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活性蛋白A在免疫炎症反应中的应用

活性蛋白A在免疫炎症反应中的应用
活性蛋白A在免疫炎症反应中的应用

自身免疫性疾病概述

自身免疫性疾病 Autoimmunity Diseases 一概述 (一)自身免疫性疾病的概念: 自身免疫性疾病——是免疫系统对宿主自身抗原发生正性应答、造成其组织或器官的病理性损伤、影响其生理功能、并最终导致各种临床症状的状态。(二)自身免疫性疾病的基本特征: 1.多数自身免疫病是自发或特发性的,感染、药物等外因可能有一定的影响;2.患者血清中有高水平的γ-球蛋白; 3.患者血液中有高效价的自身抗体或出现与自身抗原反应的致敏淋巴细胞;4.病损部位有变性的免疫球蛋白沉积,呈现以大量淋巴细胞和浆细胞浸润为主的慢性炎症; 5.病程一般较长,发作与缓解交替出现,仅有少数为自限性; 6.女性多于男性,老年多于青少年; 7.有遗传倾向; 8.应用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂有效; 9.常有其它自身免疫病同时存在; 10.可复制出相似的动物疾病模型。 (三)确认自身免疫性疾病的条件: 1.证实自身抗体或自身反应性T细胞的存在; 2.找到自身抗原; 3.用该自身抗原免疫动物能够诱发同样的自身免疫病; 4.通过被动转移实验证实抗体或者T细胞的致病能力。 (四)自身免疫性疾病的分类: 1. 器官特异性自身免疫病:局限某特定器官,器官特异性抗原引起的免疫应答导 致自身免疫病。 2. 非器官特异性自身免疫病:病变见于多种器官及结缔组织;又称结缔组织病或 胶原病。 二、自身免疫性疾病发病的相关因素

(一)自身抗原的出现:1. 隐蔽抗原的释放。2. 自身抗原改变。 3. 分子模拟。 4. 决定基扩展。 (二)免疫系统异常 1. 淋巴细胞多克隆的非特异性活化: (1)内因:淋巴细胞生长控制机制紊乱,如MRL-lpr小鼠为SLE的动物模型,其FAS基因突变,FAS蛋白胞浆区无信号转导作用,不能诱导T细胞调亡。 (2)外因:各种淋巴细胞的活化物质,如IL-2等细胞因子的应用及LPS和超抗原的作用。 2.辅助刺激因子表达异常: APC辅助刺激因子表达异常,刺激自身反应性T细胞,引发自身免疫病。T-B 细胞之间的旁路活化。 原因(1)病毒感染B细胞。 (2)来自细菌或病毒的超抗原。 (3)B细胞表面的MHC-II分子被修饰。 (三)免疫调节网络失调:Th1和Th2细胞功能紊乱:Th1细胞功能亢进促进器官特异性自身免疫病的发展,如 IDDM等。Th2细胞功能亢进促进抗体介导的全身性自身免疫病发展,如SLE等。 (四)病源微生物感染。 三. 自身免疫性疾病免疫损伤机制 1.发病机制主要为:Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型超敏反应。 2.特点:1. 靶分子的多样性;2. 反应细胞的多样性 ; 3. 自身免疫应答包括初次应 答和再次应答。 3. 自身抗体引起的细胞破坏: 抗体与细胞结合激活补体、调理吞噬、介导ADCC破坏 细胞。如自身免疫性溶血性贫血、药物过敏性血细胞减少症。 4. 抗受体抗体与受体结合:刺激或阻断细胞的功能。如Graves 病、重症肌无力。 5. 抗细胞外成分自身抗体与相应的物质结合: 激活补体、调理吞噬作用杀伤破坏自 身细胞。如肺出血肾炎综合征。 6. 自身抗体与自身抗原形成IC沉积局部: 活化补体引起组织、细胞损伤。如系统性 红斑狼疮、类风湿性关节炎。

蛋白质免疫印迹技术的实验研究

万方数据

万方数据

万方数据

蛋白质免疫印迹技术的实验研究 作者:张燕婉, 叶珏, 时那, 孟宪敏, 王来元, ZHANG Yan-wan, YE Jue, SHI Na, MENG Xian-min, WANG Lai-yuan 作者单位:中国医学科学院,阜外心血管病医院中心实验室,北京,100037 刊名: 实验技术与管理 英文刊名:EXPERIMENTAL TECHNOLOGY AND MANAGEMENT 年,卷(期):2008,25(10) 被引用次数:21次 参考文献(9条) 1.郭尧君蛋白质电泳实验技术 2006 2.Nieman T Detection based on solution-phase chemiluminescence systems 1989 3.李晓军,秦浚川,武建国蛋白印迹技术研究进展[期刊论文]-临床检验杂志 2004(3) 4.Towbin H;Staehelin T;Gordon Electrophoretic franker of proreins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets.Procedure and some appHcations 1979(76) 5.Hauri H P;Bucher K Immunoblotting with monodonal antibodities:Importance of the blocking solution 1986(159) 6.高红,王贵新,王维林,张可仞用蛋白印迹技术初步评价肝母细胞瘤血管内皮生长因子表达的意义[期刊论文]-中华小儿外科杂志 2006(2) 7.Towbin H;Gordon J Immunoblotting and dot immunobinding:current status and outlook 1984(72) 8.Tovey ER;Baldo BA Characterisation of allergens by protein blotting 1987(08) 9.沈关心;龚非力抗体技术实验指南 2006 本文读者也读过(1条) 1.段勇.黄韬.袁育林.刘华.李娅.金克炜.DUAN Yong.HUANG Tao.YUAN Yulin.LIU Hua.LI Ya.JIN Kewei蛋白质免疫印迹技术检测肺癌组织上皮钙粘蛋白的表达[期刊论文]-检验医学2009,24(1) 引证文献(7条) 1.秦双立,徐玥蛋白质印迹法在氟中毒研究中的应用[期刊论文]-山东化工 2015(13) 2.马瑛,马明,沈辉,骆新荣,高庆华不孕奶牛宫颈黏液相关ASA免疫印迹分析[期刊论文]-中国奶牛 2013(06) 3.程娜娜,韩榕He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管蛋白的影响[期刊论文]-激光生物学报 2013(04) 4.刘娇,华碧春,黄智锋蛋白表达检测技术在中药肝损伤机制研究中的应用进展[期刊论文]-浙江中医药大学学报2013(04) 5.韩继美胶体金免疫层析法对AFP、CEA和FN的快速检测[学位论文]硕士 2009 6.黄斌芳c-Jun基因启动子区的遗传变异与肺癌易感性的研究[学位论文]硕士 2012 7.程娜娜He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管结合蛋白MAP65-1的影响[学位论文]硕士 2014 引用本文格式:张燕婉.叶珏.时那.孟宪敏.王来元.ZHANG Yan-wan.YE Jue.SHI Na.MENG Xian-min.WANG Lai-yuan 蛋白质免疫印迹技术的实验研究[期刊论文]-实验技术与管理 2008(10)

免疫印迹实验报告——wester blot

Western blot实验报告 摘要:目的:学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法 方法:western blot 结果:见后文 结论:western blot能很好地分离蛋白 关键词:western blot、分离、小鼠组织、蛋白 Western blot test report Abstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot:,sds-page and electric transfer Results: see below Key words: Western blot、separate、mouse tissues、protein 前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting),与DNA的Southern印迹技术相对应,两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜),然后用探针检测特异性组分。不同的是,Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分,所用的探针是抗体,它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点,具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测,以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前,Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。 免疫印迹可分成两个步骤:蛋白质由凝胶转移至固相基质;特异性抗体检测。 蛋白质转移通常由电泳实现,现常用的方法有二:1 半干法:将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间,通电10-30分钟可完成转移;2 湿法:将凝胶和固相基质夹在滤纸中间,浸在转移装置的缓冲液中,通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。 1 试剂与仪器 1.1 试剂(所有试剂均供两组用) 1.1.1 8%电泳分离胶的配制 H2O 6.9ml

免疫球蛋白

免疫球蛋白 基本概念 免疫球蛋白(Ig)/抗体(Ab)属于同一概念,前者强调其化学结构为球蛋白,后者更强调其免疫学功能为B细胞接受特异抗原刺激后所产生的可特异结合抗原的糖蛋白,系介导体液免疫的重要效应分子 多克隆抗体天然抗原性物质因含有多个不同抗原表位其免疫动物后可同时激活多个抗原特异性B 细胞,产生多种不同抗原特异性抗体 单克隆抗体通过单个B细胞克隆分离鉴定和用生化技术,当前通过杂交瘤技术可产生仅针对单个B 细胞表位的mAb 免疫球蛋白的结构 根据Ig重链恒定区肽链抗原特异性不同,分为五类IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。可变区:是抗体与抗原结合的部位。 结构含义意义 基本结构Ig单体由两条相同的重链(H链)和两条相 同的轻链(L链)通过链间二硫键连接而成 Ig单体是免疫球蛋白分子 的基本单位 恒定区指轻链和重链中靠近C端氨基酸序列相对恒 定的区域 C区分别占轻链的1/2和 重链的3/4

可变区 重链近氨基端1/4区域、轻 链近氨 基 端 1/2区域内的氨基酸序列多变 决定着抗体的特异性 轻链(L 链) 由214个氨基酸残基组成。轻链有两种,分别为κ链 和λ链。据此将Ig 分为两型,即κ型和λ型 Ig 分型的依据 重链(H 链) 由450~550个氨基酸残基组成。根据重链恒定区氨基酸组成和排列顺序的不同,将Ig 分为5类(5个同种型),即 IgM 、IgD 、IgG 、IgA 和 IgE 重链恒定区的不同,决定Ig 的抗原性不同,是Ig 分类的依据 铰链区 位于CH1和CH2之间,富含脯氨酸,易伸展弯曲,能改变两个结合抗原的Y 形臂之间的距离 有利于两臂同时结合两个 抗原表位、铰链区易被木 瓜蛋白酶、胃蛋白酶水解 免疫球蛋白的类型(Ig 的类和亚类、型和亚型) 少考,略。 免疫球蛋白的功能 少考,略。 各类免疫球蛋白的特性和功能★ 特点 功能 IgG 血清含量最高唯一能通过胎盘 再次免疫应答的主要抗体(打疫苗)调理 作用、ADCC 效应 IgM 个体发育过程中最早产生的抗体;类风湿因子和天然血型抗体为IgM 初次体液免疫应答最早产生的抗体,近期感染指标 IgA 分泌液中主要抗体 SIgA 在黏膜局部抗感染中作用重要 IgD 分为血清IgD 和膜结合型IgD 膜结合型IgD (mIgD )是B 细胞成熟标志 IgE 血清中含量最低的Ig IgE 为亲细胞抗体,可与肥大细胞、嗜碱性 粒细胞Fc 受体结合,介导Ⅰ型超敏反应 小结: ①IgG 生后3个月开始合成,3~5岁达成人水平(考试指南);8~10岁达成人水平(儿科学)。 ②早期抗感染主要是IgM ,晚期抗感染主要是IgG 。 ③IgG 能通过胎盘,在新生儿抗感染免疫中起重要作用。 ④IgA 能通过乳汁获得,在婴儿抗感染免疫中起重要作用。 抗体的应用 白喉与破伤风毒素免疫牛制备的抗血清显著治疗白喉与破伤风患儿。

免疫和炎症相关信号通路-精选.pdf

免疫与炎症相关信号通路 一、Jak/Stat Signaling:IL-6 Receptor Family Jak和Stat是许多调节细胞生长、分化、存活和病原体抵抗信号通路中的关 键部分。就有这样一个通路涉及到IL-6(gp130)受体家族,它帮助调节B 细胞的分化,浆细胞生成和急性期反应。细胞因子结合引起受体的二聚化同 时激活受体结合的Jak蛋白,活化的Jak蛋白对受体和自身进行磷酸化。这些磷酸化的位点成为带有SH2结构的Stat蛋白和接头蛋白的结合位臵,接头蛋白将受体和MAP激酶,PI3激酶/Akt还有其他的通路联系在一起。受体结合的Stat蛋白被Jak磷酸化后形成二聚体,转移进入细胞核调节目的基因的 表达。细胞因子信号传导抑制分子(SOCS)家族的成员通过同源或异源的 反馈减弱受体传递的信号。Jak或Stat参与其他受体蛋白的信号传导,在下 面Jak/Stat使用表格中有这方面的列举。研究人员已经发现Stat3和Stat5在一些实体肿瘤中被酪氨酸激酶而不是Jaks组成性激活。 JAK/STAT途径介导细胞因子的效应,如促红细胞生成素,血小板生成素, G-CSF,这些细胞因子分别是用于治疗贫血,血小板减少症和中性粒细胞减 少症的蛋白质类药物。该途径也通过干扰素介导信号通路,干扰素可以用来 作为抗病毒和抗增殖剂。研究人员发现,失调的细胞因子信号有助于癌症的 发生。异常的IL-6的信号或导致自身免疫性疾病,炎症,癌症,如前列腺癌 和多发性骨髓瘤的发生。Jak抑制剂目前正在多发性骨髓瘤模型中进行测试。Stat3具有潜在促癌性(原癌基因),在许多癌症中持续的表达。在一些癌细 胞中,细胞因子信号传导和表皮生长因子受体(EGFR)家族成员之间存在交流。 Jak激活突变是恶性血液病中主要的分子机制。研究人员已经在Jak2假激酶域中发现一个特有的体细胞突变(V617F),这个突变常常发生于真性红细 胞增多症,原发性血小板增多症和骨髓纤维化症患者。这个突变导致Jak2的病理激活,同时激活控制红细胞,巨核细胞和粒细胞增殖分化的促红细胞 生成素(EPO),血小板生成素(TPO)和G-CSF等的受体。而Jak1的功能获得性体细胞突变已发现存在于成人急性淋巴细胞性白血病当中。体细胞激活突变已经证明存在于小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中。此外,

炎症与免疫反应的监测与治疗

炎症与免疫反应的监测与治疗 [单项选择题] 1、全身炎症反应综合征(SIRS)的诊断标准不包括()。 A.体温>38℃或<36℃ B.心率>90次/分 C.C.呼吸频率>20次/分或动脉血二氧化碳分压<32mmHg(1mmHg=0.133kP D.血白细胞计数>12×109/L,或<4×109/L,或未成熟粒细胞>10% E.平均动脉压<60mmHg 参考答案:E [多项选择题] 2、下列炎症介质中在感染早期即可检测到的是()。 A.白介素(IL)-6 B.C-反应蛋白 C.高迁移率蛋白-1 D.可溶性髓样受体 E.降钙素原 参考答案:A,B,D,E [单项选择题] 3、患者女,65岁,因“3天前做饭时不慎被刀切伤皮肤后出现高热,皮肤淤斑”来诊。查体:体温39℃,心率100次/分,血压90/55mmHg (1mmHg=0.133kPa),呼吸32次/分,双肺呼吸音粗,未闻及明显干、湿啰音,双下肢皮肤散在淤点和淤斑。实验室检查:血白细胞15×109/L,血小板46×109/L。该患者符合全身炎症反应综合征(SIRS)诊断标准中的()。 A.3条 B.6条 C.2条 D.4条 E.5条 参考答案:D [多项选择题] 4、患者男,48岁。因“发热、咳嗽5天”来诊。既往史无特殊。查体:体温38.9℃,脉搏96次/分,呼吸36次/分,血压90/50mmHg (1mmHg=0.133kPa),意识清,呼吸急促,双肺呼吸音粗,双下肺可闻及细湿

啰音,心率96次/分,律齐,双下肢轻度水肿。实验室检查:血白细胞 )8×109/L,中性粒细胞0.82,血小板92×109/L。经皮脉搏血氧饱和度(SPO 2 91%。为明确患者是否存在感染及严重程度,需完善的检查包括()。 A.心电图 B.胸部X线片 C.血培养 D.降钙素原 E.血生化(肝功能、肾功能、凝血功能) F.动脉血气分析 参考答案:B,C,D,E,F [多项选择题] 5、患者男,48岁。因“发热、咳嗽5天”来诊。既往史无特殊。查体:体温38.9℃,脉搏96次/分,呼吸36次/分,血压90/50mmHg (1mmHg=0.133kPa),意识清,呼吸急促,双肺呼吸音粗,双下肺可闻及细湿啰音,心率96次/分,律齐,双下肢轻度水肿。实验室检查:血白细胞 8×109/L,中性粒细胞0.82,血小板92×109/L。经皮脉搏血氧饱和度(SPO ) 2 91%。提示患者存在免疫抑制的检查结果是()。 A.降钙素原21ng/ml B.CD4/CD8比值降低 C.CD8降低 D.补体C3降低 E.单核细胞人白血病抗原(mHLA-DR)5000个单克隆抗体/细胞 F.IgA、IgG降低 参考答案:B,D,E,F [多项选择题] 6、患者男,48岁。因“发热、咳嗽5天”来诊。既往史无特殊。查体:体温38.9℃,脉搏96次/分,呼吸36次/分,血压90/50mmHg (1mmHg=0.133kPa),意识清,呼吸急促,双肺呼吸音粗,双下肺可闻及细湿啰音,心率96次/分,律齐,双下肢轻度水肿。实验室检查:血白细胞 8×109/L,中性粒细胞0.82,血小板92×109/L。经皮脉搏血氧饱和度(SPO ) 2 91%。为了解患者免疫功能状态,需完善的检查包括()。 A.C-反应蛋白 B.淋巴细胞计数、白介素-6 C.T细胞亚群 D.补体C3、C4 E.免疫球蛋白测定 F.单核细胞表达人类白细胞抗原 参考答案:A,B,C,D,E,F

免疫和炎症相关信号通路

免疫与炎症相关信号通路 1、 Jak/Stat Signaling:IL-6 Receptor Family Jak和Stat是许多调节细胞生长、分化、存活和病原体抵抗信号通路中的关键部分。就有这样一个通路涉及到IL-6(gp130)受体家族,它帮助调节B细胞的分化,浆细胞生成和急性期反应。细胞因子结合引起受体的二聚化同时激活受体结合的Jak蛋白,活化的Jak 蛋白对受体和自身进行磷酸化。这些磷酸化的位点成为带有SH2结构的Stat蛋白和接头蛋白的结合位置,接头蛋白将受体和MAP激 酶,PI3激酶/Akt还有其他的通路联系在一起。受体结合的Stat蛋白被Jak磷酸化后形成二聚体,转移进入细胞核调节目的基因的表 达。细胞因子信号传导抑制分子(SOCS)家族的成员通过同源或异源的反馈减弱受体传递的信号。Jak或Stat参与其他受体蛋白的信号传导,在下面Jak/Stat使用表格中有这方面的列举。研究人员已经发现Stat3和Stat5在一些实体肿瘤中被酪氨酸激酶而不是Jaks组成性激活。 JAK/STAT途径介导细胞因子的效应,如促红细胞生成素,血小板生成素,G-CSF,这些细胞因子分别是用于治疗贫血,血小板减少症和中性粒细胞减少症的蛋白质类药物。该途径也通过干扰素介导信号通路,干扰素可以用来作为抗病毒和抗增殖剂。研究人员发现,失调的细胞因子信号有助于癌症的发生。异常的IL-6的信号或导致自身免疫性疾病,炎症,癌症,如前列腺癌和多发性骨髓瘤的发生。Jak抑制剂目前正在多发性骨髓瘤模型中进行测试。Stat3具有潜在促癌性(原癌基因),在许多癌症中持续的表达。在一些癌细胞中,细胞因子信号传导和表皮生长因子受体(EGFR)家族成员之间存在交流。 Jak激活突变是恶性血液病中主要的分子机制。研究人员已经在Jak2假激酶域中发现一个特有的体细胞突变(V617F),这个突变常常发生于真性红细胞增多症,原发性血小板增多症和骨髓纤维化

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液。收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。BCA法。 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。 100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白(根据蛋白分子的大小,煮沸时间可适当变化,一般不低于5min。煮沸只是变性蛋白,而不是分解,一般加了抑制酶不会分解。煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的,只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。蛋白样品变性后与SDS充分结合,SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的,100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳)。 (3)电泳

i.清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。 两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾 干。 ii.灌胶与上样 (1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 (操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。) (2)配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时,可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快。(灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢,否则胶会被冲变型。) (3)当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 (4)配4%的浓缩胶,加入TEMED(TEMED,中文名为四甲基乙二胺,是一种无色透明的液体,有微腥臭味,可以用于配制SDS-PAGE胶。TEMED可以催化APS产生自由基,从而加速聚丙烯酰胺凝胶的聚合,可作为一种促凝剂使用)后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

蛋白质免疫印记技术实验报告

蛋白质免疫印迹技术 曹学敏郭晓华谷中如古泽江 河北大学生命科学学院2010生物技术河北保定071002 摘要:目的:学习掌握动物抗血清的制备原理及技术,通过实际操作学会动物抗血清的制备,掌握Western-blotting的基本原理,熟悉Western-blotting的实验操作。方法:,使用鸡卵类粘蛋白对小白鼠进行常规免疫,获得抗血清,然后利用Western-blotting 检测抗血清。结果:纯化的鸡卵类粘蛋白能引起小鼠的免疫反应 关键词:常规免疫抗血清免疫印记 Abstract:objective:learn to master the theory and technology of preparing animals’ antiserum by operating the experiment in person ,learn to prepare the animals’antiserum , mastering the basic principles of Western-blotting, and being familiar with the experiment operation of Western-blotting. Methods : using chicken ovomucoid operating the routine immunization of laboratory rat, and obtain the antiserum, then detecting the antiserum through Western-blotting. Result: purified chicken ovomucoid can lead to the immunization of laboratory rat Keywords: routine immunization antiserum Western-blotting 前言 免疫印迹(Western blotting)是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学方法该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种常规技术,是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。进行免疫之前必须具备可特异性识别目的蛋白质的单抗或多抗,以及含有目的蛋白质的粗制或纯化的样品。因此,免疫印迹可以从复杂抗原中检出特定的抗原或者从多克隆抗体中检出单克隆抗体,又可以对转移到固相膜上的抗原或抗体进行连续分析,以取得目的蛋白的定位、定性或定量。现在,免疫印记技术,在对人的病理研究上,也有了很大的应用,免疫印记法检测细胞中癌基因的表达及其意义。 1、试剂与器材 1.1小鼠的常规免疫与抗血清的制备所需试剂与器材 注射器蜗旋混合器纯化的鸡卵类粘蛋白苦味酸(以75%乙醇配置)标记小鼠 佐剂(完全佐剂不完全佐剂)酒精棉球冰箱离心机 1.2 Western Blot 12%分离胶,3.6%浓缩胶马斯亮蓝脱色液PVDF膜甲醇电泳缓冲液封闭液(0.5%BSA、TBST溶液)一抗(自制多克隆抗血清以TBST按1:100比例稀释) 二抗(羊抗鼠,按1:1000比例用TBST稀释)DAB显色液蒸馏水镊子烧杯海绵垫 2 方法 2.1 小鼠的常规免疫和抗血清的制备 (1)抗原的提取与制备 1)抗原为纯化的鸡卵类粘蛋白 2)利用苦味酸(以75%乙醇配置)标记小鼠背部 (2)初级免疫:小鼠背部多点皮下注射,0.2mL/只小鼠 1)抗原与佐剂的混合:取1.5mL蛋白与1.5mL完全佐剂混合,震荡混匀,

蛋白质免疫印迹技术常见问题分析 (1)

常见问题分析 一.无信号 一抗和二抗不匹配:二抗需和一抗宿主的物种相同(如一抗来自兔,二抗为抗兔抗体)。没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白:使用高浓度抗体。4 °C 延长孵育时间(如过夜)。封闭剂与一抗或二抗有交叉反应:使用温和的去污剂如吐温-20,或更换封闭剂(常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶)。 一抗不识别待检物种的蛋白:参照说明书,比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应,设置阳性对照。 蛋白上样量不足:每条泳道蛋白上样量不低于20μg,使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。组织中目的蛋白含量低:浓缩使信号最大化。 转膜不充分:使用可逆染色剂如丽春红检测转膜效果,检查转膜操作是否正确。PVDF 膜需预先浸在甲醇中,然后浸到转移缓冲液中。 洗膜过度:勿过度洗膜。 过度封闭使目标蛋白不能显色:使用0.5% 奶粉或无奶粉代替5% 奶粉的抗体稀释液,或更换封闭剂,减少封闭时间。 一抗失效:使用新鲜抗体,重复使用有效浓度会降低。 二抗受叠氮钠抑制:避免叠氮钠和HRP 标记抗体一起使用。 检测试剂盒过期和底物失活:使用新鲜的底物。 二.背景高 未进行非特异性封闭或封闭不充分:延长封闭时间,考虑更换合适的封闭剂。 一抗浓度过高:稀释抗体至合适浓度,以更高稀释度抗体延长孵育时间(耗时长但特异性结合最好)。 二抗与封闭剂非特异性结合或反应:设置二抗对照(不加一抗)。 未结合蛋白质洗涤不充分:增加洗涤次数。 选膜不当产生的高背景:硝酸纤维素膜比PVDF 膜背景低。 膜干燥:在孵育过程中防止膜变干,每一步都要保证膜有充分的反应液,可放入搅拌子不断搅动或轻轻振荡使膜浸在溶液里。 三.多带现象 细胞传代次数过多,蛋白表达不同:使用原始未传代的细胞株,和现在的细胞株一起做平行对照实验。 体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等:参考文献,使用试剂使样品去磷酸化、去糖基化来证明翻译后的修饰。 蛋白样本降解(蛋白质分子量降低):在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。 检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白:查阅其它文献报道,或BLAST 搜寻,使用说明书推荐的细胞株或组织。 一抗浓度过高,高浓度时常出现多条蛋白带:降低抗体浓度和/或孵育时间。 二抗浓度过高,高浓度产生非特异性结合:降低抗体浓度,加入二抗对照(不加一抗)。抗体未经纯化:使用亲和纯化的抗体,减少非特异条带。 目标蛋白形成多聚体:SDS-PAGE 电泳加样前,煮沸10 分钟而不是5 分钟,使蛋白质解聚。 四.背景有不均匀的白色斑点 转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均:转膜过程中尽量除去气泡,抗体孵育时保持摇动。五.背景有黑色斑点 抗体结合了封闭剂:过滤封闭剂。

自身免疫性疾病相关的指标

Medical Diagnosis 医学诊断, 2019, 9(2), 57-60 Published Online June 2019 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/a934540.html,/journal/md https://https://www.wendangku.net/doc/a934540.html,/10.12677/md.2019.92011 Indicators Related to Autoimmune Diseases Kaili Wu Inner Mongolia Medical University, Hohhot Inner Mongolia Received: May 19th, 2019; accepted: June 3rd, 2019; published: June 10th, 2019 Abstract Autoimmune diseases are called systemic autoimmune diseases because of the extensive deposi-tion of antigen-antibody complexes in the vascular wall and other reasons leading to systemic multiple organ damage. It is also known as collagen disease or connective tissue disease, which is caused by cellulose-like necrotizing inflammation of vascular wall and interstitium and subse-quent proliferation of collagen fibers in multiple organs caused by immune injury. CRP monomer CRP has pro-inflammatory effect in the early stage of lesion, macrophage migration inhibitory factor (MIF) aggravates inflammation in the process of inflammation, and sphingosine 1 phos-phate (S1P) level increases in autoimmune diseases; therefore, we can speculate whether CRP and MIF monomer are related to S1P. Keywords Monomer CRP, MIF, S1P 自身免疫性疾病相关的指标 武凯丽 内蒙古医科大学,内蒙古呼和浩特 收稿日期:2019年5月19日;录用日期:2019年6月3日;发布日期:2019年6月10日 摘要 自身免疫性疾病由于抗原抗体复合物广泛沉积于血管壁等原因导致全身多器官损害,称系统性自身免疫病。习惯上又称之为胶原病或结缔组织病,这是由于免疫损伤导致血管壁及间质的纤维素样坏死性炎症及随后产生多器官的胶原纤维增生所致。CRP的单体在病变早期具有促炎效果,巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在炎症过程中使炎症反应加剧,自身免疫性疾病中1磷酸鞘氨醇(S1P)的水平增加;因此我们可以

蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )

蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB ) 标签: western-blot 免疫印迹 蛋白质 蛋白质免疫印迹可应用于:(1)从蛋白质混合物中检出目标蛋白质;(2)定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况;(3)用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。 实验材料 蛋白质样品 试剂、试剂盒 裂解液 PBS SDS上样缓冲液 电泳缓冲液 转移缓冲液 丽春红染液 TBST TBS 洗脱抗体缓冲液 抗体 仪器、耗材 电泳仪移液器脱色摇床显影仪 实验方法原理 Western免疫印迹,是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,探针是抗体,显色用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤 一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0 ml;β-巯基乙醇 0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液:甘氨酸 2.9 g;Tris 5.8 g;SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4):NaCl 8.0 g;KCl 0.2 g;Na2HPO4 1.44 g;KH2PO40.24 g;加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液:考马斯亮兰 0.2 g;甲醇80 ml;乙酸2 ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液:DAB 6.0 mg;0.01 M PBS 10.0 ml;硫酸镍胺 0.1 ml;H202 1.0 ul。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 (1) 倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。 (2) 每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 (3)按1ml裂解液加10 ul PMSF(100 mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)

血浆免疫球蛋白检测的临床价值

血浆免疫球蛋白检测的临床价值 燕备战 河南省人民医院输血科 郑州市 450003 关键词 免疫球蛋白轻链 血浆 检测 中图分类号:R446 1 文献标识码:B 文章编号:1672-3422(2006)07-0044-01 免疫球蛋白的基本结构是4条肽链,2轻2重,肽链之间由二硫键相联结。任何一种免疫球蛋白,只有一类别的重链,轻链相同。根据重链的不同分五种,即I gA、Ig G I g M、Ig D和Ig E,血浆中I gG含量最高,IgE含量最低,而尿液中只有微量I gG[1]。在机体患某种疾病时,可有1种或几种免疫球蛋白明显升高或减低。因此,血液中免疫球蛋白定量是一个极有价值的检查,结合尿液中免疫球蛋白分析对许多疾病具有直接诊断意义。 1 资料与方法 1.1 资料 正常对照组:健康体检者40例,男22例,女18例,年龄19~60岁,平均35.4岁。 实验组:从2003年1月~2006年1月入院,血清 I g异常患者共141例,男81例,女60例,平均年龄 56.2岁。其中确诊多发性骨髓瘤(MM)62例,肝硬化(LC)49例,系统性红斑狼疮(SLE)30例。试剂:血清I g定量检测试剂及标准品均为B ec l u nan 公司产品。I FE使用法国Seb ia公司试剂盒。 1 2 试剂 血清I g定量检测试剂及标准品均为Beclunan产品。I FE使用法国Sebia公司试剂盒。 1.3 方法 血清蛋白电泳:加样10 l血清,扩散、点样、电泳、烘干,染色、脱色、烘干,扫描。 免疫固定电泳:加样10 ,l扩散10m in,血清蛋白分离,加相应抗血清于GAM, 泳道各25 ,l对照泳道加40 l蛋白固定剂,孵育5m in,吸去抗血清,烘干、洗涤、染色、脱色、烘干。 2 结果 各组血清中免疫球蛋白及轻链含量的测定结果见表1、2、3。 表1 不同类型MM的血清 、 检测结果比较 (x s,g/L) 分型n / I gG 2981.14 13.45*0.78 0.56*102.15 25.63* I gG 162.07 0.11*49.23 12.15*0.04 0.01* I gA 852.13 19.521.90 0.98*26.15 4.21* I gA 31.79 0.87*25.17 9.61*0.07 0.02* I g M 21.97 1.09*30.76 15.23*0.06 0.02* LC 320.61 4.59*3.01 1.43*7.12 1.56* LC 13.82*14.82*0.26* 正常对照组2510.56 2.734.70 1.432.31 0.54 *与正常对照组比较P<0.05. 表2 不同类型MM的血清IgG、IgA、Ig M检测比较 分型n I gG I gA I g M IgG型4576.51 21.12*0.48 0.320.38 0.28 Ig A型115.12 2.4356.28 18.32*0.42 0.22 Ig M型25.93 1.930.63 0.1740.23 13.87* LC型410.43 5.731.38 1.270.59 0.31 正常对照组2513.21 2.712.01 0.311.42 0.25 *与正常对照组比较P<0.05. 表3 LC及SLE患者血清IgG、IgA、Ig M检测比较 病例n IgG Ig A Ig M LC4932.67 3.12* 3.46 1.352.29 0.67 SLE3026.03 2.79* 2.23 1.164.31 0.88* 3 讨论 单克隆Ig升高,是指一个细胞在某一分裂阶段发生突变,然后急剧分化、增殖,并大量表达某种单一的Ig,多克隆Ig升高,系指各种Ig产生细胞全面增殖。多克隆Ig升高可见于慢性肝炎、肝硬化、慢性感染性疾病及结缔组织病等,病因去除后多克隆免疫球蛋白可下降[2]。MM是恶性单克隆增殖病[3],本研究中, 型的MM患者血清中的K 浓度均显著增高, 浓度均降低, / 明显高于正常范围, 型的MM患者血清中的 浓度均显著增高, 浓度均显著降低, / 明显低于正常范围。各类型(LC型除外)对应的单克隆免疫球蛋白的浓度显著增高,非对应的Ig的血清浓度则显著下降。LC型由于完整的免疫球蛋白合成受到抑制各类型I g含量降低。LC及SLE患者,各类型I g及轻链虽然增高,甚至超过正常人上限数倍以上,但I FE结果均表明为多克隆增高,单纯从含量的增加难以判断是否为单克隆增殖,所有Lc及SLE患者 / 均正常,因此我们可以根据 / 值来初步鉴别多克隆与单克隆免疫球蛋白升高。 参考文献 1 孔宪涛.免疫球蛋白异常的基础和临床.上海:上海科 学技术文献出版社,2003:149-203 2 刘洗永,杨福荫.抗生素与免疫球蛋白.中国抗生素杂 志,2000,25(1):28 3 陈末,沈悌.多发性骨髓瘤的误诊.临床误诊误治,2000, 13(4):2882006-01-13收稿 44 医药论坛杂志 2006年4月 第27卷 第7期

肿瘤微环境中免疫与炎症的调节_黄波

中国肿瘤生物治疗杂志http ://www.biother.org Chin J Cancer Biother ,Apr.2012,Vol.19,No.2 DOI :10.3872/j.issn.1007-385X.2012.02.001 ·专家论坛· 肿瘤微环境中免疫与炎症的调节 黄波(华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系,湖北武汉430030) 黄波,教授、博士生导师。于2002年获生物化学与分子生物学专业博士学位后,分别在瑞典Karo-linska Institute 、加拿大University of Calgary 及美国Mount Sinai School of Medicine 从事博士后研究工作,2006年初回国后在华中科技大学同济医学院从事肿瘤免疫的研究。近年来,在阐明肿瘤免疫抑制微环境的成因及其机制、调节性T 细胞的清除及应用、以肿瘤微环境为靶点的肿瘤治疗等方面取得了一系列原创性成果。作为通信作者或第一作者在Blood 、 EMBO Rep 、Cancer Res 、J Immunol 、Clin Cancer Res 、J Biol Chem 、PLoS One 等国际主流杂志发表论文27篇,并受邀为Oncogene 、Cancer Metastasis Rev 、Cell Mol Immunol 等杂志撰写综述。先后受邀在第6届中日双边肿瘤学峰会(北海道)、第70届日本肿瘤学年会(名古屋)、 第2届Treg 和Th17国际大会(上海)、第二届中日韩免疫学研讨会(大阪)、第二届中德免疫学峰会(北京)上作学术报告。E-mail :tjhuangbo@hotmail.com [摘 要]免疫和炎症构成肿瘤微环境的两大核心,但两者之间关系并不清楚。髓源抑制性细胞(myeloid derived suppressor cell ,MDSC )和调节性T 细胞(regulatory T cell ,Treg )等抑制性细胞趋化至肿瘤部位可抑制炎症,而非介导肿瘤免疫逃逸;肥大细胞则通过对MDSC 和Treg 的调节,介导免疫和炎症的对话;作为肿瘤微环境中基本信号通路的Toll 样信号可以直接调节免疫和炎症, 并通过微颗粒途径精细调控肿瘤炎症的稳定。不管肿瘤炎症和免疫的关系如何复杂而交错,一般认为,肿瘤微环境的抗肿瘤免疫和炎症呈现出一种负相关关系,即在肿瘤的早期,免疫反应较强而炎症较弱;但在肿瘤的后期,免疫反应较弱而炎症较强。 [关键词]肿瘤微环境;免疫;炎症;调节机制[中图分类号]R730.2;R730.3 [文献标志码]A [文章编号]1007- 385X (2012)02-0111-05[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No.30871020);新世纪大学优秀人才计划资助项目(No.NCET-08-0219);国家自然科学基金国际合作项目(No.30911120482)。Project supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30871020),the Program for New Century Ex-cellent Talents in University (No.NCET-08-0219),and the International Cooperationand Exchange of the National Natural Science Foundation of China (No.30911120482) [网络出版]http ://www.cnki.net /kcms /detail /31.1725.R.20120328.1620.010.html Regulation of immune response and inflammation in tumor microenvironment HUANG Bo (Department of Biochemistry and Molecular Biology ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan 430030,Hubei ,China ) [Abstract ]Immune response and inflammation composes two cores of tumor microenvironment.However the relationship between them remains elusive.Studies corroborate the idea that the mission of myeloid derived suppressor cells (MDSCs )and regulatory T cells (Tregs )that migrate to tumor sites is to suppress inflammation rather than mediate tumor immune eva-sion.Mast cells ,however ,mediate the crosstalk of immune response and inflammation by regulating MDSCs and Tregs.In addition ,Toll-like signaling ,as the basic signaling pathway in tumor microenvironment ,may directly regulate immune re-sponse and inflammation ,maintaining inflammatory homeostasis through microparticle pathways.Despite the very complex relationship between immune response and inflammation ,we suggest that antitumor immune response and inflammation are negatively correlated and time dependent.At the early stage of tumor ,antitumor immune responses are dominant.Later ,the bias favors inflammation in tumor microenvironment. [Key words ]tumor microenvironment ;immune response ;inflammation ;regulatory mechanism [Chin J Cancer Biother ,2012,19(2):111-115] · 111·

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