液相色谱仪常用操作步骤

液相色谱仪常用操作步骤

1)．首先对流动相进行过滤，根据需要选择不同的滤膜，一般为有机系和水系，常用的孔径为0.22um和0.45um。

2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

3)．正常情况下，仪器首先用甲醇冲洗10-20分钟，然后再进入测试用流动相(如流动相为缓冲试剂，则要二次重蒸水冲洗10-20分钟，直至色谱柱中有机相冲净为止) 。

4)．一般情况下，流动相冲洗20-30分钟后，仪器方可稳定，最重要的是仪器基线走后，方可进样测试。

5)．同时进两针标样，将其结果相比较，其结果的比值在0.98-1.02之间后，就可以正式进行样品的测试了。

6)．样品测试结束后，就要进行色谱仪及色谱柱的清洗和维护。如流动相为缓冲试剂，同样也要用重蒸水清洗10-20分钟，方可用有机相进行保护，否则，有损色谱柱。

7)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。

8)．填写登记本，由负责人签字。

注意事项：

1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。

4)．压力不能太大，最好不要超过150kgf/cm2 .

5). 因为缓冲试剂遇有机溶剂，会结晶，有损色谱柱，所以，每次由有机相变流动相或流动相变有机相均需用蒸馏水清洗。

气相色谱仪操作规程

一载气钢瓶的使用规程

1 钢瓶必须分类保管，直立因定，远离热源，避免暴晒及强烈震动，氢气室内存放量不得超过二瓶。

2 氧气瓶及专用工具严禁与油类接触。

3 钢瓶上的氧气表要专用，安装时螺扣要上紧。

4 操作时严禁敲打，发现漏气须立即修好。

5 用后气瓶的剩余残压不应少于980 kPa。

6 氢气压力表系反螺纹，安装拆卸时应注意防止损坏螺纹。

二减压阀的使用及注意事项器仪表同

1在气相色谱分析中，钢瓶供气压力在9.8-14.7 MPa。

2 减压阀与钢瓶配套使用，不同气体钢瓶所用的减压阀是不同的。氢气减压阀接头为反向螺纹，安装时需小心。使用时需缓慢调节

手轮，使用权后必须旋松调节手轮和关闭钢瓶阀门。

3 关闭气源时，先关闭减压阀，后关闭钢瓶阀门，再开启减压阀，排出减压阀内气体，最后松开调节螺杆。

三微量注射器的使用及注意事项

1 微量注射器是易碎器械，使用时应多加小心，不用时要洗净放入合内，不要随便玩弄，来回空抽，否则会严重磨损，损坏气密性，

降低准确度。

2 微量注射器在使用前后都须用丙酮等溶剂清洗。

3 对10-100微升的注射器，如遇针尖堵塞，宜用直径为0.1 mm的细钢丝耐心穿通,不能用火烧的方法。

4 硅橡胶垫在几十次进样后，容易漏气，需及时更换。

5 用微量注射器取液体试样，应先用少量试样洗涤多次，再慢慢抽入试样，并稍多于需要量。如内有气泡则将针头朝上，使气泡上

升排出，再将过量的试样排出，用泸纸吸去针尖外所沾试样。注意切勿使针头内的试样流失。

6 取好样后应立即进样，进样时，注射器应与进样口垂直，针尖刺穿硅橡胶垫圈，插到底后迅速注入试样，完成后立即拔出注射器，

整个动作应进行得稳当，连贯，迅速。针尖在进样器中的位置，插入速度，停留时间和拔出速度等都会影响进样的重复性，操作时应注意。

四热导池检测器的使用及注意事项

1 开启热导电源前，必须先通载气，实验结束时，把桥电流调到最小值，再关闭热导电源，最后关闭载气。

2 稳压阀，针形阀的调节须缓慢进行。稳压阀不工作时，必须放松调节手柄。针形阀不工作时，应将阀门处于“开”的状态。

3 各室升温要缓慢，防止超温。

4 更换汽化室密封垫片时，应将热导电源关闭。若流量计浮子突然下落到底，也应首先关闭该电源。

5 桥电流不得超过允许值。

五氢火焰检测器的使用及注意事项

1 通氢气后，待管道中残余气体排出后，应及时点火，并保证火焰是点着的。

2 使用FID时，离子室外罩须罩住，以保证良好的屏蔽和防止空气侵入。如果离子室积木，可将端盖取下，待离子室温度较高时再

盖上。工作状态下，取下检测器罩盖，不能触及极化极，以防触电。

3 离子室温度应大于100℃，待层析室温度稳定后，再点火，否则离子室易积水，影响电极绝缘而使基线不稳。

液相色谱仪的使用和维护注意事项

一、泵的使用和维护

1、防止固体微粒进入泵内。因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞杆、密封环、缸体和单向阀。泵的入口都应连接砂滤棒，输液棒的滤器经常清洗或

2、流动相不应含有任何腐蚀性物质。例如氯仿、丙酮、二氯甲烷等，这些溶剂将会Peek树脂部件变脆；还有含有卤离子的流动相或能产生卤离子的流动使用了，分析结束后，应立即用去离子水清洗整个管路，因卤离子会腐蚀不锈钢部件或管路。流动相含有缓冲盐不应停泵保留在泵内时间过长，由于蒸发溶液的净置就可能析出晶体。

3、泵工作时要注意流动相不要被用完，否则空泵运转会加快磨损柱塞杆和密封圈。输液泵的压力不要太高，否则会使密封圈变形，降低密封圈使用寿命。

4、在使用双泵过程中，如果不是梯度洗脱，尽量先混合。如果一个是有机溶剂，一个是含盐溶液，在用双泵的时候，有可能会析出晶体。

5、在使用缓冲盐作流动相实验结束之前和结束后，都要用含10％甲醇水溶液冲洗管路，不能用纯水冲洗，因纯水会对柱子造成损坏。进样阀要用适宜的清洗。

二、色谱柱的使用和维护

1、避免压力和温度的急剧变化以及机械震动。在进样的时候，进样阀扳手不能转动太慢，更不能停留在中间，如停留在中间，泵内压力剧增，这时再转动置时，过高的压力会损坏色谱柱。如出现机械震动（掉在地上）则会改变填料的充填状态。

2、在使用色谱柱过程中，不应直接从有机溶剂到水，反之，也不要从水直接改变到有机溶剂。

3、色谱柱一般不能反冲，除非生产者指明。

4、冲洗色谱柱时，每种溶剂至少冲洗50ml。

5、装在机子上的色谱柱，应每隔4～5天冲洗15分钟，可以避免长菌，保护色谱柱。

6、PH的调节尽量在2～9之间

7、保存色谱柱时，柱接头要拧紧。

三、输液泵产生故障及排除方法

1、没有流动相流出，又无压力显示。原因可能是泵内有大量气体，这时打开排液阀，使泵在较大流量下运转，将气体排出，也可用一个针筒在泵出口处帮体。另一个原因使密封圈损坏。

2、压力和流量不稳。原因①可能有气泡；②单向阀污染，可卸下单向阀，浸入异丙醇内超声清洗；③沙滤棒内有杂质或微生物堵塞，可将沙滤棒浸入流动清洗，也可将滤头放入4mol/l硝酸溶液中，迅速除去微生物。也可能是盐堵塞，可放入水中清洗；④在线过滤器堵塞⑤进样阀损坏；⑥密封圈性能不好。压力过高。①管路堵塞；②保护柱堵塞；③检测池堵塞，发生情况立即停泵，否则会损坏流通池。

四、与检测器有关的故障及其排除

1、流通池内有气泡。如果有气泡连续不断通过检测池，将其噪音增大。如有较大气泡，则会在基线上出现许多线状“峰”，可加大流量排出气体。如果检测的气泡，可采用突然增大流量的方法排除气体（不连接色谱柱）。

2、检测池被污染。检测池被污染了，可能产生噪音，或基线漂移，可以使用适当溶剂清洗，如果污染严重，就可以用1mol/l硝酸溶液、水和新鲜溶剂进行

3、光源灯出现故障。检测器的光远灯不能满足正常样品分析时，可能产生严重噪音污染，基线漂移，出现异常峰，甚至基线不回零。

4、出现倒峰。如果流动相有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，就会产生倒峰，必须用高纯度的溶剂作为流动相。检测器的极性接反了，也会出现倒峰液相色谱仪色谱柱使用及维护

更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱）

注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，

以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。

1．将修补工具中的2套入柱芯的顶端

2．将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧

3．一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网

4．用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料

5．将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平

6．照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端

7．柱芯顶端套上2，然后参照（左图）将滤网放入

8．压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平

平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"。

硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡

如何平衡色谱柱？

平衡过程中，将流速缓慢地提高

用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）

色谱常见问题问答

■问：用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决?

答：关于漂移问题： 1、温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定 2、流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等 3、柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡关于快速变化问题 1、流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定 2、泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。 3、流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合

■问：色质联用中毛细柱的选择应注意什么问题?

答：1、柱效要高 2、热稳定性好 3、化学惰性强具体选择应注意：1、柱极性。根据分析样品选择不同极性的柱子进行分析 2、柱子内径。内径大小决定柱容量 3、液膜厚度。分析样品温度一不一样，对膜厚有不同要求，温度高液膜要厚，温度低液膜要薄 4、柱长度。柱越长，柱效越高，分离效果越好，但也存在吸附问题，柱子过长，分析时间长，因此要根据样品考虑柱子长度 5、外涂层(柱体)的选择6、另外还有仪器型号、分析对象等因素问：液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么? 答：1、筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。 2、存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子

■问：从那些方面可以简单判别毛细管柱子的热稳定性好坏?

答：1、分配容量(或容量因子)K，好的柱子在高温运行后，分配容量K不应有明显的下降，否则，说明柱子的热稳定性不好。 2、理论塔板数n，热稳定性好的柱子经受高温后，理论塔板数应基本保持恒定 3、柱子的极性。热稳定性好的柱子，高温前后极性变化不大，具体表现为保留指数I值没有大的变化。 4、噪声。热稳定性好的柱子在高温下使用后，噪声不能增加. 5、柱子的去活层，毛细管柱子涂固定液前内部一般要用去活性试剂去活以增加惰性。质量好的毛细管柱子高温后，去活层不应该变化，表现在对强极性样品或酸碱性样品的吸附性不能增加。

■问：为什么进样器内的玻璃衬套会对色谱行为造成影响?

答：进样器内的玻璃衬套主要有下列作用：1、提供一个温度均匀的汽化室，防止局部过热。 2、玻璃的惰性不如不锈钢好，减少了在汽化期间样品分解的可能性。 3、易于拆换清洗，以保持清洁的汽化室表面，一些痕量非挥发性组分会逐渐积累残存于汽化室，高温下会慢慢分解，使基流增加，噪声增大，通过清洗玻璃衬套可以消除这种影响。 4、可根据需要选择管壁厚度及内径适宜的玻璃衬套，以改变汽化室的体积，而不用更换整个进样加热块。从以上几个方面可以知道玻璃衬套对色谱行为造成影响的原因。

■问：毛细管色谱分流进样时，非线性分流的主要原因是什么?

答：1、进样器温度太低，样品汽化不完全，发生分级分流。 2、进样器温度太高，某些组分可能发生热分解，也有的样品可能发生催化分解，或样品部分地被吸附在进样器内表面上。 3、在分流点以前样品没有混合均匀或混合不充分。 4、系统的进样垫，柱接头等地方漏气。

■问：HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法

答：1、样品量不足：解决办法为增加样品量 2、样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子 3、样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器 4、检测器衰减太多：调整衰减即可。 5、检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数6、检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。 7、检测池中有气泡：解决办法为排气。 8、记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。 9、流动相流量不合适：调整流速即可。 10、检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。

■问：做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决?

答：原因可能有： 1、泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理； 2、比例阀失效，更换比例阀即可。 3、泵密封垫损坏，更换密封垫即可。 4、溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法； 5、系统检漏，找出漏点，密封即可。

6、梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

■问：做PGS／MS分析时，如何防止焦油状污染物进入毛细柱?

答：聚合物，尤其是一些含氮、硫及卤素的高分子裂解时，常有焦油状物质产生。为防止这种焦油状物质进入毛细柱造成污染而使柱性能下降，可采用保护预柱，即在裂解器与毛细柱之间接一填充预柱，通过控制预柱温度而使焦油状物质滞留在预柱内，预注可置于GC气化室内，这样既容易控制温度，又减少系统的死体积，当然，预柱填料需经常更换。

■问：我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么?

答：这是因为被分析物可能具有形成氢健的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺(TEA)，将会使硅醇基的成键能力饱和，从而保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。