大肠杆菌

大肠杆菌（Escherichia coil）是我们了解得最清楚的原核生物，它为分子生物学的发展做出了巨大的贡献。本文简要介绍大肠杆菌的细胞壁、细胞膜、细胞核、质粒、核糖体、鞭毛等结构与功能以及大肠杆菌的产能方式和生化反应。

大肠杆菌（Escherichia coli）在自然界分布很广，是人和动物肠道中的正常菌群。正常情况下一般不致病，但它是条件致病菌。大肠杆菌是单细胞原核生物，具有原核生物的主要特征：细胞核为拟核，无核膜，细胞质中缺乏象高等动植物细胞中的线粒体、叶绿体等具膜结构的细胞器，核糖体为70S，以二分分裂繁殖。大肠杆菌为革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌。其大小为：0.5～0.8μm×1.0～3.0μm。周身鞭毛，能运动，具致育因子的菌株还具性菌毛。

1．形态结构

1.1 细胞壁位于大肠杆菌的最外层，厚约11um，分为两层，即外膜和肽聚糖层。外膜是大肠杆菌细胞壁的主要成分，占细胞壁于重的80％，厚约8nm，位于肽聚糖层的外侧，主要由磷脂、蛋白质和脂多糖组成。脂多糖是革兰氏阴性细菌的内毒素，也是革兰氏阴性细菌细胞壁的特有成分，主要和其抗原性、致病性及对噬菌体的敏感性有关。肽聚糖层由1～2层网状的肽聚糖组成，占细胞壁干重的10％，厚约2～3nm，是细菌等原核生物所特有的成分。大肠杆菌的肽聚糖由聚糖链、短肽和肽桥三部分组成。聚糖链由N-乙酸葡糖胺和N-乙酚胞壁酸分子通过β-1，4糖苷键连接而成，短肽由L-丙氨酸→D-谷氨酸→内消旋二氨基庚二酸→D-丙氨酸组成，并由L-丙氨酸与胞壁酸相连。一条聚糖链短肽的D-丙氨酸与另一条聚糖链短肽的内消旋二氨基庚二酸直接形成肽键（肽桥），从而使肽聚糖形成网状的整体结构。由脂蛋白将外膜和肽聚糖层连接起来，从而使大肠杆菌的细胞壁形成一个整体结构。

1.2 细胞膜大肠杆菌细胞膜的结构和其它生物细胞膜的结构相似。但其细胞膜中蛋白质的含量高且种类多。其细胞膜具选择透性，从而可控制营养物质进出细胞。大肠杆菌细胞的生物活性非常活跃，含有丰富的酶系。如各种脱氢酶系，氧化磷酸化酶系，电子传递系统，透性酶等。因此细胞膜是原核生物能量转化的场所，并能通过它对外界环境的各种刺激作出反应，并可传递信息，参与细胞壁的合成等。

1.3 细胞质细胞质是细菌的内环境，是蛋白质、各种酶类和核酸生物合成的场所，也是吸收营养物质后进行物质合成和分解代谢的场所。大肠杆菌的细胞质中含有糖原颗粒、核糖体和质粒等结构。

l.3.1 核糖体核糖体是细胞质中一种核糖核蛋白颗粒，是蛋白质合成的场所。大肠杆菌的核糖体呈椭圆球形，体积为13.5nm×20nm×40um。由65％的核糖核酸和35％的蛋白质组成。大肠杆菌的核糖体分散在细胞质中，完整核糖体的沉降系数为70S，由30S和50S两个大小不同的亚基组成。

l.3.2 质粒在大肠杆菌中，除遗传物质的主要载体染色体之外，还有一种闭合环状的双链DNA遗传因子，即质粒。质粒具有自我复制的特性，不同质粒的基因及质粒和染色体基因均可发生基因重组，质粒可通过细菌的接合而转移，也可随细胞的分裂而传递或丢失。由于质粒具有这些特性，所以在分子生物学和遗传工程中质粒经常作为外源基因的载体。大肠杆菌中已发现的质粒有F因子、R因子和Col因子等。

F 因子

又称致育因子，是最早发现的质粒。分子量63×106D，94.5Kb，约为大肠杆菌染色体的2％。F因子的基因含有3个主要基因群，分别负责插入、复制和转移的功能。含有F因子的大肠杆菌为雄性，用F+表示，不含F因子的大肠杆菌称为雌性，用F-表示。通过F+和F-细菌的接合F因子可经性菌毛传递给F-菌株，使F-菌株转变为F+菌株。F因子可单独存在，也可以通过同源重组整合到细菌的染色体上。

R 因子

最早于50年代由痢疾志贺氏菌中发现，后来发现大肠杆菌也含有这种质粒。R因子常由相连的两个DNA区段组成。一个为抗性转移因子，它含有调节DNA复制和拷贝数的基因。转移基因及四环素抗性基因。另一个为抗性决定因子，其上含有青霉系、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素和磺胺等抗性基因。

Col 因子

即产大肠杆菌素因子。它编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素的化学成分为脂多糖蛋白质复合物，它能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢而专一性地杀死不含Col 因子的其它肠道细菌。

1.4 拟核大肠杆菌的细胞核无核膜和核仁，没有固定的形态，结构简单，称为拟核，也称细菌染色体。拟核具有高度紧密的结构，由RNA、蛋白质和超螺旋环状DNA组成。大肠杆菌的全部基因都包含在这条DNA上。环状DNA的总长度可达1300μm，分子量为

2.8×109D，大约含有3000～4000个基因，目前已经确定了1400多个基因的结构、功能及在基因图上的位置。通过研究大肠杆菌基因的结构、功能及表达调控可揭示其它生物的遗传现象和规律。

1.5 特殊结构

1.5.l 荚膜荚膜是某些细菌向细胞壁外分泌的并位于细胞壁外侧的一层厚度不定的胶状物质。大肠杆菌的荚菌的荚膜主要由多糖组成，具有抗原性，构成了大肠杆菌的表面抗原，即K抗原。

1.5.2 鞭毛鞭毛是某些细菌长在细胞表面的长丝状、波曲状的附属物。其数目为一至数根，长为菌体的苦干倍，最长可达70μm，直径一般为10～20nm。鞭毛由鞭毛蛋白组成，构成了细菌的鞭毛抗原。大肠杆菌为周身鞭毛，和其运动有关。若将大肠杆菌穿刺接种于半固体培养基，它将沿穿刺线向周围扩散生长。大肠杆菌的细胞表面还含有一种比鞭毛更细、较短且直硬的丝状体叫菌毛，可分为普通菌毛和性菌毛。普通菌毛主要用于吸附于动植物、真菌以及各种细胞的表面，有的是噬菌体吸附的位点。性菌毛是在F因子的控制下形成的，它是细菌接合的“工具”。通过性菌毛的接合，可在细菌之间传递质粒或染色体基因等。

2．生理生化

2.1 产能代谢大肠杆菌为兼性厌氧菌，其营养类型为化能异养。呼吸类型为：在有氧条件下进行有氧呼吸产能，在无氧条件下进行无氧呼吸和发酵产能。

2.1.1 有氧呼吸有氧呼吸是指以分子氧作为最终电子受体的生物氧化过程。大肠杆菌可以利用葡萄糖等作为碳源和能源。葡萄糖经EMP途径分解为丙酮酸，丙酮酸再经TCA循环彻底氧化为CO2和H2O，并从中获得大量能量。在此过程中，底物氧化释放的电子通过电子传递链最后交给氧。电子传递链又称呼吸链，其功能之一是传递电子，功能之二是将电子传递过程中释放的能量合成ATP，即电子传递磷酸化作用。大肠杆菌呼吸链的组分与线粒体呼吸链的组分有所不同，但详细组分还不是十分清楚。大肠杆菌的呼吸链上有两个部位释放质子（线粒体呼吸链上有3个部位释放质子）。因此大肠杆菌呼吸链的P：O比为2，即一对电子经呼吸链的电子传递可得到两个分子的ATP。

2.1.2 无氧呼吸在无氧条件下，底物脱下的氢经部分呼吸链传递，最后交给氧化态的无机物（个别为有机氧化物）的呼吸类型。大肠杆菌含有硝酸盐还原酶，在无氧条件下以硝酸盐作为最终电子受体而将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

2.1.3 发酵发酵是厌氧或兼性厌氧微生物获取能量的一种方式。在此过程中，有机质氧化释放的电子不经电子传递链而是直接交给另一内源性有机物。基质在发酵过程中氧比不彻底，发酵的结果仍积累某些有机物。大肠杆菌在无氧条件下进行混合酸发酵，通过发酵将葡萄糖转变成琥珀酸、乳酸、甲酸、乙醇、乙酸、H2和CO2等多种产物。大肠杆菌将丙酮酸分解成乙酰辅酶A与甲酸。甲酸在酸性条件下（pH6.2以下）经甲酸氢酶进一步分解为CO2和H2，因此大肠杆菌发酵葡萄糖既产酸又产气。

2.2 生化反应由于上述大肠杆菌进行混合酸发酵产生较多有机酸，使发酵液pH下降到4.2以下，加入甲基红指示剂呈红色。故大肠杆菌甲基红反应阳性。产气气杆菌发酵葡萄糖形成的丙酮酸经缩合脱羧转变为乙酰甲基甲醇，进一步还原为2.3-丁二醇。乙酸甲基甲醇在碱性条件下氧化生成二乙酸，二乙酸与精氨酸中的胍基起反应生成红色化合物，此反应为V．P．反应。产气气杆菌发酵葡萄糖的V．P，反应阳性。由于大肠杆菌发酵葡萄糖不产生2.3-丁二醇，故大肠杆菌V．P．反应阴性。V．P．试验、甲基红试验对大肠杆菌的检测具有重要意义。大肠杆菌还具有氧化酶阴性、不液化明胶、产生吲哚、不利用柠檬酸盐以及在三糖铁琼脂培养基中不产生H2S等生化反应特性。

早期分子生物学的研究主要以大肠杆菌为实验材料，通过研究大肠杆菌，揭示了许多生命的现象和规律。1953年，沃森和克里克提出DNA的双螺旋结构模型并设想DNA以半保留方式进行复制。1958年梅塞尔森和斯塔尔以大肠杆菌为材料，用实验证明了DNA半保留复制的有效性。1969年凯恩斯用放射自显影技术证明了大肠杆菌环状DNA的半保留复制。1968年冈崎发现了冈崎片段。至20世纪70年代，大肠杆菌的复制过程已相当清楚，从而为分子生物学的发展以及对细胞分裂的认识奠定了理论基础。

1．大肠杆菌的分裂繁殖

1.1 染色体复制与分裂的关系大肠杆菌以分裂的方式进行繁殖。它的分裂是从染色体的复制开始的。为了使遗传物质能均等地传给两个子代，染色体的复制必须与细胞的分裂保持一致。染色体复制不完成，细胞就不能分裂；复制一旦完成，即开始分裂。大肠杆菌DNA 复制从起始到完成需40min。在染色体复制完成约20min后，细菌进行分裂。在生长缓慢时，每一个大肠杆菌内只有一条染色体，染色体复制完成后细胞进行分裂，然后才开始下一次复制。在快速生长时，染色体一次复制尚未结束，在尚不分开的染色体上又开始了新的复制，

导致染色体复制的时间大为缩短，细胞分裂的代时（细菌繁殖一代所需时间）大为缩短。由此可知：抑制DNA的复制，即可抑制细胞的分裂。如用丝裂霉素C处理对数生长期的大肠杆菌，由于抑制了DNA的合成，虽然细菌能继续生长，但却不能分裂。

1.2 分裂过程接种到新鲜培养基中的大肠杆菌细胞，从周围环境中选择性地吸收营养物质。在细胞内合成所需的RNA、DNA、蛋白质及酶等大分子物质，细胞体积不断增大，随后开始分裂过程。首先是拟核开始分裂，同时细胞中央的细胞膜也开始对称地向中心凹陷生长，使拟核均等地分配到凹陷两侧。随着细胞膜的向内凹陷，母细胞的肽聚糖层也跟着由四周向中心生长，把细胞膜分为两层，每层分别成为子细胞的细胞膜。肽聚糖层也分为两层，直至中央会合，形成由细胞质膜和肽聚糖组成的隔膜。隔膜完全形成后，两个子细胞分开，完成了一次细胞分裂。

2．大肠杆菌DNA的复制方式

遗传信息通过实代DNA分子的复制，从亲代传递给子代，从而保证了遗传的稳定性。因此DNA的复制对生物的遗传具有重要的意义。

2.1 双链DNA的半保留复制在复制时DNA双链分开，作为合成子链的模板。复制后双链DNA分子中的一条链为亲代的DNA，而另一条链则为新合成的DNA。这种方式的复制称为半保留复制。半保留复制首先是在大肠杆菌中得到证明的。1958年梅塞尔森和斯塔尔首先将大肠杆菌在重同位素15N的培养基上培养十几个小时，以保证全部DNA都被15N所标记，然后再将大肠杆菌转入14N培养液，间隔一定时间取样，提取菌体DNA并经氯化铯密度梯度离心，进行紫外线吸收光谱分析。从不同代期的光谱分析中可以看出：在代期为0时（亲代DNA）为由15N构成的重密度带。复制一代以后为14N15N组成的中间密度带。没有得到15N构成的重密度带，这表明在复制过程中亲代DNA不能作为完整的单位保留下来；亦未得到14N轻密度带，表明子代DNA分子不能重新合成。复制两代以后出现两条带，一条为轻密度带14N，另一条为14N15N的中间密度带。随后，随着代期的延长，中间密度带被稀释，从而说明大肠杆菌DNA的复制为半保留复制。后来证明这是生物界DNA复制的普遍方式。

2.2 染色体环状复制大肠杆菌的染色体为双链环形DNA，总长度为4.6×106bp，DNA 总长度可达1 100～1 400μm。凯恩斯通过精辟的实验证明了大肠杆菌DNA是以环状方式复制的。首先将大肠杆菌生长在含[3H]胸腺嘧啶的培养基中，这样在放射性培养基上生长时所合成的全部DNA都是具放射性的。培养接近两代时，分离出菌体的完整DNA，可以从其放射自显影图上看到分枝的环状图式。后来在有些病毒中也发现了环状复制。因为复制环的图式象希腊字母θ，故称这种复制为θ复制。

2.3 DNA复制的酶学 DNA的复制过程十分复杂，是在多种酶的参与下完成的。

2.3.l 拓扑异构酶I 首先在大肠杆菌中发现，当其与DNA结合时，可形成稳定的复合物，在此复合物中，DNA的一条链断裂，然后再重新连接，从而改变DNA的连环数和超螺旋数。此过程不需要ATP。

2.3.2 旋转酶属II型拓扑异构酶。大肠杆菌的旋转酶由两个A亚基和两个B亚基组成。旋转酶可连续引入负超螺旋到同一个双链闭环DNA分子中，从而消除复制过程中所产生的正超螺旋。此酶的活性需要ATP。

2.3.3 解螺旋酶大肠杆菌的解螺旋酶是由rep基因编码的蛋白质或酶，称为Rep蛋白。ReP蛋白利用ATP水解的能量松开双螺旋。

2.3.4 DNA聚合酶 1956年科恩伯格等首先在大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶I，后来又相继发现了DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。

DNA聚合酶I 由1条多肽链组成，其活性主要有：5＇→3＇聚合酶活性，即使脱氧核糖核苷酸逐个加到3＇－OH末断的核苷酸链上，使DNA链沿5＇→3＇方向延长，其聚合活性只能在已有的核苷酸链上延长DNA而不能从无到有开始DNA链的合成；5＇→3＇核酸外切酶活性，此活性对DNA复制的忠实性极为重要，在极少情况下，聚合酶在3＇－OH末端加上1个与模板链上碱基不配对的碱基，此时聚合酶I即可发现并切除这个错配碱基，从而避免复制过程中的错误；5＇→3＇核酸外切酶活性，它只作用于双链DNA的碱基配对部分，从5＇末端水解下核苷酸，此活性在切除由紫外线照射而形成的胸腺嘧啶二聚体中起重要作用，在DNA复制中冈崎片段5＇端RNA引物的切除也靠此酶。

DNA聚合酶II 由1条多肽链组成，酶的活性低。其活性主要有：5＇→3＇聚合活性，3＇→5＇核酸外切酶活性和5＇→3＇核酸外切酶活性。

DNA聚合酶III 是由多个亚基组成的蛋白质，是大肠杆菌细胞内真正负责开始合成DNA 的酶。此酶活性极高。全酶由7种亚基组成，其中α亚基具有5＇→3＇聚合酶活性。α、ε、θ3种亚基组成全酶的核心酶，称为polIII。ε亚基具有校对功能。此酶也具有5＇→3＇外切核酸酶活性和3＇→5＇外切核酸酶活性。

2.3.5 DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶由1条多肽链组成。此酶能把3＇－OH和5＇－P 连接起来。但要求这两个基团都在相邻的脱氧核苷酸碱基配对的末端，它不能将两条游离的DNA分子连接起来。

2.4 大肠杆菌染色体DNA的复制大肠杆菌染色体DNA的复制是从染色体的一个特定位置，即复制起始区（oriC）开始的双向复制，在环状染色体的相对位置上的终止区（terC）终止。整个复制过程可划分为3个阶段：复制的发动，复制叉的延伸和复制的终止。首先是切口酶在复制起点将一股超螺旋的DNA切开，在解旋酶的作用下DNA双螺旋解旋形成一个复制泡，此时切口被封闭，复制泡的两边各形成一个复制叉。一个顺时针移动，另一个逆时针移动，在复制叉处开始DNA的复制。在RNA聚合酶的作用下先形成一段与模板互补的引物RNA，然后在DNA聚合酶的作用下根据碱基配对原则将脱氧核糖核苷酸添加到引物RNA的3＇端，使DNA由5＇→3＇复制，从而使新链不断延长。由于在一个复制叉上亲代DNA的两条链皆是新DNA合成的模板，两条链又是反向平行的，而DNA的合成只能从5＇向3＇方向进行，所以在一个复制叉上随着复制叉的向前延伸，一条链的复制是连续的称为前导链，另一条链的复制则是不连续的称后随链。后随链合成的DNA中大部分是以小段形式存在的称为冈崎片段。每个冈崎片段都由一个RNA引物引发。当复制叉延伸到复制终点时，由DNA聚合酶I 除去RNA引物并由DNA添补缺口，最后由DNA连接酶封闭切口，从而形成两个与原来完全一样的双链DNA环状分子。由于大肠杆菌染色体是环形的，所以两个复制叉汇合在起点对面距起点180°的终点。这样一个包括复制起点和终点的独立的复制单位叫复制子。大肠杆菌只有一个起点和一个终点，整个染色体为一个复制子。大肠杆菌染色体的复制速度很快，每分钟复制105核苷酸，完整染色体在40min内完成复制，从而为细胞的分裂做好了准备，保证

了遗传物质的稳定性和连续性。

大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系及介绍[1]

大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系及介绍 相互关系 大肠菌群（总大肠菌群） >粪大肠菌群&耐热大肠菌群> 大肠杆菌 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 二、总大肠菌群

所谓总大肠菌群系指一群在37℃培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 三、耐热大肠菌群与粪大肠菌群的比较 北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。一般欧洲学者认为，“粪大肠菌群”的提法不太科学，耐热大肠菌群的范围比粪大肠菌群范围大。 耐热大肠菌群的卫生学意义 作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。 作为粪便污染指标菌，耐热大肠菌群与大肠菌群、大肠杆菌相似，主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染。粪便是肠道排泄物，有健康者，也有肠道病患者或带菌者粪便，所以粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺式菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等）和食物中毒者。因此，食品既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。

大肠杆菌高细胞密度发酵

课程设计说明书 课程名称：发酵工程 设计题目：大肠杆菌的高细胞密度发酵 院系：生物与食品工程学院 学生姓名：郑帅超 学号：201106040030 专业班级：11 生物技术 指导教师：李安华 2014年5月26日

课程设计任务书 设计题目枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化 学生姓名郑帅超所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班11生物技术 设计要求： 1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。 2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。 3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、设计标准要求规范、实用、切合实际。 5、设计应严格按有关设计规范进行。 6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。 学生应完成的工作： 1、在老师的帮助下完成题目设计。 2、学生查阅相关文献、资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可行性。 3、学生在实验室完成实验方案。 4、完成课程设计说明书的初稿，由指导老师帮助修改，最后定稿。 参考文献阅读： [1]李寅等著，高细胞密度发酵技术，化学工业出版社，2006-10-01，177~288. [2]陈坚,李寅,毛英鹰,等. 生物工程学报,1998 ,14(4) :452～455. [3]李民,陈常庆,朴勤,等. 生物工程学报,1998 ,14(3) :270～275. [4]杨汝燕,李民,陈常庆. 工业微生物,1998 ,28(3) :30～33. [5 ]李民,陈常庆,朴勤等,生物工程学报,1998 ,14 (3) :270~275. [6]杨汝燕,李民,陈常庆,工业微生物,1999 ,29(1) :25～28. [7]徐皓,李民,阮长庚,等. 工业微生物,1998 ,28(2) :20～25. [8]刘社际,葛永红,杨立明. 中国生物制品学杂志,1999 ,12 (1) :29 ～31. 工作计划： 2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。 2013.5.12----2013.5.13 进行理论试讲阶段，确定实验路线，然后确定实验方案。 2013.5.14----2013.5.17 进行实验操作和书写设计说明书。 2013.5.18----2013.5.22 修改说明书，和指导老师沟通。 2013.5.23—2013.5.26 上交课程设计说明书，并由指导老师填写评语和成绩。 任务下达日期：2014年5月13日 任务完成日期：2014年5月26日 指导教师（签名）：学生（签名）：

大肠杆菌高活性氨基酸生物合成途经研究

研究目的： 汽油替代品：高能量密度、低吸湿性、辛烷值 传统生物燃料&高级醇；直链醇&支链醇 研究菌体：大肠杆菌 方法技术： 代谢工程：高活性氨基酸生物合成途经+埃利希途径（Ehrlich pathway） 葡萄糖→2-酮酸中间体→高级醇（异丁醇、1-丁醇、2 -甲基- 1-丁醇、3-甲基-1- 丁醇和2-苯乙醇） 实验部分： 一、异丁醇 前期实验： 1）2-酮酸是氨基酸生物合成途径的中间产物；通过2-酮基酸脱羧酶（KDC）转化为醛；通过醇脱氢酶（ADH）转化为醇类。通过实验，测定Kivd是所有测试酶中活性最高且最具有多样性的KDC，ADH选用乙醇脱氢酶2，二者均来自酵母菌。 2）不同种类的2-酮酸（表2）加入到表达Kivd的大肠杆菌培养菌中会将相应醇类的产量提

高2~23倍。特种2-酮酸的供应也明显地削减了其他醇类的产量。这些结果均表明增加特种2-酮酸的量可以提高醇类的产量和选择性。 大肠杆菌已有的代谢途径被转基因改造，增加特种2-酮酸的产量，可以生产出期望的醇类。 设计菌株： 1）为合成异丁醇，质粒内PLlacO1启动子控制的ilvIHCD基因被过度表达以增大2-酮异戊酸生物合成量。 2）强化ilv合成途径和乙醇合成途径（Kivd 和Adh2）。 菌株可产生出23 mM异丁醇，这约是普通菌株产量的五倍 3）进一步提高异丁醇的产量，需要删除控制合成副产物的基因，包括adhE，ldhA，frdAB，fnr 和pta。这些基因的删除可提高用于ilvIHCD合成途径的丙酮酸的量。 敲出基因后的菌株产生了30 mM异丁醇。 4）选用枯草芽孢杆菌的alsS基因取代大肠杆菌的ilvIH基因。相比于大肠杆菌更偏向酮丁酸的ilvIH基因，alsS基因对丙酮酸盐有更强的亲和力。 采用alsS途径的菌株可产生约50 mM的异丁醇。 5）为进一步增加丙酮酸盐的量，pflB基因被敲出。 在这些操作的综合作用下，可以在微好氧条件下使异丁醇的产量达到约300mM (22 g/l)。 实验结果： 通过此种方法由葡萄糖获得了高产量、高选择性的异丁醇 二、正丁醇 1）1-正丁醇的前提2-酮基戊酸乙酯不是大肠杆菌的代谢物。，作者尝试以与亮氨酸生物合成途径相似的方法，以一种分子比2-ketovalerate少一个甲基的更小的分子——2-酮丁酸为底物，合成2-ketovalerate。2-酮丁酸可以通过由ilvA基因编码的苏氨酸脱水酶作用苏氨酸生成。 2）为进一步提高1-丁醇的产量，编码二羟酸脱水酶的基因ilvD被敲除。二羟酸脱水酶能够同时产生2-酮基异戊酸（亮氨酸和缬氨酸的前体）和2-酮基3-甲基戊酸（异亮氨酸的前体）。此种操作有两个优点：首先，ilvD基因的敲除避免了leuABCD代谢途径的自然底物2-酮基异戊酸的生成，进而抑制了目的产物的竞争底物。其次，ilvD基因的敲除避免了Kivd的竞争底物2-酮酸-3-甲基-戊酸和2-酮酸-4-甲基戊酸的产生。故而ilvD基因的敲除进一步增加了1- 丁醇的产量。 三、提高耐受性 为了探索耐受性的可提高程度，我们对于正丁醇耐受性的菌株进行传代培养。我们发现，原生的大肠杆菌对于正丁醇的耐受性为1.5%。然而，菌株在正丁醇浓度不断增加的环境下进行传代培养五代之后，便会出现对正丁醇的耐受性达到2%的基因突变菌株（补充材料中的图4）。这种菌株的耐受性可达到与1-丁醇的原生生产者相当或甚至优于原生生产者。 证明大肠杆菌可以适应长链醇类的高浓度环境。之后还可以运用诸如全转录工程（gTME）等其他的方法进一步提高耐受性。

浅谈大肠杆菌的致病性与防治3

浅谈大肠杆菌的致病性与防治 解觉五支莫食企09级1班 20095090 摘要：大肠杆菌是人和动物肠道中最主要，数量最多的一种细菌，寄居于人和动物的消化道内，是人和动物消化道内占优势地位的需氧共生菌丛。本文主要综述了大肠杆菌的结构与分类，对人体的作用，致病性及其防治。介绍了大肠杆菌的致病机理，致病性与非致病性的区别，以及对致病性大肠杆菌的预防措施。致病性杆菌引起的病越来越多，严重威胁着人类的健康。 关键字：大肠杆菌致病性防治 大肠杆菌是大肠埃希氏菌的俗称,属肠杆菌科埃希氏菌属,1885年埃舍利希 氏首次发现。在相当长的时间内,人们一直把它当作正常肠道菌群的组成部分,认为是非致病菌。直到20世纪中叶,才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性,尤其对婴儿和幼禽,常引起严重腹泻和败血症[1]。大肠杆菌有致病性和非治病性之分。非致病性大肠杆菌是肠道正常菌丛，致病性大肠杆菌则能引起食物中毒。致病性大肠杆菌分为侵入型和毒素型两类。前者引起的腹泻与痢疾杆菌引起的痢疾相似，一般称为急性痢疾型；后者所引起的腹泻为胃肠炎型，一般称为急性胃肠炎型。毒素型大肠杆菌产生的肠毒素，可分为耐热毒素和不耐热毒素。前者加热至100℃经30分尚不破坏，后者加热60℃仅1分即被破坏【2】。土壤、水源收费便污染后，可带有致病性大肠杆菌，婴儿易被感染。带菌食品由于加热不彻底，或因生熟交叉污染和熟后污染，可引起食物中毒。近年来，由致病性大肠杆菌引起的病更是越来越普遍，对人类的健康产生了严重的威胁。 一、大肠杆菌的结构与分类 大肠杆菌一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌，属于原核微生物。大肠杆菌没有真正完整的细胞核，只有一个拟核而且拟核外没有核膜包围。具有主要由肽聚糖构成的细胞壁，细胞膜，细胞质，核糖体，荚膜，菌毛和鞭毛。

大肠杆菌实验

大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化 一、实验目的 1）掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2）学习和掌握质粒DNA的转化和筛选方法及操作步骤。 二、实验原理 本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温实现转化。由于所用pBS质粒带有长那霉素抗性基因。因此可以通过长那霉素抗性来筛选转化子。如果受体细胞没有转入pBS，则在含长那霉素的培养基上不能生长。能在长那霉素培养基上生长的受体细胞肯定已经导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳酶切等进一步鉴定。 三、仪器及试剂 仪器：恒温摇床、CO2细胞培养箱、台式高速冷冻离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、移液枪、Eppendrof管。 试剂：LB培养基(在950mL水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl、用1mol/L NaOH调制pH=7.2.加入至1L，121℃高压灭菌20min) 长那霉素储存液：100mg/mL 含长那霉素的LB固体培养基：(1L LB液体培养基中加入20g琼脂粉，将配好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却至60℃左右，加入长那霉素储存液，使其终浓度为50μg/mL。摇匀后铺板，每皿倒15mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净) 1mol/L CaCl2储存液质粒DNA10ng/Μl 四、实验步骤 1 感受态细胞的制备 1）从LB平板上挑选新活化的E.coli DH 5α单菌株，接种于3~5mL LB液体培养基中，37℃下震荡过夜培养，12h左右，直至对数生长后期。

2）将该菌悬浮液以1:50的比例接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h至OD600为0.5左右。 3）将5mL培养液转入4个1.5mL离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下，5000rpm离心5min。 4）弃去上清液，用预冷的1mL 0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15~20min后，40℃下5000rpm离心5min。 2 铺平板 将配好灭菌的LB固体培养基加热融化，待冷却至60℃左右后，加入长那霉素储存液，使其终温度为50μg/mL，摇匀后铺板，每皿倒约15mL。室温放置过夜至冷凝水挥发干净。 3 感受态细胞的转化 1）取100μl感受态细胞悬浮液，加入5μLpBS质粒DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30min。 2）42℃水浴热激70s，热激后迅速置于冰上冷却3~5min。 3）向管中加入400μl LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃震荡培养1h。使细菌恢复到正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 4）将上述菌液摇匀，取200μl涂布于含长那霉素的筛选平板上，正面放置0.5h。待菌液完全被吸收后倒置培养皿，37℃培养16~24h， 5）对照实验： 对照组1：以同体积的无菌二次水代替DNA溶液，其他操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2：以同体积的无菌二次水代替DNA溶液，取5μl菌液，稀释100万倍，涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 五、实验数据记录处理 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，各培养皿中的菌落数如下表所示：

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略 前言 重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究[1]。重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力[2,3]。通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白[4]。但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体[5]。蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步，但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体，严重影响了重组蛋白的生产应用[6,7]。 在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白。但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体[8]。在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性[9]，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。一般来讲，可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类。还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠[10]，构建融合蛋白[11]。另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达[8]或者低温诱导[12]。本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。 1.大肠杆菌表达系统的构建

1.1选择表达宿主菌 对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞表达或者周质空间表达。与周质空间表达相比，胞表达的表达量更高，因此应用更为广泛。在实验研究和实际生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株（表1[13]）。美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势。但是由B菌株演变而来的BL系列菌株与K12相比，突变了lon和ompT 两个基因[14]，因此具有许多表达优势：产物积累少，缺少蛋白酶，防止产物被降解。这些优势使得BL菌株也具有非常广泛的应用[15,16,17]。 通常来讲，针对不同的重组蛋白，宿主菌的选择也是不同的。如果重组蛋白含有大肠杆菌稀有密码子，就需要宿主能够表达针对这些密码子的tRNA，比如BL21 (DE3) CodonPlus-RIL，Rosetta(DE3)等菌株。如果重组蛋白具有许多二硫键，则需要宿主表达环境为氧化条件的。AD494宿主菌是硫氧还蛋白突变型，可以促进二硫键的折叠。Origami菌株为硫氧还蛋白突变和谷胱甘肽还原酶突变，进一步加强了二硫键在细胞的形成[18]。另外一方面，如果表达的重组蛋白对于宿主菌是有毒性的，则需要表达为包涵体的形式。 表1：常用于重组蛋白表达的宿主菌及其特点

大肠杆菌检测

大肠杆菌的检测：大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。1.2 冰箱:0～4℃。1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。1.4 天平。1.5 显微镜。1.6 均质器或乳钵。1.7 平皿:直径为90mm。1.8 试管。1.9 吸管。1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。1.13 酒精灯。1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置 36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 3.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养 18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。 3.4 证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 3.5 报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。

大肠杆菌生化实验

细菌常用生理生化反应实验结果观察 一结果观察 １葡萄糖发酵实验 直接观察试管, 试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌. 左边为恶臭假单胞菌，有气泡并变为黄色；右边为大肠杆菌, ２V. P. 反应和甲基红试验: 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌. VP，图为右边为大肠杆菌，溶液变红，为阳性菌。 ３吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.

左边为大肠杆菌，出现红色阳性菌；右边为产气杆菌，颜色不变，阴 性菌。 ４硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液，如过溶液变红说明有亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性菌，如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂，如果变蓝，说明此菌为阴性菌；如果不变色，说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌． 右下方恶臭假单胞菌，加入革里斯试剂A、B后不变色，再加入二苯 胺试剂后变蓝，为阴性菌；左上方大肠杆菌为红色。 ５柠檬酸盐实验 直接观察斜面，斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌，不变者为阴性菌．

左边产生蓝色，产气杆菌阳性；右边为大肠杆菌，阴性。 ６明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌． 左边为大肠杆菌，出现透明圈，阳性；右边为枯草杆菌，阴性菌。 7 淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌．

大肠杆菌

目录 ? 1 概述 ? 2 分类 ? 3 性状及特点 (1) 原核生物 (2) 形态与染色 (3) 培养特性 (4) 生化反应 (5) 抗原构造 (6) 抵抗力 (7) 异养厌氧型 (8) 人体与大肠杆菌的关系 (9) 鉴别 (10) 生态系统中的地位 ? 4 致病性 (1) 致病物质 (2) 病原体 (3) 潜伏期 (4) 所致疾病 ? 5 检查法 (1) 细菌的分离鉴定 (2)卫生细菌学检查 ? 6 治疗方法 ?7传播途径 ?8 预防方法

大肠杆菌简介 大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌，1885年由Escherich发现，分布在自然界，大多数是不致病的。主要附生在人或动物的肠道里，为正常菌群，少数的大肠杆菌具有毒性，可引起疾病。 婴儿出生后即随哺乳进入肠道，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。 在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。技术上，大肠菌群被定义为所有好氧或兼性好氧。 常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。侵入人体一些部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。 1. 大肠杆菌性状及特点 （1）原核生物 大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。 （2）单个菌体的形态与染色 大小0.4～0.7×1～3um，无芽胞，大多数菌株有动力。有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类包膜，革兰氏阴性杆菌。 （3）代谢类型 大肠杆菌的代谢类型是异养厌氧型。 （4）菌落特性 在血琼脂平板上，有些菌株产生β型溶血。在鉴别性或选择性培养基上形成有颜色、直径2～3mm的光滑型菌落。大部分菌株发酵乳糖产酸产气，并发酵葡萄糖、麦芽胞、甘露醇、木胶糖、阿拉伯胶等产酸产气。IMViC试验为“+、+、-、-”。即为典型大肠杆菌。培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。 （5）抗性 较复杂，有O、K、H、F四种抗原。O抗原为脂多糖，已有171种，其中162种与腹泻有关，是分群的基础。K抗原有103种，为荚脂多糖抗原。从病人新分离的大肠杆菌多有K抗原，有抗吞噬和补体杀菌作用。根据耐热性等不同，K抗原分为L、A、B三种，其中L、B不耐热，有60种。F抗原至少有5种，与大肠杆菌的粘附作用有关、表明大肠杆菌血清型的方式是按O：K：H排列，例如O111：K58（B4）：H2。

大肠杆菌

大肠杆菌的培养和分离 ——基础知识和操作过程梳理一、大肠杆菌 细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。 大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。 二、培养基配置 微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤： 1．称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。 2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3．调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。

大肠杆菌文献综述

文献综述 禽大肠杆菌病的研究进展 郑琳红 西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460 摘要：禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起各种禽类的一种急性或慢性传染病，主要侵害鸡、鸭、鹅，以及各类珍、特禽，临床上有多种表现形式，其中以急性败血型、卵黄性腹膜炎和生殖器官损害较常见，危害性也最为严重。本文主要在病原学、流行病学、临床症状、病理变化和诊断与防治等方面对禽大肠杆菌病进行了综述。 关键词：禽大肠杆菌；流行特点；疫病防治；研究进展 禽大肠杆菌病（colibacillosis）是由致病性大肠埃希氏菌( E. coli )引起禽类的一种急性、慢性传染病的总称。其病型和病变复杂多样。本菌抗原结构复杂，血清型多，变异菌株不断出现，分布极广，不同地区有不同血清型，同一地区不同养殖场甚至同一养殖场同一种群也可能有多个血清型。本病的普遍性，给养禽业造成严重威胁和重大经济损失[1,2]。 禽大肠杆菌病常继发于其他致病因子或与其他致病因子一同作用，使其表现得复杂多变，往往使真正的罪魁祸首得以掩盖。禽大肠杆菌病发病频繁，容易反复发作，加上用药较乱，病原菌血清型多、抗原结构复杂，极易产生耐药性，使其防不胜防。1976年Smits等发现新城疫疫苗、传染性支气管炎疫苗免疫，支原体感染与大肠杆菌感染之间的关系，气雾免疫法及支原体感染大幅提高大肠杆菌感染率[3]。 1．病原学 大肠杆菌是人和动物肠道中的常见菌，多为条件性致病菌，当机体健康，抵抗力强时，这些菌株不表现致病性，当机体健康状况下降，特别是在应激情况下，其致病性增强，引起发病。致病性大肠杆菌在自然界中广泛存在，凡有哺乳动物和禽类活动的环境空气、水源和土壤中均有本菌存在。当禽舍通风不良、饲养密度大、卫生条件差、饲料质量不好、禽舍污染严重时，该病传播途径可经过消化道、呼吸道、交配等途径水平传播，还可通过其它多种途径，使种蛋被污染而进行垂直传播[1]。 禽大肠杆菌病病原是革兰氏阴性、非抗酸性、染色均一，不形成芽孢，两端钝圆的短杆菌，需氧或兼性厌氧。有时大小和形态可能是多变的，许多菌株有运动性，有周身

大肠杆菌实验报告

大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选 0740063 阿噟兰 1.前言 抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。 在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。 紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。 因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。 2.材料和方法 实验材料、仪器和试剂 菌种：大肠杆菌 仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器 试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水 实验方法 2.2.1制备培养基 普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）： 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml 筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。（卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA，阻断细菌蛋白质的合成。） 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml），按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌，取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素加入培养基中，充分震荡混匀，倒平板，2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml 2.2.2制备菌悬液（106 ~ 108个/mL） ①固体培养：大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基，37℃培养24-48h。 ②菌悬液：用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小三角瓶（或试管）中，充分振荡使菌

大肠杆菌病的常用药物

- - . 禽大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌的某些致病性菌株引起的多种疾病总称，包括大肠杆菌性败血症、肠炎、脐带炎、肝周炎、心包炎、腹膜炎、全眼球炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、关节炎、肉芽肿等，并能导致胚胎和幼雏死亡。由于大肠杆菌血清型复杂，给免疫防治带来一定的困难，药物防治仍是控制禽大肠杆菌病的主要手段。yz.ag365yz.ag365 本文就防治禽大肠杆菌病的常用药物作一简述。- - 考试资料

- - . yz.ag365yz.ag365 一、β-内酰胺类抗生素yz.ag365yz.ag365 β-内酰胺类抗生素为化学结构中含有β-内酰胺环一类抗生素，主要包括青霉素类、头孢菌素类、β－内酰胺酶抑制剂。抗病作用机理均为抑制细胞壁的合成。yz.ag365yz.ag365 1、青霉素类。防治禽大肠杆菌病的青霉素类抗生素主- - 考试资料

- - . 要为半合成广谱抗生素氨苄西林、阿莫西林。氨苄西林、阿莫西林均耐酸、不耐酶，内服或肌注易吸收。阿莫西林耐酸较氨苄西林强，该药抗菌谱广，杀菌力强，作用迅速，阿莫西林的血清浓度比氨苄西林高1.5-3倍。阿莫西林对大肠杆菌有较强的抗菌作用，其体外抗菌谱等同于氨苄西林，但体内效果则增强2-3倍。yz.ag365yz.ag365 用法与用量：⑴氨苄西林：内服一次量为每千克体重10毫升或肌注为一次量每千克体重10毫升，1日2-3次。- - 考试资 料

- - . ⑵阿莫西林：内服一次量为每千克体重10-15毫升，1日2次。yz.ag365yz.ag365 2、头孢菌素类。为广谱半合成抗生素，具杀菌力强、抗菌谱广、毒性小、对酸和β-内酰胺酶比青霉素类稳定等优点，第三、四代头孢菌素对大肠杆菌具有较强的抗菌作用，因较贵而多用于宠物、种畜禽及贵重动物。临床上应用的有头孢噻呋、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢吡肟。yz.ag365yz.ag365 - - 考试资料

大肠杆菌

用大肠杆菌快速检测植物功能基因的研究 北京五中分校李思佳 指导教师韩竹戴毅新 【摘要】大肠杆菌是基因工程研究中最常用的原核表达宿主系统。大肠杆菌表达体系与植物表达体系相比具有培养条件简单，生长周期短，操作简便等优点。将植物基因分别转化大肠杆菌表达体系和植物表达体系，并在胁迫培养基中进行功能验证，分析结果表明大肠杆菌表达体系具有与植物表达体系相似的作用。 【关键词】大肠杆菌、基因分离鉴定、基因表达、功能验证、胁迫 【前言】 一、问题的提出 生物课上老师讲到细菌的用途和危害时，同学们自己归纳出了很多细菌的危害，如可以引发人和动物的肺炎、腹泻、败血症、霍乱和肺结核等疾病；植物的叶斑病和萎蔫等。细菌的益处是可以制酒、酱油、醋，还可以利用细菌发电。老师引导我们说：细菌（如大肠杆菌）还有很多用途，同学们课下可以查找一些资料，做一些实验探究。于是，我就查找了相关资料，了解到大肠杆菌是基因工程研究中最常用的原核表达宿主系统。国内有研究人员利用这个原核表达体系筛选出了植物的抗旱基因。那么这个体系除此之外还有哪些作用呢？这个体系与植物表达体系相比较具有哪些特点？带着这些疑问，在老师和家长的帮助鼓励下，我翻阅了相关书籍，从大肠杆菌的胁迫培养条件及体系开始进行了研究。 二、研究背景及目前国内外研究和应用现状 大肠杆菌属原核生物。细胞呈杆状，直径约1微米，长约2微米，两端钝圆，周身具鞭毛，可运动。革兰氏染色为阴性，不形成芽孢。在固体培养基生长的菌落为圆形，白色或黄白色，光滑而具闪光，低平或微凸起，边缘整齐。最适条件下培养20分钟可繁殖1代。大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人的大肠中并不致病，但偶尔侵入到阑尾、胆囊、腹腔或泌尿系统时，可发生炎症。在工业生产中，大肠杆菌可用以制备L-门冬酰胺酶，此酶是治疗白血病效果较好的一种药物。在水质监测方面，根据其有无及其数量多少，可作为检测水质状况和污染程度的重要指标。大肠杆菌是现代生物学中研究最多的一种细菌，作为一种模式生物，其基因组序列已全部测出。大肠杆菌是微生物遗传学研究的材料和基因工程中最常用的宿

大肠杆菌培养实验报告

大肠杆菌培养实验报告 篇一：大肠杆菌检测实验报告 国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数 实验目的 实验原理：国标法操作的原理 实验器材： 培养箱，10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，试管架，4个平皿，500ml大烧杯1个，电子天平，纱布，脱脂棉，灭菌锅，PH计或PH试纸，100ml量筒，橡皮手套，超净台 实验药品： 磷酸盐缓冲液，蒸馏水，LB培养基，琼脂，5%NaOH，5%HCl 实验步骤： 一： 10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，4个平皿，500ml大烧杯1个，100ml量筒进行洗涤，然后一起放入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min。灭完菌后烘干，完成后放入超净台中。 用酒精擦拭超净台，紫外消毒30min 二： 1：用电子天平称取成品LB 3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中。 2：用量筒量取125ml的蒸馏水

加入该锥形瓶中，制成培养基。 3：用棉花堵住该锥形瓶的瓶口，用牛皮纸包住瓶口，用橡皮筋扎牢，再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下灭菌20min。 4：灭完菌后放入超净台中备用。 三： 1：取1只无菌250ml锥形瓶，用量筒向其中加入49ml PBS 2：将1ml样品加入到该锥形瓶中，摇匀制成1:50的细菌溶液。 3：取4只试管，编号1—4 4：用无菌移液管分别向4只试管中加入9ml的PBS 5：用1ml无菌移液管从样品中移取1ml菌液加入到1中.震荡试管使菌液均匀。 6：用1ml无菌移液管从1号试管中移取1ml的细菌溶液加入2号试管中，摇匀 7：用另一只1ml无菌移液管从2号试管中移取１ｍｌ细菌溶液，加入3中，摇匀．．．．．．以此类推直至4只试管中均加入了细菌溶液。 9：取4只平皿，编号1—4 10：分别用4只无菌移液管从这4只试管中移取１ｍｌ的菌液置于4只平皿中，加入４５—５０摄氏度温度下的培养基，约１５ｍｍ厚度。缓慢旋转平皿使菌液与培养基混合均匀；待培养基冷凝后倒置。

大肠杆菌常见的类型你知道多少

大肠杆菌常见的类型你知道多少？ 1.大肠杆菌败血症6-10周龄的肉鸡多发，尤其在冬季发病率高，死淘率通常在5%-20%，严重的可达50%。雏鸡在夏季也较多发，病鸡精神不振，采食减少，衰弱和死亡。病鸡腹部膨满，排出黄绿色的稀便。特征性的病变是纤维素性心包炎，气囊混浊肥厚，有干酪样渗出物。肝包膜呈白色混浊，有纤维素性附着物，有时可见白色坏死斑。脾充血肿胀。 2.死胚、初生雏卵黄囊感染和脐带炎种蛋内的大肠杆菌来自种鸡卵巢和输卵管及蛋壳被粪便的污染。侵入种蛋内的大肠杆菌在孵化过程中进行增殖，致使孵化率降低，胚胎在孵化后期死亡，死胚增多。孵出的雏鸡体弱，卵黄吸收不良，脐带炎，排出白色、黄绿色或泥土样的稀便。腹部膨满，出生后2-3天死亡，一般6日龄过后死亡率降低下来。即使不死的鸡，也是发育迟滞。死胚和死亡雏鸡的卵黄膜变薄，呈黄泥水样或混有干酪样颗粒状物、脐部肿胀发炎。4日龄以后感染常见心包炎，其中急性死亡的病雏几乎见不到病变。 3.卵黄性腹膜炎及输卵管炎腹膜炎可由气囊炎发展而来，也可由慢性输卵管炎引起。发生输卵管炎时，输卵管变薄，管内充满恶臭干酪样物，阻塞输卵管使排出的卵落到腹腔而引起腹膜炎。 4.出血性肠炎埃希氏大肠杆菌正常只寄生在鸡的下部肠道中，但当发生饲养和管理失调，卫生条件不良，各种应激因素存在，使鸡的抵抗力降低，大肠杆菌就会在上部肠道寄生，从而引起肠炎。病鸡羽毛粗乱，翅膀下垂，

精神委顿，腹泻。雏鸡由于腹泻糊肛，容易与鸡白痢混淆。剖检病变，主要表现在肠道的上1/3至1/2肠粘膜充血、增厚、严重者血管破裂出血，形成出血性肠炎。 5.其它器官受侵害的病变大肠杆菌引起滑膜炎和关节炎，病鸡跛行或呈伏卧姿势，一个或多个腱鞘、关节发生肿大。发生大肠杆菌肉芽肿时，沿肠道和肝脏发生结节性肉芽肿，病变似结核。此外，大肠杆菌还可引起全眼球炎、脑炎等。 6.慢性呼吸道综合症鸡先感染支原体，造成呼吸道粘膜被损害，后继发大肠杆菌的感染。病的早期，上呼吸道炎症，鼻、气管粘膜有湿性分泌物，发生罗音、咳音，发展严重时，发生气囊炎、心包炎，有纤维素渗出，肝脏也被纤维素物质包围，肺部有肺炎，呈深黑色，硬化。 7.皮下感染头部肿胀由于表皮损伤侵入，感染扩散到关节和骨部，引起这些部位的炎症。有一些病毒感染后，继发大肠杆菌急性感染，造成头部肿胀，即肿头综合症，双眼和整个头部肿胀，皮下有黄色液体及纤维素渗出，可从局部分离出大肠杆菌。

大肠杆菌的管理与防治

大肠杆菌的管理与防治 本病属于条件致病性病原，因此非常容易在防疫密集时刻或强应激时发生，因此在一些时间点上进行控制。 1、两周龄以内 两周内特别在7日龄和14日龄左右极易发生，应严格控制温度，注意通风换气，添加敏感药物。2日龄前温度维持在35℃以上，以鸡背温度为标准，临床以10％出现张口呼吸为标准，特别在冬天非常关键，适当高温育雏可明显降低一些疾病发生率，3日龄开始递减温度，通风，换气。温度每天递减0.5～1℃，到24℃时，不再递减。通风换气应使用排风扇，以免造成舍内温差过大。适时通风可保证适宜的湿度，可避免因湿度大、空气污浊诱发大肠杆菌病。控制温度同时添加药物预防，可用头孢类药物，如头孢曲松每克加水10～20kg，连用3d。或者和氧氟加替联合应用。 2、21～35日龄 这一阶段是鸡大肠杆菌病的高发阶段。饲养管理上要求温度控制在24℃左右，进一步加强通风，添加药物预防大肠杆菌病，还应注意添加抗球虫病药物预防球虫。预防大肠杆菌病可采用氨基糖苷和林克霉素类联合应用。如阿米卡星饮水，1g阿米卡星加水20kg，连用3d。加上林可霉素1g兑水10kg。抗球虫药可用地克珠利饮水或用三字球虫粉全天量1次饮水，既可防大肠杆菌病又可防球虫病，此阶段成果亦可维持半个月左右。 3、35～55日龄 此阶段易发生大肠杆菌性关节炎及大肠杆菌性肠炎，采用左旋氧氟沙星全群饮水，15g5左旋氧氟沙星加水200kg，并配合林克霉素连用3～5d。即可控制大肠杆菌病，也可控制慢性呼吸道病。 此外，大杆感染部分来源于不洁的饮水，因此定期对饮水系统进行消毒，带鸡消毒非常关键。国内部分专家不提倡对鸡群进行带鸡消毒，认为可能会导致肠道菌群失调，或者会对肠粘膜造成损伤，个人认为这个担心并不存在。做为人用饮用自来水都含一定浓度的漂白粉，何况鸡呢？只要浓度控制好即可。 常见大杆药物 一、β-内酰胺类抗生素 1、青霉素类。 用法与用量：

大肠杆菌实验总结

分离

划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。 涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。 （一）制备LB培养基（通用的细菌培养基） 1、配方：蛋白胨10.0克，牛肉膏5.0g，氯化钠10.0克，水1000ml （配固体培养基再加琼脂20克） 2、流程 计算称量溶解调pH分装加塞，包扎灭菌倒平板

培养基配制(特) 培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。 1、按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中： 2、用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、 溶解。待灭菌。 ①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用___三角漏斗 _。 ②加塞：试管用塑料盖或__棉花塞___；三角瓶口用_封口膜__或_6层纱布封口,再用__牛皮纸__或报纸封口。 ③包扎：用_牛皮纸__或报纸 ④灭菌：高压蒸气灭菌法 1）加水：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是不触及内胆 _. 2）装锅：物品放置的要求__整齐、稳定、留出空隙：加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_排气槽__内。再以__两两对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺 栓松紧一致，勿使漏气。3）加热排气：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀。4）保温保压：当锅内压力升到1_kg/cm2时，控制热源，维持压力至15 _min。5）出锅：切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至_0_时，打开_排气阀__，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。