Leica TCS SP5操作规程 by jennifer

Leica TCS SP5 简明操作规程

一、开机

1. 依次打开电脑桌右侧“PC Microscope”、“Scanner Power”及“Laser Power”三个圆形按钮，然后将“Laser Power”按钮右侧的激光开关钥匙（Laser Emission）顺时针旋转90度至“On-1”位置。如图1-1。记录开机时间。

图1-1 SP5系统开关

2. 打开显微镜电源(如图1-2)，及荧光电源。

荧光系统若以汞灯为光源，参照图1-3；若以金属卤素灯为光源，参照图1-4。如有必要，记录荧光灯使用时间。

图1-2 显微镜电源(1.指示灯；2.电源开关)

图1-3 汞灯电源(1.电源开关；2.汞灯使用时间显示)

图1-4 EL6000荧光电源(1.电源开关；2.使用时间显示；3.光闸；4.光强控制) 3. 双击电脑显示屏桌面上的“LAS AF”图标启动徕卡共聚焦软件。如图1-5。

图1-5 LAS AF图标

4. 如需使用快扫系统，在“Activate Resonant Scanner”选项前打勾。如图1-6。

图1-6 快扫或高分辨成像系统模式

5. 点击“OK”以打开软件。如图1-7。

图1-7 LAS AF启动界面

系统自检完毕后，显示LAS AF基本界面。如图1-8。

图1-8 LAS AF基本界面

二、在显微镜下观察样品

1. 选择合适的物镜，可通过显微镜主机右侧的物镜转换按钮，如图2-1，或软件中的“Objectives”键进行选择，如图2-2。

图2-1 显微镜主机右侧部分(1. 调焦按钮；2. 物镜转换按钮)

图2-2 通过软件选择物镜

2. 将样品置于载物台上，在明场条件下选择合适的视野。通过显微镜主机右侧的调焦按钮或旋钮调节至合适的z 轴平面，通过显微镜主机左侧的“INT”功能键调节光强。如图2-3。

2

图2-3 显微镜主机左侧部分功能键 (1.透射与反射切换；2.孔径光阑调节；3.光强调节；4.视场光阑调节)

3. 按“TL/IL”功能键转换至荧光观察方法，通过显微镜前面板的按钮选择合适的荧光滤块，进行样品的荧光观察。如图2-4。

图2-4 显微镜前面板(红线所示为荧光滤块选择按钮，红色椭圆所示为荧光光闸按钮)

4. 观察完毕后，按显微镜前面板上的“SHUTTER”键以保护样品。如图2-4。

三、采集共聚焦图像

1. 点击工具栏下方的“Configuration”，再点击“Laser”，用9打开所需激光。如需使用Ar离子激光，拖动滑块调节激光输出功率。如图3-1。

图3-1 激光的选择

表3-1 常用激光及其波长

激光波长

405 Diode 405 nm

nm

Argon 458,476,488,(496),514

HeNe 543 543 nm

DPSS 561 561 nm

HeNe 633 633 nm

2. 点击“Aquire”进行光路设置。

调用已有的设置：选择“Load/Save single setting”下拉菜单中已有的设置(激光及其输出功率、分光镜、检测波长范围、PMT gain及offset)，常用的荧光染料都已包含在内。选择某一设置后，可按样品的实际情况对参数进行优化(如后述)，并以新的名称保存。

修改已有设置：可改变所选激光、调节激光输出功率、改变分光镜、改变所选PMT、调节PMT检测范围、调节PMT的gain或offset等。如图3-2。

建立新的设置：也可从零开始建立新的设置。如图3-2，选择所需激光及其功率、适宜的分光镜、PMT及检测波长范围。

图3-2 光路设置

3. 透射光检测器的选择

单击“Additional Channels”以显示透射光检测器(PMT Trans)，选择观察方法(BF 、DIC 等)。如图3-3。

图3-3 透射光观察方法及检测器

4. 选择扫描模式

在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中选择扫描模式(Acquisition Mode)，如图3-4。

默认模式为xyz 扫描，是最常用的扫描模式，可用于xy 扫描和z 轴层切(xyz 扫描)。还可在下拉菜单中选择由x ，y ，z ，t (时间)以及λ (波长)组合而成的多维扫描模式，如xzy ，xyt ，xy λ，xyzt ，xyz λ，xyz λt 等。

图3-4 扫描模式

点击并在下拉菜单中选择扫描模式

点击并在下拉菜单 中选择观察方法

可选择的激光光源 (●开 ●关)

调节激光输出功率的滑块

调节各PMT 检测范围的滑块 (双击可显示波长范围数值)

PMT 所用伪彩

(单击可改变当前选项)

系统已保存的荧光染料名称，选择后可显示发射波长范围

用 9 激活所需PMT

5. 设置扫描参数

在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中设置扫描参数，包括分辨率(format)、扫描速度(speed)、针孔大小(pinhole size)、线平均(line average)、面平均(frame average)、累加(accumulation)及放大倍数(zoom)等。如图3-5。

图3-5 扫描参数的设置

分辨率：默认值为512×512。也可选择更低或更高分辨率。分辨率越高，所获取的图像文件越大，采图所需时间也越长。

扫描速度：默认值为400Hz 。活细胞或运动的样品成像可能需要更快的速度。可选择双向扫描(Bidirectional X)来达到更高速度，这时可能需要进行相位校准(Phase correction)。

针孔大小：默认值为1Airy 。如果样品的荧光非常弱，可通过增大针孔直径来增加信号强度，所获取图像的光切厚度也会随之增加。

平均：用于降低背景噪音。分为线平均(Line average)和面平均(Frame average)，线平均较快。可在下拉菜单中选择平均的次数。两种平均方式可结合使用。 累加：仅用于荧光非常弱的样品。

6. 预览图像

点击“Live”以设定的扫描参数预览图像，图像将显示在右侧的显示屏上。如图3-6及1-8。

图3-6 预览图像

7. 优化扫描参数

预览图像时，调节z 轴位置找到最适合观察的焦平面，并调节PMT 的电压值(Smart gain)及偏移值(Smart offset)，或激光输出功率，使图像达到最佳。可通过控制面板上相应旋钮调节以上参数。如图3-7。

单击箭头以显示完整菜单

图3-7 控制面板

理想的荧光图像中应该只有少数象素点达到饱和(即灰度值为255)，可通过位于图像左侧的LUT按钮进行观察。LUT按钮可在LUT (即指定的荧光颜色，也称伪彩)、“Glow Over Under (GlowOU)”和灰度图三档之间切换。在GlowOU模式中，灰度值为255的象素点显示为蓝色，而灰度值为0的象素点显示为绿色。调节PMT电压值使图像中仅少数象素点呈蓝色。应使用较低的激光输出功率和较高的PMT电压值，这有助于保护样品免受光漂白的影响。通过调节PMT偏移值来降低图像的背景。荧光图像PMT偏移的默认值为0%，通常应将其调为负值以使图像背景呈绿色。调节过程中不应使其大于0%。图3-8b亮度及背景值设置均未达最优化值，调节PMT 电压值及偏移值后，达到图3-8c中的效果，部分信号呈蓝色，而背景呈绿色。

对透射光图像，同样可以调节透射光PMT的电压和偏移值来进行优化，有时可将偏移值调至高于0%以增加对比度。

图像调至满意后，单击“Stop”终止预览过程。

a 伪彩模式

b GlowOU模式，图像未优化

c GlowOU模式，图像已调至最佳状态

图3-8 调节PMT电压值及偏移值前后的图像

对于双重或多重染色的样品，可选择同时扫描或序列扫描的方式。

如果两种或多种荧光探针的强度相当且交叉激发不严重，则可通过调节激光功率、PMT电压值和接收波长范围来避免串色。下面以GFP和Cy3双染为例来介绍双通道同时扫描时如何有效避免串色。

1) 只用488nm激光激发，用2个PMT同时接收荧光信号，范围可设为500-530nm(GFP通道)及560-600nm(Cy3通道)。在可获得良好GFP信号的前提下，尽量降低488nm激光的功率，从而减少串色到Cy3通道内的GFP信号，同时调低560-600nm的PMT电压值至Cy3通道几乎看不到光信号为止。

2)打开543nm激光并逐渐增加其功率直至获得满意的Cy3通道图像，此时该通道接收到的信号完全为543nm激光激发Cy3的结果。注意，在此过程中不要改变PMT的电压值。

3) 对于三重染色样品，在调整好两个较短波长通道后，再继续调节最长波长通道的激光功率、PMT电压值和接收波长范围。

若荧光探针强度不平衡，且短波长光明显强于长波长光，则需使用序列扫描，或在采图完毕后使用Process→Dye Separation来进行串色分离。

若荧光探针之间存在严重的交叉激发，必需使用”Dye Separation”来进行串色分离。

Smart Gain Smart Offset Z Position

8. 采集图像

对于单通道染色，或多通道染色同时扫描，单击“Capture Image”采集图像。对于序列扫描，或多维图像扫描，单击”Start”进行图像采集。如图3-9。在此之前可改变扫描分辨率、线/面平均次数等扫描参数。

图3-9 采集图像

通常情况下，预览图像时选择512×512的分辨率、400Hz的扫描线速度。

而采集图像时，为充分利用物镜的分辨能力，根据Nyquist采样原则，像素点大小(Pixel Size)最好达到物镜侧向分辨率的一半数值。物镜分辨率可从Configuration→Objective界面读取。像素点大小可在采图参数设置界面获得，如图3-10。像素点随扫描分辨率增大和放大倍数增加而减小。

图3-10 像素点大小

因此，建议按照表3-2设置参数，以获取高质量图像。

表3-2 部分采图参数的建议值

物镜数值孔径扫描分辨率扫描线速度(Hz) 放大倍数(zoom)

100 3

2048×2048

10× 0.4

1024×1024

200 5 20× 0.7

1024×1024

200 3 40× 0.85

200 3 63× 1.4

1024×1024

四、序列扫描

如果样品采用两种或以上荧光染料标记，为避免串色对实验结果的影响，可采用序列扫描的方式。

1. 单击“Acquisition”中的“seq”按钮，如图4-1，软件界面中将出现如图4-2的序列扫描菜单，可通过“Scan 1”右侧的“+”添加更多的扫描序列(“Scan 2”，“Scan 3”……)。

图4-1 序列扫描按钮

图4-2 序列扫描菜单

2. 调用所需的单一采图设置，预览并优化参数至满意后，点击“Scan 1”将参数定义至第一扫描序列。

3. 同法定义“Scan 2”及更多的序列。

4. 扫描顺序“between lines”适合大多数的应用，特别是活细胞成像。

5. 调整分辨率、线/面平均次数等扫描参数后，点击“Start”进行序列图像的采集。

6. 可保存序列扫描的设置以便将来调用。

五、z轴层切 (xyz扫描)

z轴层切用于观察样品中目标的空间分布。

图5-1 xyz扫描

1. xyz扫描模式为默认采图模式。如图5-1。

2. 选择“z-Galvo”，用SuperZ进行z轴调节；或“z-Wide”，用物镜进行z轴调节。

3. 设置采图参数，方法同前。

4. 点击“Live”进行图像预览。用控制面板的“Z-Position”旋钮调节z轴至层切所需的起点，点击“Begin”上方的黑色箭头定义层切起点(箭头变为红色表示已定义)；调节z轴至层切所需的终点，点击“End”上方的黑色箭头定义层切终点。

5. 点击“Stop”终止图像预览。

6. 此时xyz层切菜单中显示的“z-step size”(相邻两个光切面的间距)和“Nr. of steps”(层切数目)为系统的优化值(“system optimized”)。也可点击“Nr. of steps”左侧的按钮，然后对相邻光切面间距或层切数目进行自定义。

7. 选择合适的分辨率和扫描线速度，点击”Start”进行xyz图像的采集。

8. 采图完毕后，应点击“Begin”和“End”上方的红色箭头，使其变为黑色，重新处于未定义状态。

六、时间序列扫描 (xyt扫描)

时间序列扫描多用于活细胞成像，记录动态过程。

1. 在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中选择xyt扫描模式后，将出现xyt扫描菜单，如图6-1。

2. 设置采图参数，方法同前。

3. 定义“Time Interval”，即采集相邻两帧图像所需的时间间隔，也可选择最小值“Minimize”。

4. 按采图需要选择“Acquire until stopped”、“Duration”或“Frames”。

若选择“Acquire until stopped”，则图像将持续采集，直至手动终止。

若选择“Duration”，可定义采图所需的总时间。

若选择“Frames”，可定义所需的图像帧数。

5. 点击“Apply”确定。

6. 选择合适的分辨率和扫描线速度，点击“Start”进行时间序列图像的采集。

图6-1 时间序列扫描

七、波长扫描 (xyλ扫描)

波长扫描常用于自发荧光或新染料发射光谱的检测。

1. 选择激发光，方法同前。

2. 在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中选择xyλ扫描模式后，将出现波长扫描菜单，如图7-1。

3. 定义“Begin”(需检测的发射谱起点)和“End”(需检测的发射谱终点)。起点所在波长应大于激发波长。

4. 定义“Band Width”(接收的带宽)，通常为10nm。

5. 定义“No. of steps”(采集的帧数)或“Lambda Stepsize”(波长步进)。波长步进不应大于接收带宽。

6. 选择所用PMT。

7. 选择合适的分辨率和扫描线速度，点击“Start”进行波长图像的采集。

图7-1 波长扫描

8．扫描结束后，可保存发射光谱信息。操作路径为：

Process→Tools→Dye Separation→Spectral，在所采图像中选择有信号的区域，点击”Save Current Spectrum”，即可将当前的发射光谱信息保存至系统数据库中。

八、图像文件的保存及输出

1．图像文件的操作：“Acquire”的”Experiment”下显示采集的所有图像文件名称，右键点击图像文件名，可进行多种操作。如图8-1。

图8-1 图像文件的操作

文件保存格式为.lif原始文件，只能通过Leica LAS AF或LAS AF Lite软件打开。

2．图像文件的输出：右键点击图像文件名，选择”Export”进行图像输出，可输出成图片(.tiff或.jpeg)，三维或多

维图像还可输出成电影(.avi)。如图8-2。所得文件可用其他图像浏览软件打开。

图8-2 图像文件输出成通用格式图8-3 文件输出成图片

选择”As Tiff”或”As JPEG”，出现如图8-3的对话框，可选择输出路径、所需标尺及位置等。确定后，点击”OK”，即可将图像输出至指定路径。

选择”As A VI”，出现如图8-4的对话框，除可选择路径、标尺等参数外，还可设定avi电影的播放速度(Frame/sec)，以及是否进行压缩(Use compression)。

关闭当前文件夹

保存当前文件夹

保存所有文件夹

另存当前文件夹

增加新的子文件夹

删除当前文件

重命名当前文件

剪切当前文件

复制当前文件

以通用格式输出当前文件

当前文件的采图参数

在新的图像窗口打开当前文件

输出叠加图像或各单通道图像

选择输出路径

输出原始图像

时间标尺

相对时间标尺

长度标尺

z轴标尺

图8-4 文件输出成电影

3．图像采集参数的观察及恢复：右键点击图像文件名，选择”Properties of…”，即显示该图像采集时的所有参数设置信息，如图8-5。

图8-5 采图参数

点击”Apply Settings”，即可恢复该图像采集时的参数设置。点击”Save as...”，可将所有参数信息输出成.xml 文件并存至指定路径。

九、关机

1. 保存已采集的图像。

2. 关闭显微镜荧光电源。

3. 若使用过油镜，需用无水乙醚与无水乙醇混合液(体积比7：3)或无水乙醇清洁镜头。

4. 关闭LAS AF软件。

5. 将电脑桌右侧“Laser Power”按钮右侧的激光开关钥匙(Laser Emission)逆时针旋转90度至“On-0”位置。

6. 关闭“Scanner Power”按钮。

7. 在电脑上进行图像数据的输出。注意：使用空白光盘刻录，不得使用任何其他形式的移动存储介质。

8. 关闭电脑后，关闭“PC Microscope”按钮。

9. 风扇停止后(关闭激光开关钥匙约5分钟后)，关闭“Laser Power”按钮。记录关机时间、仪器状况等信息。