一体，产品主要覆盖植物组织培养、植物生物技术与植物科学等领域。特色产品有优质基础培养基、植物凝胶、琼脂粉、植物生长调节因子、抗生素等，其生产的植物培养基如MS培养基、N6及B5植物培养基具有极高的性价比。 M519这款产品可以配置50升培养基. 品牌phytotech 产地美国 每升培养基需要4.43克M519再加7—10克糖溶于一升水即可. 目标客户:农科院,清华大学人环楼做植物的,遗传所,北林等 MS是人名Murashige and Skoog的缩写。 MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。基于此，这种培养基就用他们的名字来命名了。 MS培养基是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。和其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。

植物组织培养基配制

培养基的配制 植物组织培养中常用的一种培养基是MS培养基。MS培养基的配制包括以下步骤。 培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。 大量元素(母液Ⅰ) mg／L NH4NO3 33 000 KNO3 38 000 CaCl2·2H2O 8 800 MgSO4·7H2O 7 400 KH2PO4 3 400 微量元素(母液Ⅱ) KI 166 H3BO3 1 240 MnSO4·4H2O 4 460 ZnSO4·7H2O 1 720 Na2MoO4·2H2O 50 CuSO4·5H2O 5 CoCl2·6H2O 5 铁盐(母液Ⅲ) FeSO4·7H2O 5 560 Na2-EDTA·2H2O 7 460 有机成分(母液Ⅳ) ⅣA 肌醇20 000

ⅣB 烟酸100 盐酸吡哆醇(维生素B6) 100 盐酸硫胺素(维生素B1) 100 甘氨酸400 以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。 上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。 母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O 分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。 各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。 MS培养基中还需要加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6 苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0.1 mg/mL)。其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液。 配制培养液用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。再取2，4-D 5 mL、NAA 1 mL，与各种母液一起放入烧杯中。 配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。 溶化琼脂用粗天平分别称取琼脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL 的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻