人尿激酶原突变体的构建及其特性的研究

基因突变发现及其机理研究与应用

附件 中国人群血液肿瘤患者IDH1、IDH2、DNMT3A 基因突变发现及其机理研究与应用 一、项目基本情况 提名单位：昆明医科大学第一附属医院 主要完成人：曾云，张登峰，杨金荣，于明，邹阳，向国强，王燕梅 完成单位：昆明医科大学第一附属医院、中国科学院昆明动物 研究所、昆明医科大学 项目所属学科：医疗卫生 任务来源：国家自然科学基金委员会、云南省科技厅 学科分类名称：血液病学代码:320.2430. 所属国民经济行业：卫生和社会工作 计划名称和编号： 1.国家自然科学基金地区项目《血液肿瘤患者IDH1基因的突变及其致病机理研究》（81060046） 2.云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项项目《DNMT3A在IDH1致急性髓系白血病基因组高甲基化中的作用》（2014FB027） 项目研究起止时间：2011年至 2017年 成果最早应用时间：2013年 推广应用单位：全国省内外十三所医疗单位 二、项目简介

血液肿瘤在病因学、病理学以及临床表现上都存在差异，是一大类异质性疾病，这为患者临床确诊和对症治疗带来许多难题。血液肿瘤的发病机制是复杂的，其中遗传因素对血液肿瘤的发病起着重要的作用。该项目在国家自然科学基金等项目，共35万元科研经费支持下，通过在中国西南群体中完成“中国人群血液肿瘤患者IDH1、IDH2、DNMT3A基因突变发现及其机理研究与应用”的系列工作，发现IDH1、IDH2、DNMT3A基因突变主要发生在急性髓系白血病(AML)患者，尤其是复发难治AML患者，其他恶性血液病中罕见突变；在机理研究中发现IDH1参与的传统通路HIF-1α信号和细胞内ROS可能没有参与IDH1 突变致血液肿瘤的过程，而DNMT3A可能参与介导IDH1/2突变所致的基因组高甲基化。同时，该项目研究中取得了国际领先的“四个科学发现”，为这一类血液肿瘤患者的治疗提供新思路。该研究在国际上率先发现如下： 1.IDH1 p.I99M 与 IDH2 p.R140Q 突变同时出现在1例骨髓增生异常综合征(MDS) 转化而来的AML患者中，且该患者预后极差。 2.国际首次在NK/T淋巴瘤（鼻型）和外周T细胞淋巴瘤（非特异型）患者中检测到IDH1基因突变p.R132G、p.R132H，两例患者预后极差，提示IDH1的基因突变可能参与了部分非霍奇金淋巴瘤(NHL)病人的发病，可能是其预后不良的一个指标。该研究发现为这类患者的治疗提供了新思路和方向。 3.在复发难治的Ph+的B-ALL患者中可检测到DNMT3A基因突变，且该患者预后极差。为这类患者的治疗提供了新思路，为可能的药物开发提供了新的靶点。 4.DNMT3A参与介导IDH1/2突变所致的基因组高甲基化。该研究将两种重要的血液肿瘤致病基因在功能上进行了关联，为下一步开

《烟草突变体库创建与功能基因组学研究》项目内容与

附件： 《烟草突变体库创建与功能基因组学研究》项目内容与目标 一、总体要求 突变体通常指某个性状发生可遗传变异的材料，或某个基因发生突变的材料。长期以来，育种家尽力地发现和分离有价值的自然突变和变异材料。自20世纪70年代以来，γ射线和 EMS 理化诱变创制的人工突变体在遗传育种中开始应用，此后，T-DNA 插入和转座子标签等插入突变筛选突变体法的发展，大大地加快了突变体的创制步伐。水稻、番茄、油菜等作物中已建立了一系列突变体库，但烟草突变体库的创制基本没有开展。 建立烟草突变体库是烟草功能基因组学研究不可缺少的重要组成部分，是克隆和阐明烟草重要功能基因的基础和前提。随着烟草饱和突变体库的建立，可望直接获得突变基因的序列信息并确证基因序列与功能的关系，从而促进烟草重要功能基因的克隆鉴定。 利用理化诱变技术创制烟草突变体库本身也是一种传统的育种技术，通过筛选突变体，可望获得一系列性状特异、能稳定遗传、有利用价值的烟草育种材料，直接应用于新品种选育。 二、招标项目内容与目标

（一）攻关内容。 1．利用EMS、快中子诱变创建二倍体烟草（绒毛状烟草）、四倍体普通烟草的饱和突变体库。 2．利用逆转座子Tto1和Tto2创建四倍体烟草插入标签突变体库。 3．建立基于Tilling技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 4．建立基于PCR技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 5．建立基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 6．在建立功能基因克隆验证体系的基础上，对突变体进行初步的遗传分析并对重要农艺性状相关基因进行表达特性和功能分析。 （二）攻关目标。 1．创建烟草饱和的突变体库4个（二倍体、四倍体突变体，EMS突变体和快中子突变体），突变体数达8万个；逆转座子标签突变体2万以上。 2．建立基于Tilling技术、基于PCR技术、基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系并进行重要基因的克隆与功能鉴定。 3．阐明控制亚硝胺、钾含量、抗病等重要农艺性状的基因3个以上，获得低亚硝胺、高钾含量、高抗病的育种材料10个以上。

基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法和设备的制作技术

本技术涉及二代测序分析领域的基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法和装置。该方法包括：获取新鲜肿瘤冷冻组织样本体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本体细胞突变最高一致性时的过滤参数作为过滤阈值；检测待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变；过滤与正常样本变异位点集重合的位点；过滤未达到所述过滤阈值的体细胞突变位点；过滤生殖细胞突变和高频突变位点。本技术以PON、以基于石蜡切片组织特征的特异性训练体细胞突变位点过滤阈值以及以已有数据库过滤生殖细胞突变和高频突变位点作为体细胞突变检测的过滤条件，能够快速剔除大部分由石蜡切片制备造成的假阳性结果，提高检测效率和特异性，快速精准检测石蜡切片体细胞突变。 权利要求书 1.基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 获取正常组织石蜡切片样本的测序结果，将所述测序结果与人类参考基因组比对，所得比对数据构建正常组织石蜡切片样本的正常样本变异位点集； 分别获取同一组织来源的新鲜肿瘤冷冻组织样本、肿瘤组织石蜡切片样本和正常组织样本的测序结果，基于测序结果，在不同过滤参数下检测新鲜肿瘤冷冻组织样本的体细胞突变和肿

瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变； 对比所述新鲜肿瘤冷冻组织样本体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本体细胞突变的一致性，获取最高一致性时的过滤参数作为过滤阈值； 分别获取待测肿瘤组织石蜡切片样本及其配对正常组织样本的测序结果，基于测序结果检测待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变，得到原始变异结果； 过滤所述原始变异结果中与正常样本变异位点集重合的位点，得到第一体细胞突变结果； 过滤所述第一体细胞突变结果中未达到所述过滤阈值的体细胞突变位点，得到第二体细胞突变结果； 过滤所述第二体细胞突变结果中生殖细胞突变和高频突变位点，即得待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变结果； 所述过滤参数包括体细胞变异位点的测序深度总和、变异等位基因频率、链偏好性、Read 朝向偏好性、测序质量值、胚系突变干扰值、污染物干扰值、碱基质量值中位数、平均比对质量值、片段长度中位数、reads末端距离中位数、假阳性优势对数、覆盖reads总数、位点杂合纯合性优势对数、短片段重复次数、链偏好质量值、聚合酶滑动质量值中的一种或一种以上；针对所述过滤参数设定阈值。 2.根据权利要求1所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，所述过滤参数包括变异等位基因频率、链偏好性和Read朝向偏好性中的一种或一种以上。 3.根据权利要求2所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，所述链偏好性的计算公式为：链偏好性 = 正向读长深度 / 所有读长深度； 所述Read朝向偏好性的计算公式为： 其中，SOB表示Read朝向偏好性；

突变体构建

突变体构建 1.定点突变：快速，高效，简便 设计原理：引物与模板链退火，pfu DNA聚合酶合成突变链。DpnⅠ酶体外降解非突变型质粒模板（甲基化质粒模板） 设计引物： 引物包含5’端重叠区和3’端延伸区。 引物长度：除突变点之外，两条引物的长度大约为30个核苷酸，5’端重叠区包含15-20个碱基，3’端延伸区包含至少10个碱基。 突变引物：突变点位于两条引物上，分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区；反向突变引物5’端。 退火温度的计算不包括突变碱基。如图： 5’’3’-TACTGGTACTAATGCGGTTCGCGC G 延伸区重叠区 2.嵌合型突变体的构建： 将一个基因与另一个基因，互换构建嵌合型突变变体，可以通过overlapping PCR的方法获得。 ●原理： 比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。 A的序列为5-atgcatgctagctagaacgct acgctgactaccccctgatc-3， B的序列为5-atgctagtagctagcccccc cc aggggataattttttaaaacg-3。 ●首先我们要设计引物，假设引物的序列为： A1:5-atgcatgctagctagaacgct-3 A2:5-ggggggctagctactagcat gatcagggggtagtcagcgt-3 B1:5-acgctgactaccccctgatc atgctagtagctagcccccc-3 B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3 （设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。） ●步骤： （1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因 （2）回收A，B基因 （3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。

拟南芥突变体购买流程-完全图解

最近要购买一批拟南芥突变体，想请教有经验的虫友购买拟南芥突变体的具体流程，例如我需要一个APETALA1的突变体，应到哪个网站进行搜索，怎样进行选择订购，越具体越好，有截图就更好了，谢谢大家了！ Step 1. 打开NCBI主页：https://www.wendangku.net/doc/ab401497.html,/ 打开的页面如下： 如下 得到如下页面：

进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图： 记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：https://www.wendangku.net/doc/ab401497.html,/ 点击T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：

显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：

临床上宜单独输注的药物

临床上宜单独输注的药物 抗菌药物因其不稳定性、中药注射剂因其成分的复杂性，在临床使用时其注射制剂推荐单独使用；但除了这两种药物之外，在临床中还有很多药物也不宜与其他药物混合使用(不同厂家的说明书可能要求不同)： 1. 质子泵抑制剂(奥美拉唑、泮托拉唑与兰索拉唑)：《中国药典》(2015版)规定，注射用奥美拉唑钠的pH值应为10.1~11.1，注射用泮托拉唑钠的pH值应为9.5~11.0，注射用兰索拉唑的pH值应为10.5~1 2.5；因其注射液均呈碱性，易与其他药物发生反应，故配制的溶液不能与其他药物混合或在同一注射器中合用； 2. 奥沙利铂、表柔比星、米托蒽醌、长春地辛、卡铂：本品不能与其他药物混于同一注射器中使用或同时输入； 3. 注射用盐酸吉西他滨：0.9%氯化钠注射液(不含防腐剂)是唯一被允许用于重新溶解吉西他滨无菌粉末的溶液；除此之外，本品不得和其它药品混合； 4. 白消安注射液：不要同时输注其他相容性未知的静脉注射溶液； 5. 注射用磷酸氟达拉滨：不可与其他药物混合使用； 6. 羟喜树碱注射液：由于本品呈碱性，与其他药物混合易引起pH改变，应尽量避免配伍使用； 7. 注射用盐酸柔红霉素：柔红霉素切不可与肝素混合：因这类药物在化学性质上不相配伍，可产生沉淀物；柔红霉素可与其它抗白血病药物联合应用，但切不可用同一只针筒来混合这些药物； 8. 止吐药(昂丹司琼、格拉司琼、帕洛诺司琼、甲磺酸多拉司琼)：本品不应与其他药物混合使用； 9. 注射用利福平：不能与其他药物混合在一起使用，以免发生沉淀，与其他静脉注射药物合并治疗，需通过不同部位注射;

10. 注射用利福霉素钠：本品不宜与其他药物混合使用，以免药物析出； 11. 注射用阿昔洛韦：本品呈碱性，pH值为10.5~11.5；与其他药物混合容易引起pH值改变，应尽量避免配伍使用； 12. 注射用更昔洛韦：本品不应混合其它静注物； 13. 静脉注射用人免疫球蛋白(pH4)：本品应严格单独输注，禁止与其他药物混合输用； 14. 果糖二磷酸钠：本品宜单独使用，勿溶入其他药物，尤其忌与在pH3.5-5.8之间不溶解的药物共用，也不能与含大量钙盐的碱性溶液共用； 15. 膦甲酸钠注射液：本品不能与其他药物混合静脉滴注，本品仅能使用5％葡萄糖或生理盐水稀释； 16. 唑来膦酸注射液：本品不能与任何其他药物混合或静脉给药，必须通过单独的输液管按照恒量恒速输注； 17. 伊班膦酸注射液：为避免配伍禁忌，本品只允许与等渗氯化钠或5%葡萄糖液混合，不能与含钙溶液混合静脉输注； 18. 蔗糖铁注射液：本品不能与其它的治疗药品混合使用； 19. 注射用胸腺五肽：溶于250ml0.9%氯化钠注射液静脉慢速单独滴注； 20. 注射用胸腺肽：本品不宜与其它药物混合在同一管道内注射； 21. 注射用胸腺法新：本品不得与任何药物混合注射； 22. 鹿瓜多肽注射液：静脉滴注给药时，本品宜单独使用，不宜与其他药物同时滴注； 23. 注射用白眉蛇毒凝血酶：目前尚无与其他药物相互作用的报道，但为防止药效降低，不宜与其它药物混合静注；

突变体质粒构建—PCR法-2011

实验题目：突变体质粒构建——PCR 法 背景与原理： 蛋白与蛋白间，蛋白与核酸间相互作用是后基因组学研究重要内容之一，而体外突变技术则是研究这种复杂关系的一个有效手段。通过PCR 方法可向目的DNA 片段中引入任何所需的变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。PCR 定点突变迅速、高效并且重复性好，是基因研究工作中一种非常有用的手段。其基本原理可简述如下图： 本实验拟在某基因编码区（CDS ）内，通过PCR 定点突变引入一个EcoRI 酶切位点。该基因片段长724bp ，上下游分别以XhoI 和BamHI 两个酶切位点插入真核表达载体pcDNA3.1，即pcDNA3.1-CDS 。此基因内部含有一个EcoRI 酶切位点，我们通过PCR 法诱 产物I 产物II 第一轮PCR 第二轮PCR 退火 延伸 8个循环后加入 引物1/引物4

变又形成一个EcoRI酶切位点，可以通过EcoRI单酶切验证突变是否成功。具体设计如下： 仪器、试剂及药品配方： 1.仪器：PCR仪，电泳槽，水浴锅，凝胶成像仪，离心机，振荡培养箱，温箱，超净工作 台，冰箱 2.试剂及配方： 2.1试剂：DNA回收试剂盒，限制性内切酶（BamHI，EcoRI，XhoI），T4连接酶，DNA电 泳marker 2.2PCR反应体系： primex 12.5μl 模板1μl 上游引物（5μM）2μl 下游引物（5μM）2μl 水7.5μl 2.3primex配制： primex Taq酶0.125μl 10×Taq酶buffer 2.5μl dNTP（2.5μM）2μl 水7.875μl 2.4DNA电泳buffer（TAE）： 工作液（1×）储存液（50×） 40mM Tris-乙酸242g Tris/57.1ml冰乙酸

突变体鉴定

作物突变体的细胞学研究 一、突变体的初步观察和遗传分析 在某品系材料A中发现一株突变体，将其命名为M，优先将M自交，得到具有突变性状的纯系，如果为不育等特殊性状则可以采取不断回交的方式得到相应 纯系；再将M与A和另外一品系Y分别正交和反交，得到F 1世代；将得到的F 1 自交得到各个的F 2世代；将F 1 与M进行回交，分别得到对应的BC 1 世代；如果需 要，还可以继续回交得BC 2 等世代。 观察M的突变性状在自交过程中是否始终存在，则能初步判别此突变性状是否为可遗传性状； 分别统计M与A，M与Y的正反交的表型数据，分析所有正交与反交的差异，可以判别此性状是由核基因控制或者细胞质基因控制，甚至为核质互作控制； 结合M自交过程中的突变性状的遗传特性和所有F 1 突变性状，可判别突变性状为隐性或显性； 统计分析F 2和BC 1 世代的突变表型数据，可判别控制突变性状为质量性状或 者数量性状，以及质量性状中的的基因的对数。 在数据的分析过程中要充分应用生物统计的方法，如方差分析，Χ2检验等。 二、突变体的细胞学观察 核型分析原理与步骤 核型分析是指在一个物种内，对其染色体数目。结构及其它特征进行描述性分析，从而对单一染色体进行初步分析的过程。在突变基因确定为核基因后，则可以进行核型分析。 不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。因此，染色体核型分析是植物遗传性研究的重要内容。 染色体核型分析主要包括染色体长度、染色体臂比、着丝点位置、次缢痕等。染色体的长度差异有两种，一种是不同种、属间染色体组间相对应的染色体的绝对长度差异，一种是同一套染色体组内不同染色体的相对长度差异。

注射用重组人尿激酶原

注射用重组人尿激酶原（普佑克）治疗急性心肌梗死IV期临床试验研究知情同意书 尊敬的患者： 您的医生已经确诊您有急性ST段抬高型心肌梗死。 我们邀请您参加一项上海天士力药业有限药业有限公司生产的注射用重组人尿激酶原（普诺克）的上市后开放性、多中心临床研究，以观察注射用重级人尿激酶原对急性ST段抬高型心肌梗死的疗效及其安全性，该项研究由天津医科大学第二医院牵头，全国范围近10家研究中心参与，共约有2000例成人受试者参与。本研究方案已经得到天津医科大学第二医院伦理委员会审核，同意进行临床研究。 在您决定是否参加这次研究之前，请尽可能仔细阅读以下内容，它可以帮助您好了解本次研究的意义、程序和期限，参加研究后可能给您带来的益处、风险和不适。如有问题或不明白的地方，您也可以和您的亲属、朋友一起讨论，或者请您的医生给予解释，确保您充分理解本研究并做出决定。 一、本次研究的背景 心肌梗死、脑栓塞及其它血栓性疾病是严重危害人类健康的常见疾病，我国每年至少有500——1000万人需要使用溶栓制剂进行治疗，目前临床常使用的溶栓药物如尿激酶、链激酶等出于溶栓效果不理想，安全性低，正逐渐被高效、特异、副作用小的新型溶栓剂所取代。上海天士力药业有限公司历经十年开发了国家一类溶栓新药“注射用重人尿激本酶原（普佑克）”，并于2011年获得国家食品药品监督管理局的批准上市，批准文号为：国药准字S2*******。 普佑克是特异性的纤溶酶原激活剂，主要作用于血栓部位的纤维蛋白，对梗死相关血管具有较高的临床开通率，目前该药批准用于急性ST段抬高型心肌梗死患者的治疗，Ⅰ期临床试验表明普佑克临床用量在85mg以下耐受性良好，均未见不良反应。Ⅱ期临床试验共纳入222例患者，结果显示受试者均无明显的或特殊的不良反应发生，50mg人剂量组的冠脉造影开通率（TIMI2+3级）为78.26%，其中TIMI3级开通率为60.87%。 Ⅲ期临床试验共入组有效病例328，结果显示50mg剂量组冠状动脉造影开通率（TIMI2+3级）为78.50%，其中TIMI3级开通率为60.75%，显著高于对照尿激酶相应的冠状造影开通率（TIMI2+3级为51.6%，TIMI3级为36.8%）；而且普佑克组发生脑出血和死亡等严重不良事件的绝对值及发生率都少于对照组尿激酶。 通过上市前临床研究结果表明，普佑克是一种溶栓效果良好、安全性较高的新一代治疗急性心肌梗死的药物，但需要告知的是据目前溶栓药物的临床使用经验来看，任何一种溶栓药物的临床使用经验来看，任何一种溶栓药物都不是100%能溶栓成功的。 本次研究的目的是扩大用药人群，进一步评价普佑克在较大范围人群使用时对急性心肌梗死患者的有效性和安全性，用于指导临床医生的合理用药。 二、哪些患者不宜参加此项研究 （1）目前下使用抗凝剂： （2）一个月内有出血、外伤，和内脏手术史（包括活体组织检查）：或明确目前有活动性消化道溃疡病： （3）有创伤性心肺复苏术（创伤CP R≥10分钟）、2周内进行过不能实施压迫的血管穿刺以及外伤史者： （4）高血压病患者经积极降压治疗后，血压≥180/110mmHg者（收缩压、舒张压其中任一项达到此血压标准； （5）怀疑有主动脉夹层动脉瘤、感染性心内膜炎同，不能排除前述诊断者。

植物突变体库的构建及突变体检测研究进展_郭建秋

收稿日期:2009-12-11 基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2009CB118400) 作者简介:郭建秋(1972-),男,河南新安人,助理研究员,主要从事大豆品质改良利用研究。 E-ma il:guojianqiu.2008@https://www.wendangku.net/doc/ab401497.html, 植物突变体库的构建及突变体检测研究进展 郭建秋,雷全奎,杨小兰,马 雯,张向召 (洛阳市农业科学研究院,河南洛阳471022) 摘要:突变体是研究基因功能的重要材料,为此,介绍了创造突变体的方法,特别是理化诱变方法以及突变体的检测方法等方面的研究进展。关键词:植物突变体;构建;检测方法 中图分类号:Q319 文献标识码:A 文章编号:1004-3268(2010)06-0150-06 随着大量基因序列和EST 资料的积累,后基因组时代诞生了。功能基因组学是后基因组时代的重点研究内容,主要研究生物有机体内各种基因的生物学功能,进而了解所有基因如何协调发挥作用,完成一系列的生长发育过程。要精确了解每个基因的功能及基因间的相互作用,必须分析单个基因和多个基因的突变表型以及它们的时空表达剖面。随着新技术新方法的不断创新开发,分析鉴定基因功能的方法越来越多,并逐渐形成功能基因组学的分支学科。目前已经发展了多种分析鉴定基因功能的方法,其中最直接最有效的方法是构建饱和的基因突变体库,通过突变体分析鉴定基因功能。因此,突变体库的构建是功能基因组学的基础。为此,综述了创造突变体的方法以及突变体的检测筛选方法等方面的研究进展。1 创造突变体的方法 突变体库有不同的分类方法[1] 。按照产生突变体的方法大致可分为自发突变体库、体细胞无性系变异突变体库、理化诱变突变体库和插入突变体库4类。1.1 自发突变 自发突变是指自然条件下发生的突变,是生物变异的重要来源,是自然进化的基础。自发突变为人类提供了极有价值的研究材料。李玮等[2] 在芥菜型油菜品系L638-g 中发现了几株无致死效应的天然叶片黄化突变体,并研究揭示了该突变体的黄化机理及生物学特性。在水稻中,矮秆突变株的发 现揭开了矮化育种的序幕;细胞质雄性不育株的发现使水稻三系法杂种优势的利用成为现实;而光(温)敏核不育株的发现则为采用两系法利用水稻亚种间的杂种优势铺平了道路。但是自发突变的频率很低,在高等生物中,大约10万个到1亿个生殖细胞中才会有1个生殖细胞发生突变,且许多突变通过表型无法鉴定而丢失,很难进行系统收集。即使获得了感兴趣的突变株,要分离突变基因并进一步鉴定其功能也是相当困难的,因为自发突变体的遗传背景非常复杂。 1.2 体细胞无性系变异 体细胞无性系变异是组织培养中的普遍现象,泛指在细胞、组织和器官培养过程中,培养细胞和再生植株中产生的遗传变异,又可细分为自发无性系变异和诱发无性系变异。体细胞无性系变异的产生没有种属特异性,出现的频率一般比较高[3,4]。其变异频率随培养时间的延长而提高,且结合化学诱变和利用选择压力进行细胞突变体筛选可实现一定程度的定向诱变[5-7]。植物通过体细胞无性系变异,可产生一系列有益的新性状,对植物品种改良和选育新品种具有重要意义。但近年来的遗传转化实践表明,经历组织培养和再生阶段后,常表现出一些非目的性状的变异,其原因属体细胞无性系变异还是外源基因的插入诱变,往往很难确定[8]。体细胞无性系变异已在农作物的育种中广泛应用,并已获得了抗逆、可遗传的新品系[5]。赵成章等[9,10]从水稻幼胚愈伤组织中,筛选出一些早熟、矮秆、千粒重高 的新品系。孙立华等[11] 获得了抗水稻白叶枯病的 150

体细胞无性系变异产生的来源和机理

从总体上讲，组织培养后植株变异的原因有三：一是由源植株中预先存在的变异的表达，二是组织培养过程中引起的可遗传的变异（DNA改变），三是由外遗传及生理作用引起。 （一）外植体中预先存在变异的表达 研究表明，某些体细胞无性系变异是由于外植体中细胞预先存在的变异的表达。一般说来，除非采用单细胞或原生质体，否则，对由不同类型细胞组成的多细胞外植体进行培养会导致再生植株表型的不一致性。预先存在变异包括内复制造成的细胞间染色体倍性差异，体细胞突变及DNA甲基化状态的变化等。由不定芽再生导致的嵌合体的分离（破坏、丢失或重排）是最明显的预先存在变异的表现。嵌合体一般可分为扇形嵌合体、部分周缘嵌合体和周缘嵌合体三种。前两种在常规繁殖中不稳定，而周缘嵌合体在常规繁殖中较为稳定，但即使是周缘嵌合体，利用组织培养进行快速繁殖或不定繁殖时，也会引起大部分嵌合体破坏（＞30%）。颜色、形态和生理习性嵌合体是可见的，而细胞嵌合体（染色体或染色体组不同的细胞）通常是难以直接观察到的，只对植株的营养价值、同工酶谱等表现有很小的影响。另一方面，由于病毒在植物体内不均匀分布，利用植物组织培养手段（分生组织培养、不定芽再生或原生质体培养等）可脱除植物病毒，从而也可引起性状的改变。 通常植物（指二倍体植物）的分生组织中都是二倍体细胞，所以采用顶端分生组织或幼嫩组织或器官作外植体进行启动培养，再生植株表型和倍性水平的稳定性远大于其他类型外植体培养获得的植株。 （二）培养中诱导产生的变异 培养中诱导产生的变异主要受培养类型（或植株再生方式）、外植体类型（或组织来源）、生长调节物质、培养物的年龄（或继代培养时间）、遗传组成（或基因型）等因素的影响。 1. 培养类型（或植株再生方式） 一般而言，一个已分化的细胞经历变化剧烈的脱分化和再分化很容易产生变异，因而愈伤组织培养常与体细胞无性系变异联系在一起；另一方面，愈伤组织通常从切口处产生，因而与活体中的伤口反应极为类似，容易激发转座子的活动，以及胁迫刺激诱导产生某种酶类或特异性附产物。因而商业微繁殖中尽量避免愈伤组织培养。体细胞无性系变异并不局限于愈伤组织培养，其它如直接不定芽发生和体细胞胚胎发生都可导致变异产生。 2. 外植体类型（或组织来源） 不同外植体类型产生的再生植株上的体细胞无性系变异频率和性质存在差异。一般而言，越衰老的、远离器官化分生组织生长程度高的或高度特化的组织进行培养，产生变异的机会越大，而幼龄的、预先存在分生组织或细胞的外植体（如顶芽、腋芽、分生组织）则很少发生，这是由于植物正常生长发育过程中常会伴随体细胞分化而使染色体组发生变化，如内多倍性、多线性、扩增或DNA序列的缩减等。但这并非绝对，例如从云杉胚性细胞系游离到的原生质体再生植株就没有产生变异。基于体细胞中染色体组变异程度，D’Amato（1985）将植物分为多体细胞（polysomatic）和非多体细胞（non-polysomatic）两种类型。在后一种植物类型中，已分化的体细胞与合子细胞的倍性水平一致，而前后一种植物类型则不同，会包含多倍性、甚至非整倍体细胞等。这种划分虽有理论上的意义，但在实际组织培养中很难区分，例如在Solanum brevidens组织培养中，从子叶再生的70%的植株为四倍体，而从叶片片段中再生的仅有20%为四倍体；而菊科植物花瓣再生的植株比花梗再生的植株更为多花，异常频率也更高；芳香的天竺葵植物从茎干再生植株的表型与对照无差异，而从根和叶柄再生的植株在形态上更易产生变异；马铃薯悬浮培养原生质体再生植株产生的变异要比叶肉原生质体再生植株产生的变异多。 3. 生长调节物质 生长调节物质的种类和浓度影响体细胞无性系变异的发生。生长调节物质可能起一种诱变剂的作用，但更多的证据表明其作用是通过细胞分裂、非器官化生长程度及特异细胞类型的优先增殖实现的。研究表明，生长调节物质可以影响DNA生物化学及有丝分裂器（纺缍丝）的功能，以及产生体外培养环境的选择压，并进一步引起有丝分裂异步。 组织培养中常用的几种调节物质都对DNA合成与多倍化有作用。2,4,5-T可在活体上诱导产生多倍体，2,4-D也可刺激DNA合成并引起内复制。内复制不稳定，容易发生核碎裂。2,4-D还可降低有丝分裂指数，并增加有丝分裂交

【WO2019205919A1】一种生物突变体库的构建方法【专利】

20 (51)国际专利分类号：(72)发明人：姜临建(JIANG,Linjian);中国山东 C12N15/82(2006.01)C12N15/85(2006.01)省青岛市黄岛区青龙河路53号，Shandong A01H5/00(2018.01)C12N15/00(2006.01)266000(CN)。 (21)国际申请号：PCT/CN2019/081654(81)指定国(除另有指明，要求每一种可提供的国家 (22)国际申请日：2019年4月8日(08.04.2019)保护)：AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG, BH，BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU， (25)申请语言：中文CZ,DE，DJ，DK，DM,DO,DZ，EC,EE,EG，ES，FI,GB， (26)公布语言：中文GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR，IS， JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC，LK，(30)优先权： LR，LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX, 201810400607.72018年4月28日(28.04.2018)CN MY,MZ,NA,NG，NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL，(71)申请人：青岛清原化合物有限公司(QING PT，QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL， DAO KINGAGROOT CHEMICAL COMPOUND CO.,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG，LTD.)［CN/CN］:中国山东省青岛市黄岛区青US,UZ,VC,VN,ZA，ZM,ZW。 龙河路53号，Shandong266000(CN)。(84)指定国(除另有指明，要求每一种可提供的地区 保护)：ARIPO(BW，GH，GM，KE，LR，LS，MW,MZ， NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),欧业(AM, (54)Title：CONSTRUCTION METHOD FOR BIOLOGICAL MUTANT LIBRARY (54)发明名称：一种生物突变体库的构建方法 (57)Abstract:Disclosed in the present invention is a construction method for a biological mutant library.The construction method for a biological mutant library disclosed in the present invention comprises:1)introducing a DNA segment to a target organism to obtain a genetically modified organism,the DNA segment being capable of expressing elements required by implementation of site-directed mutation of target DNA in the genetically modified organism;and2)culturing the genetically modified organism to obtain a biological mutant library,the organism being a sexual reproductive organism,and the genetically modified organismbeing capable of site-directed mutation of target DNA in a germ cell.According to the mutant library obtained by using the present method,organisms having the characteristics of anti-biotic stress,anti-abiotic stress,high yield,good quality characteristics,high secondary metabolite yield,etc.can be obtained by screening.Therefore,the present method has a great application prospect. ［见续页］

拟南芥突变体购买流程-完全图解

Step 1. 打开NCBI主页： 打开的页面如下： 如下 得到如下页面： 进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图：

记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找 APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：点击 T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：

显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：

我们主要是从 ABRC 订购，点击进入页面，填写要求的相关信息，万事大吉。祝实验顺利！

水稻TOS17突变体库的创建与应用

1文献综述 1.1水稻基因组学研究现状 1.1.2 水稻全基因组测序 水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮食作物之一，全世界有一半的人口食用它，水稻年总产量占世界粮食作物产量第三位，维持较多人口的生活。亚洲是世界水稻主产区，近年稻米产量占世界的90%以上，中国稻米年产量占亚洲的38%。大米作为我国主要粮食种类，在养活我国13亿人口和改善我国居民营养结构中具有举足轻重的影响。同时，水稻又以其基因组相对较小(～430Mbp)，高效的遗传转化体系，与玉米、大麦和小麦等其它禾本科作物在基因组上存在明显的共线性，而成为研究单子叶植物的模式植物。 国际水稻基因组计划(IRGSP)启动于1998年，以粳稻品种(japonica)日本晴(Nipponbare)为模式材料，由中国、日本、美国等是十个国家参与，所采用的方法为逐步克隆策略(clone by clone sequencing)，随后在2002年由日本和中国科学家率先公布了第1、4染色体的精确序列(Feng et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Consortium 2003)；2003年9月第10条染色体的全长序列由美国Clemson大学公布(Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium, 2003)。2005年8月水稻全基因组精确序列在Nature发表(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。IRGSP公布的水稻“日本晴”精确序列经过分析表明：(1) 水稻“日本晴”基因组大小为389Mb，IRGSP公布的序列能够覆盖其全基因组的95%，并包含了所有的常染色质和两个完整的着丝粒；(2) 整个基因组中包含大约37544个非转座相关基因，其中71%的基因可能在拟南芥中有同源基因；(3)通过与拟南芥基因组序列对比分析发现，拟南芥90%的基因在水稻中可能存在同源物；(4) 水稻中预测的37544个基因中，29%是属于成簇的基因家族；(5) 水稻基因组中转座元件的数目和种类与玉米和高粱基因组共线性区段的扩张是一致的；(6) 有证据证明基因能从细胞器中转移到细胞核(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。 另外的一些科学研究部门和公司也分别启动了各自的水稻测序计划。如华大基因在2005年宣布完成籼稻品种“93-11”的全基因组序列测序，其所采用的方法为鸟枪法。Syngenta公司也于2002年宣布完成了粳稻品种“日本晴”的全基

基因变异的研究方法与进展

基因变异广义上说就是指基因结构变化从而产生了可遗传的变异。也就是说DNA水平上的突变造成的基因改变。而这一突变过程可能有很多原因，有自发性的，比如DNA配对过程中的装配错误，也有外源性的诱导因素，如物理，化学，生物因素等造成染色体结构改变或者基因结构的直接变化。 突变的形式多种多样，常见的有：点突变，即一个或多个核苷酸发生了改变；框内突变指的是3个或是的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加1个或几个氨基酸；除此之外，还存在着DNA大片段的缺失，通常是指几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。 这其中，最常见的莫过于点突变，他是指一个或者几个核苷酸的缺失或改变，通常会形成三种类型，第一种是同义突变，即碱基替换后，虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码的兼并性），亦称静止突变，第二种是错义突变，指的是碱基替换，密码子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基酸，第三种是无义突变，即碱基替换后，使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。 基于上述的变化，常见的基因变异研究方法有如下几种 一、筛选性方法 有人将这类方法分为2类，根据电泳性质不同及其他包括化学修饰法等 1 RNase 法 该法是一种最早提出的检测DNA突变的方法口。其原理是RNase可以识别RNA：DNA或RNA：RNA杂交链中错误配对的碱基并将其切断。经聚丙烯酰胺凝胶电泳将正常链及被切断的含有突变点的链区分开来。杂交方法是将同位素或其它方法标记的正常野生型RNA 片段与相对应的待测DNA 片段混合，90"C

左右变性并在室温下复性形成杂交分子。当待测DNA 片段中存在碱基突变时，在该位点上二条链不能正常配对，便成为RNase的识别和切割位点 2 DGGE、CDGE、TGGE、TSGE法 梯度变性凝胶电泳（DGGE）原理是当双链DNA在梯度变性的聚丙烯酰胺凝胶中行进到与DNA变性温度(熔点温度)一致的凝胶变性浓度位臵时，DNA 发生解旋变性此时电泳速度迅速降低。而当解旋的DNA链中有一个碱基突变时，将会影响其电泳速度变化的程度，从而将正常与突变的DNA区别开。 CDGE(constant denatural gel electrophoresis)法通过预实验或理论计算预先精确确定待测DNA片段的熔点温度后采用单一变性浓度凝胶电泳，简化了DGGE 法的操作 类似于CDGE法，TSGE (temperature sweep gel electropnoresis)法则取消了温度梯度而代之以单一温度 这类方法的优点是：(1)检出率高，～100 (2)可用于分析突变——正常DNA 混合样品；(3)可以回收分离出的DNA 片段；(4)可以直接测定未经扩增的DNA 。这类方法的缺点也很多，如(1)分析片段较小，<500 bp；(2)需要制备昂贵的GC clamp(3)需要事先经过复杂的计算机处理计算熔点温度或预试验确定变性条件； (4)位于高度富含GC的片段中的突变可能漏检。鉴于以上不利因素，DGGE等一类方法有逐渐被SSCP(单链构象多态性)法取代的倾向。尽管如此，这类方法一经建立，应用十分方便，适于大规模样品分析 3 SSCP法 单链构象多态性(single strand conlotraation polymorphism，)是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA或RNA分子依其碱基序列不同而形成不同构象，

2019年成功医保谈判药品及价格

附件2： 协议期内谈判药品部分 （一）西药 药品分类代码药品分类 编 号 药品名称剂型医保支付标准备注协议有效期 XA消化道和代谢方面的药物 XA02治疗胃酸相关类疾病的药物 XA02B治疗消化性溃疡病和胃食道反流病的药物XA02BC质子泵抑制剂 乙1艾普拉唑注射剂156元（10mg/支）限有说明书标明的疾病诊断且有禁食医嘱或吞 咽困难的患者。 2020年1月1日 至 2021年12月31 日 XA05胆和肝治疗药 XA05B肝脏治疗药，抗脂肪肝药 甘草酸单铵半胱氨 酸氯化钠 40元(100ml/瓶)； 81.16元(250ml/瓶) 限肝功能衰竭或无法使用甘草酸口服制剂的患 者。 乙2 注射剂 乙3精氨酸谷氨酸注射剂54元(200ml:20g/瓶)限肝性脑病。2020年1月1日至 2021年12月31日 2020年1月1日至 2021年12月31日 XA10糖尿病用药 XA10B降血糖药物，不含胰岛素XA10BFα-葡萄糖苷酶抑制剂 乙4阿卡波糖咀嚼片*2020年1月1日至 2021年12月31日 XA10BJ胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物 乙5艾塞那肽注射剂*限二甲双胍等口服降糖药或胰岛素控制效果不 佳的BMI≥25的患者，首次处方时需由二级及 以 上医疗机构专科医师开具处方。 2020年1月1日 至 2021年12月31 日

乙6利拉鲁肽注射剂*限二甲双胍等口服降糖药或胰岛素控制效果不 佳的BMI≥25的患者，首次处方时需由二级及 以 上医疗机构专科医师开具处方。 2020年1月1日 至 2021年12月31 日

药品分类代码药品分类 编 号 药品名称剂型医保支付标准备注协议有效期乙7利司那肽注射剂* 限二甲双胍等口服降糖药或胰岛素控制效果不 佳的BMI≥25的患者，首次处方时需由二级及 以 上医疗机构专科医师开具处方。 2020年1月1日 至 2021年12月31 日 XA10BK钠葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT-2)抑制剂 乙8达格列净口服常释剂型2.56元（5mg/片）； 4.36元(10mg/片) 限二线用药。 2020年1月1日 至 2021年12月31 日 乙9恩格列净口服常释剂型*限二线用药。乙10卡格列净口服常释剂型*限二线用药。2020年1月1日至 2021年12月31日 2020年1月1日至 2021年12月31日 XA16其他消化道及代谢用药 乙11麦格司他口服常释剂型*限C型尼曼匹克病患者。2020年1月1日至 2021年12月31日 XB血液和造血器官药 XB01抗血栓形成药 XB01A抗血栓形成药 XB01AC血小板凝聚抑制剂，肝素除外 乙12司来帕格口服常释剂型*限WHO功能分级II级-III级的肺动脉高压 （WHO 第1组）的患者。2020年1月1日至 2021年12月31日 XB01AD酶类 重组人组织型纤溶 酶原激酶衍生物 1399元 乙13 注射剂 限急性心肌梗死发病12小时内使用。 （18mg/10ml/支） 乙14重组人尿激酶原注射剂508元（5mg/支）限急性心肌梗死发病12小时内使用。2020年1月1日至 2021年12月31日 2020年1月1日至 2021年12月31日 XB02抗出血药