双向电泳操作步骤
3.1 全菌蛋白的制备
将细菌接种于DMEM培养基，置于28℃培养箱培养18h。参照Coelho 等（Coelho et al. 2004）的方法，略有改动。用Wash buffer（10mmol/L TrisCl pH8.0，5mmol/L 醋酸镁）清洗细胞3次。离心，细胞沉淀在Lysis Buffer( 7mol/L 尿素，2mol/L硫尿，1% IPG Buffer pH3-10或pH4-7，4% CHAPS，1% DTT，1%蛋白酶抑制剂，1%核酶抑制剂)中悬浮，使其浓度范围在5~10mg/mL。置于冰上裂解2h。13000r/min离心1h取上清，-80℃保存。用2-D clean-up Kit 纯化蛋白，再用2-D Quant Kit测定样本中蛋白浓度。
3. 2 2-D Clean-Up Kit的使用方法（全程小心）
蛋白质样本在1.5mL微型离心管中处理，所有步骤均在冰上进行。
1）将体积100μL的蛋白质样本（含1~100μg蛋白质）置于1.5mL微型离心管中。加入300μL沉淀剂。振荡或倒置搅匀。冰浴中（4~5℃）培育15min。
2）加入300μL共沉淀剂，简单振荡混合一下，12000r/min离心5min。
3）将上清液尽量多地倾析或吸出，不要搅散沉淀。保持沉淀不变，在其上面加入一层40μL共沉淀剂，冰上培育5min。后离心5min，去上清。
4）往沉淀加入25μL蒸馏水或去离子水。将管振荡5~10s，这时沉淀应散开，但并未溶解于水中。在管中加入1mL洗涤缓冲液（在-20℃下至少预冷1h）和5μL洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。-20℃下培育至少30min，每10min振荡20~30s。
5）将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min。小心地将上清液移走弃去。此时应可见白色沉淀，将沉淀简单风干一下（不要超过5min）。
6）用裂解液溶解沉淀，以备第一向IEF电泳。振荡管子至少30s，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min，去掉所有不溶物质，除去泡沫。上清液可以直接加载到第一向IEF 电泳胶上，也可以移至另一个管中，在-80℃下保存以备日后分析。
3.3 2-D Quant Kit的使用方法
1）用2mg/mL浓度的BSA 标准溶液制备标准曲线（0~50μg）。
2）制备含1~50μL待测样本的微型离心管，一式两份。有效检测范围是0.5~50μg。
3）每个微型离心管中（包括含BSA 标准溶液的离心管）加入500μL沉淀剂。振荡并在室温下培育2~3min。
4）加入500μL辅助沉淀剂，短暂混匀。
5）离心（至少10 000r/min）5min。弃去上清液。再次短暂离心将残余的上清液集中至管底，用微量移液管吸去残余的上清液。操作要快，避免离心沉淀再溶或分散开。此时应无可见的液体成分残留。
5）每个管中加入100μL铜溶液和400μL蒸馏水或去离子水。振荡使沉淀的蛋白质溶解。应彻底振荡混匀，确保沉淀完全再溶解。
6）每个管中加入1mL工作比色剂，应确保以最快的速度加入，使之与样本立即相混。在室温下培育15~20min。采用分光光度计，如Ultrospec1100 pro UV/ 可见光分光光度计，测定样本和标准液的480nm波长吸光率。
7）根据标准溶液蛋白质含量的吸光率，标绘标准曲线。将样本与标准曲线比较，得到样本蛋白质浓度。
3.4双向电泳
主要是依据GE Healthcare公司双向电泳操作手册进行，并参考GE Healthcare描述方法进行一些改进(Berkelman et al. 1998)。
3.4.1 一向等电聚焦（IEF）
13cm pH 3-10的胶条每胶条上样150μg蛋白。24cm pH 4-7的胶条，每胶条上样300ug
蛋白。胶条上样后于20℃水化l2h。水化好的胶条移至Ettan IPGphor III水平电泳仪按照：S100v 1h，S200v 1h，S500 v 1h，G1000v 1h，G10000v 3h，S10000v 8h至等电聚焦完成。等电聚焦结束后, 迅速取出IPG 胶条, 先置于平衡液A( 6 mmol/L Urea，2% SDS，75 mmol/L Tris-HCl pH8.8，29.3%甘油，1% DTT，痕量溴酚蓝) 平衡15min后，再将胶条置于平衡液B ( 6mmol/L Urea，2% SDS，75mmol /LTris-HCl pH 8.8，29.3%甘油，2.5%碘乙酰胺，痕量溴酚蓝)平衡15 min。
3.4.2 二向SDS-PAGE（缓冲液全部是新鲜配制）
将平衡好的胶条转入Ettan DALTsix垂直电泳槽中进行第二向电泳，聚丙烯酰胺凝胶浓度为12%，电泳条件为每胶1W ，电泳1h，然后每胶20W直至溴酚蓝指示线到达凝胶底部停止电泳。
3.4.3 银染
将凝胶在玻璃板上剥离下来后，置于固定液(40%无水乙醇)30min，倒去固定液，换敏化液(30%无水乙醇10%冰乙酸，0.2%硫代硫酸钠，6.8%的乙酸钠) )中敏化30min，倒去敏化液，以双蒸水洗3次，每次5min，然后置于银染液(0.25%硝酸银)中染色20min，再次用双蒸水洗2次，每次l min，接着置于显影液(2.5%无水碳酸钠，0.0084%甲醛)中至蛋白质点完全显现为止，倒去显影液，立即换终止液(1.5%乙二胺四乙酸二钠)停止显影，10min后用双蒸水洗涤3次，每次5min，然后置于保存液(30%无水乙醇，4.6%丙三醇)中，30min后再换一次保存液，此时凝胶就可以进行扫描和分析了。
3.5 凝胶扫描及图象分析
Image Scanner III型透射扫描仪对凝胶进行图象扫描。得到的双向电泳图谱通过ImageMaster 2D Elite 5.0 图像分析软件进行分析，所得数据的统计分析在SPSS11.0 软件上进行。
水化过程：
⒈从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（不含DTT ，IPG Buffer）一小管（1ml/管），置室温溶解。
⒉在小管中加入2.8mg DTT，IPG Buffer 5ul，充分混匀。
⒊从小管中取出450ul水化上样缓冲液，加入(13cm pH 3-10的胶条每胶条上样150μg蛋白)样品，充分混匀。确保充分吸收，不要过量加入水化液。短暂离心。
⒋水化液加入溶胀盘。
⒌从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。分清胶条的正负极，从正极开始剥保护层，胶面朝下，除气泡，正极先放。注意：碱性（负极）端较脆弱，应小心操作。轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
⒍在每根胶条上覆盖2-3ml覆盖油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
⒎胶条上样后于20℃水化l2-20h。
第一向等电聚焦
⒈水化结束后，调仪器水平，放胶条槽。
⒉胶条放与滤纸上，吸多余覆盖油。取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。
⒊放胶条，胶面朝上。
⒋加电极片，装电极片。将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH2O 5~8μl润湿。
⒌盖盖，设程序
⒍对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。
⒎聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
第二向SDS-PAGE电泳
⒈配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水（没有milliq的话ddh2o也行）、封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。
⒉待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水，用MilliQ水冲洗。
⒊从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。
⒋配制胶条平衡缓冲液A。
5．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
⒍将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平
衡缓冲液A。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
⒎配制胶条平衡缓冲液B。
⒏第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液A。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液B，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
⒐用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。
⒑将琼脂糖封胶液进行加热溶解。
⒒将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。
⒓第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液Ⅱ。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。
⒔将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。
⒕将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
⒖用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。
⒗放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
⒘在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。
⒙在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
⒚电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
⒛进行染色。
双向电泳蛋白点的切取和保存
1. 用PDQuest软件或肉眼比对，找出感兴趣的蛋白点，并做好标记和记录。
2. 用MilliQ水冲洗胶2次。
3. 用色谱纯甲醇和MilliQ水冲洗Ep管
4. 将枪头(200μl)下端剪去，使其内径略小于蛋白斑点的直径，用色谱纯甲醇和MilliQ水冲洗枪头。
5. 对准斑点中央小心将蛋白切割下来，放入Ep管，MilliQ水漂洗2次，如胶块太大，将其切成1 x 1 mm的胶片。
6. 将切好的点做好标记和记录，置-80oC保存或冻干后-20oC存放。
注意事项：
1. 尽量避免皮肤和头发的角蛋白的污染，在操作过程中应戴一次性的PE手套（不用乳胶手套）和帽子。
2. 不要将胶长期存放于乙酸溶液中。
3. Ep管及染胶的容器必须用甲醇和水充分清洗，尤其应与进行Western blotting的容器分开，以避免casein或BSA的污染。
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE 一. 实验原理 SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。 二. 试剂器材 30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制； 注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。 分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；
电泳操作方法
XXX有限公司SDS-PAGE 电泳的测定方法 文件编号XXXX-02 制定部门研发部 版本A/0 页码1/3 生效日期2014/4/9 一、目的 建立SDS-PAGE电泳的测定方法,确保电泳检测的准确性，保证电泳的安全性、有效性。 二、范围与权责 适用于本公司的所有成品以及中间体的分析，由化验员负责采样检测。 品控主管负责审核。 三、原理 SDS-PAGE电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS,SDS会与变性的多肽结合，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：lgMw=k-bX。式中：Mw为分子量；X为迁移率；k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对数分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 四、实验仪器及试剂 1.DYCZ-24DN 双垂直电泳仪 2.DYY-8C 电泳仪电源 3.STS-2A 脱色摇床（水平） 4.标准蛋白Marker 5.平皿：直径150mm 6.TEMED:四甲基乙二胺 7.DTT:二硫苏糖醇 8.储存液 ①2M Tris-HCl缓冲液：称取24.2g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至8.8， 待室温，加蒸馏水至100ml。 ②1 M Tris-HCl缓冲液：称取12.1g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至6.8， 待室温，加蒸馏水至100ml。 ③10%SDS溶液：称取10g SDS ，加蒸馏水溶解至100ml。 ④50%甘油：50ml甘油加50ml蒸馏水，混合均匀。 ⑤1%溴酚蓝：100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌至完全溶解，水相针式过滤器过滤除去聚 合的染料。 9. 工作液 ①A液：30%丙烯酰胺储存液，丙烯酰胺是一种神经毒素，可通过皮肤被人体吸收并富集。操 作时要避免皮肤接触，并带合适的口罩于通风橱中进行。 ②B液—分离胶缓冲液：取75ml 2M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，加21ml蒸馏水，混 合均匀，4℃保存数月。 ③C液—浓缩胶缓冲液：取50ml 1M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，，加46ml蒸馏水，混 合均匀，4℃保存数月。 ④10%APS：称取1g过硫酸铵，加10ml蒸馏水溶解后，水相针式过滤器过滤分装到EP管中，
胶内酶切及MALDI-TOF-TOF质谱鉴定操作步骤
蛋白质肽谱制备 1．凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片放入小管中。 ★凝胶染色分为：A:硝酸银染色 B:考马斯亮蓝染色 C:胶体蓝染色 ★胶粒分为：A:一维SDS-Page胶粒 B:二维双向电泳胶粒 2．凝胶加入脱色液100ul浸泡，振荡20min，弃取溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽,乙腈100ul,弃废液。 ★如果为二维双向电泳胶粒，直接进行第3步骤。 ★如果为一维SDS-Page胶粒，需要加两个步骤： ①加入50uLDTT还原液,30min,56度,弃废液,加100ul乙腈脱水5-10min ②加入50ul碘乙酰胺烷基化，于暗处30min（开冻干机） 3．凝胶加100ul脱色液，洗5-10min，乙腈100ul,弃废液，冰冻干燥20min. 4. 凝胶加入15-20ul酶液（0.01ug/ul），置于4度放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液(25mMNH4HCO3)15-20ul，使胶完全浸没，37度保温15小时以上或过夜。 ★如果一管中的胶粒很多，15-20ul酶液不足让所有胶粒都吸涨，可视情况多加酶液。补同体积酶解缓冲液后，胶粒刚好被液体浸住。（后边提取液I、提取液II也可相应多加，且提取时间也可相应增长。）5．加提取液I(5%TFA)100ul,40度加热水浴1小时，每30min，超声一次，3min左右。 6．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取II(50%乙腈，2.5%TFA)100ul,30度保温1小时，每30min，超声一次，3min左右。 7. 将提取液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。（冻干的肽段放-20度冰箱保存） 8．向冻干肽段加入2~10ul（根据未脱色以前胶粒的颜色深浅，判断样品的量多少）的0.1%TFA溶液混匀。（如果不能及时上质谱检测，建议不要复溶冻干肽段。） 9. 取0.5ul~0.8ul样品点靶。待干，再点0.5ul基质，上质谱。 溶液配制 1．100mMNH4HCO3:称取1.975gNH4HCO3溶于250ml的去离子水中 2．脱色液配方乙腈：50mMNH4HCO3=1:1 3. 10mmol/LDTT还原液：称取1.54mg溶于1ml100mMNH4HCO3中 4．55mmol/L烷基化溶液：称取10.2mg碘乙酰胺溶于1mL100mMNH4HCO3中 5．酶解贮液：Trypsin(Promega,V5111)制备为0.5ug/ul水溶液，分装1-3ug -20度保存(粉末+40ul水——>2~6ul分装。) 6．酶解工作液：Trypsin终浓度为0.01ug于25mMNH4HCO3溶液（2ul稀释50倍=100ul） 7．肽提取液I:5%TFA(v/v)水溶液 8．肽提取液II: 乙腈：5%TFA=1:1
琼脂糖凝胶电泳标准操作流程
琼脂糖凝胶电泳操作标准流程 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，此关为能力考核，通关成功后，代表具备操作琼脂糖电泳的能力。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA分子大小；2、琼脂糖浓度； 3、DNA构想； 4、所用的电压； 5、琼脂糖种类； 6、电泳缓冲液 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合
对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。 三、材料、试剂及器具 1、材料 不同大小的基因组片段； 2、试剂 Hind III digest DNA Marker（分子量标准）(TaKaRa)；D2000(TianGen)；BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）；加样缓冲液（6x）：溴酚黄；电泳缓冲液（1×TAE）；溴化乙锭（EB）； 3、仪器及器具 （1）移液器、吸头、锥形瓶 （2）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。 （3）紫外透射仪、微波炉、电子天平 四、操作步骤 1.器具清洗：首先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净，包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘（EB污染，需独立清洗）。清洗流程为：先用自来水冲洗三次，然后用纯水冲洗三次，最后用纸巾或医用纱布擦干。若需对电泳产物进行胶回收，则还需用75%酒精对器具进行消毒。 2.配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶。首先将锥形瓶洗干净并加入少量纯水煮沸，然后量取一定量的电泳缓冲液（1×TAE）至锥形瓶中，再称取相应量的BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）倒入锥形瓶中，摇匀并
附双向电泳完整的操作步骤第一向等电聚焦1从冰箱中取-20
附：双向电泳完整的操作步骤 （一）第一向等电聚焦 1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。 2. 在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。 3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。 4. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。 5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。 6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。 7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。 8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。 9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。 （二）第二向SDS-PAGE电泳 1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水（没有milliq的话ddh2o也行，注，水云深浪按）、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。 3. 从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。 4. 配制胶条平衡缓冲液I。 5．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 7. 配制胶条平衡缓冲液II。 8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。 10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。 11.将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。 12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。 13.将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。 14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。 15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。 16.放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。 17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。 18.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 19.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
蛋白质电泳实验
尿素－SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 1．试剂的配制 ①30%凝胶母液 丙烯酰胺和N, N’-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29.2 %（w/v）丙烯酰胺和0.8 %（w/v）N, N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。 小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。 ②4倍SDS分离胶缓冲液(4×, pH 8.8) (200 ml) 称取SDS 0.8 g (4%)，Tris 36.342 g (1.5mol/L)，溶解（必要时加热），用盐酸调pH为8.8，定容至200 mL。 ③4倍SDS浓缩胶（堆积胶或积层胶）缓冲液。(4×，pH 6.8)（100 ml） 称取SDS 0.4 g (4%)，Tris 6.051 g (0.5mol/L)，溶解（必要时加热），用盐酸调pH为6.8，定容至100 mL。 ④TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)。 TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 ⑤10%过硫酸铵。 0.5 g过硫酸铵溶于5 mL去离子水中，可于4 ℃下存放数月 ⑥Tris-甘氨酸电极缓冲液（1 L） 称取3g Tris （25 mmol/L）,14.4 g甘氨酸(192 mmol/L),1 g SDS（0.1 %），溶解后定容至1L，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液在室温下长期保存。 ⑦样品处理液（5×样品缓冲液）（10 mL） 称取Tris 0.07266 g Tris (60 mmol/L), SDS 0.02 g (2%, W/V), 溶于4 mL水中, 用HCl小心调节pH为6.8,再加5 mL 50%的甘油(终浓度25%, V/V)，0.5 mL 2-巯基乙醇(14.4 mmol/L)，溴酚蓝0.01 g (终浓度0.1%), 加去离子水至10 mL。可以在4℃下存放数周，或在－20℃下保存数月。 ⑧考马斯亮蓝R250染色液（1000 mL） 0.1% 考马斯亮蓝R250 考马斯亮蓝R-250 1.0 g （0.1%, W/V） 无水乙醇450 mL (45%, V/V) 冰醋酸100 mL (10%, V/V) 加水定容至1000 mL
血清蛋白电泳操作规程
血清蛋白电泳 一．项目名称 血清蛋白电泳（HYDRAGEL PROTEIN） 二．检验方法名称 琼脂糖凝胶区带电泳 三．方法学原理 蛋白电泳是临床实验室中一种常用的蛋白质剖析技术。它可以对血清或其他体液中的异常蛋白质进行筛选。它是以区带电泳为基础在一种合适的支持介质—琼脂糖上进行的电泳。血清蛋白质在给定的PH条件下主要根据其所带电荷数将其分离成五种片段：白蛋白,α1球蛋白,α2球蛋白,β球蛋白,γ球蛋白，每一区带含有一种或多种血清蛋白质。 四．方法学溯源 自1930年由Tiselius发现了移界电泳（moving boundary eectrophoresis），而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zone elecrrophoresis）所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。血清蛋白区带电泳是在临床实验室中常用的技术之一，可定性和/或半定量各条正常或异常蛋白区带。 五．仪器 （一）型号：SEBIA HYDRASYS (PN1210) （二）分析和计算参数： 1．处理量：约162个样本/小时 2．所需样本量：10ul 3．检验时间：约半小时 4．重复性：有良好的批内和批间重复性 5．电泳参数：电压0－300V（可选至3000V） 电流0－500mA 功率0－100W 六．试剂及配套品 （一）试剂 1．HYDRAGEL 7 PROTEIN(E)试剂盒 HYDRAGEL 15 PROTEIN(E)试剂盒 HYDRAGEL 30 PROTEIN(E)试剂盒 （1）商标：SEBIA （2）包装规格：70测试/150测试/300测试 （3）货号：PN4100/ PN4120/ PN4140 2．脱色液 （1）商标：SEBIA （2）包装规格：Pack for 10×100ml （3）货号：PN4540 (4) 成分：柠檬酸
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤 水化上样( 被动上样) 1. 从冰箱中取出IPG 胶条，室温放置10min。 2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各1cm 左右不加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。 3. 用镊子轻轻撕去IPG 胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。 4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意：不要将样品溶液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收；还使胶条下面的溶液产生气泡。如产生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。 5. 放置30~45min 大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条约3ml(17cmIPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。 6. 置等电聚焦仪于- 20℃水化11~15h。 第一向等电聚焦 1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH2O 5~8μl 润湿。 2. 取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。 3. 将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。 4. 在每根胶条上覆盖2- 3ml 矿物油。 5. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 6. 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样品水化盘中，- 20℃冰箱保存，电泳前取出胶条，室温放置10 分钟，使其溶解。 第二向SDS-PAGE电泳 1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ 水冲洗。 3. 配制胶条平衡缓冲液I 4. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 5. 将胶条转移至样品水化盘中，加入6ml(17cmIPG)平衡缓冲液I ，在水平摇床上缓慢摇晃15 分钟。 6. 配制胶条平衡缓冲液II 。 7. 第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液II 中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15 分钟。 8. 用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己。 9. 将琼脂糖封胶液加热溶解。 10. 在100ml 量筒中加入TGS 电泳缓冲液。 11. 第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。 12. 用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中漂洗数次。 13. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。 14. 用适当厚度的胶片，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意：不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到面胶。
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m ， 式中M r ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； R m ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量
电泳实验步骤
电泳实验细节 实验步骤操作要点： ① 每组将2只50 mL 、2只100 mL 容量瓶，3只200ml 烧杯洗净待用。 ② 用100ml 的容量瓶准确配制0.10 mol/L 的KI 、AgNO 3各100 mL 待用，并配置0.010 mol/L 两种溶液各50 mL 备用。 ③ 用0.010 mol/L 的KI 和AgNO 3分别配制0.005mol/L 的KI 和AgNO 3新鲜溶液100 mL 待用。 ④ 在洗净的200 mL 烧杯中准确移入0.005 mol/L 的KI 26.0 mL ，在搅拌条件缓缓滴入22.0 ml 左右的0.005 mol/L 的AgNO 3，直至形成透明晶莹的AgI 溶胶。 ⑤ 将制备好的溶胶沿洗净的电泳管中央细管缓缓加入，使溶胶高度与电极管口插入的电极头部同高（图二中刻度6）。 ⑥ 沿电泳管的管壁（图中2）滴入0.005mol/L 的KNO 3辅助液，并且使辅助液要高出铂片约2 cm （图中刻度5），将滴加完KNO 3的溶液静置8-10分钟，观察辅助液与胶体间有无界面，无界面则重做。 ⑦ 打开电源之前,检查电源粗调旋钮是否在零位,若不在:一定要调至零点,然后再打开电源;再分别调节粗调 、细调两个旋钮,使电压稳定在160伏，电泳一段时间，使负极一端界面下降2.0 cm （即图中刻度5到刻度6）,记下移动所用时间（s ）.注意:关闭电源时, 电压粗调旋钮也必须调至零点,方可关掉电泳电源开关。 ⑧ 用导线测量两电极铂片间溶胶的长度。 相关公式：)]/(/[t /h 43002 L V E ）（πηζ?= h ：2cm ,E=81 ,V=160V , η：在试验温度下水的黏度80，L ：胶体的长度 ，t ：上升所用时间。
双向电泳步骤--标准操作完整版
细胞裂解（蛋白质提取） 一、试剂配置： PBS配方 氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g 氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g 十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g 磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g 加水至1L配好后进行高压灭菌。 Washing buffer（500mL）配方 Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g 蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g 加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22μm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH） 裂解储液配方（细胞）： 尿素(MW 60.06) 7M 4.2g 硫脲(MW 76.12) 2M 1.52g CHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22μm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解储液配方（组织）： 尿素(MW 60.06)5M3g 硫脲(MW 76.12) 2M1.52g
CHAPS(MW614.89) 2% 0.2g Tris（MW 121.1）40mM 0.048g 加超纯水定容至10mL后经0.22μm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解液： 裂解液储液 100uL IPG buffer（pH可选） 2% 2uL Pi 2uL NucLease mix（100×） 1uL PMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uL DTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uL Pi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装 考马斯亮蓝G-250： 考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g 95%乙醇 4.7% 50ml H3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100mlH3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。 二、实验准备： 1、准备冰盒，细胞裂解过程均在冰盒内进行（4℃）； 2、准备4℃离心机，开机降温，保证温度下降至4℃； 3、取出置于-20℃保存的试剂，需冰上融化，最后取出细胞样品。
SDS-PAGE电泳操作规范
聚丙烯酰氨凝胶电泳 一简介 作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro 于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。 二作用 SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选
TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 三电泳过程 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A(1A=10的负十次方米），这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下： 1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在 固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻 璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝 胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内, 每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动 到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存 实验原理 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。 实验材料和试剂 （一）实验样品 质粒pUC118 （二）试剂 1．l DNA/HindIII分子量标准 2．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 0.2% 溴酚蓝 50% 蔗糖 3．1mg/ml溴化乙锭溶液 4．电泳缓冲液（TAE） 40 mmol/L Tris-乙酸 1 mol/L EDTA (配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml） 5．0.7% 琼脂糖凝胶
蛋白质组学操作规程蛋白质组学样品制备规程01P1
第一部分蛋白质组学操作规程 一、蛋白质组学样品制备规程（01 ） P1. 双向电泳样品缓冲液选用的基本原则 P3. 细胞样品制备（分步）操作规程 P4. 细胞总蛋白提取操作规程 P5. 螺旋藻组织蛋白质提取方法 P6. 嗜热菌蛋白质提取方法 P7. TCA- 丙酮沉淀法样品制备操作规程 P9. 植物材料可溶性蛋白的双乙法制备流程 P10. 动物细胞的样品制备 P10. 动物组织的样品制备——胃 P11. 肺癌组织样品制备 P12. 食管癌样品制备 P13. 羊绒/毛蛋白提取 P13. 大鼠海马组织蛋白提取 P14. 使用Cibacron Blue 3GA Agarose 去除小鼠血浆/血清中的白蛋白P15. E.Coli 样品制备方法 P15. 微生物细胞样品制备操作规程 P16. 去除血浆/血清中的白蛋白和Ig-G P17. 植物根蛋白提取方法 P17. 2D-LC鼠肝样品shotgun消化实验路线 P18. 小鼠肝组织蛋白质提取方法 P18. 小鼠肝脏亚细胞器蛋白质提取方法（线粒体胞浆微粒体） P25. 人肝蛋白质组织提取方法 P27. 人肝脏亚细胞器蛋白质提取方法（线粒体胞浆微粒体） P27. 丙酮丁醇菌蛋白质提取方法（选用嗜热菌蛋白质提取方法） P27. 嗜碱菌蛋白质提取方法（尚在摸索阶段） P27. 脑脊液蛋白质提取方法 二、蛋白质定量标准操作规程（02 ） P1. 改良的Bradford 法测定蛋白质含量 P3. Lowry 法（DC 试剂）测定蛋白质含量 P5. Lowry 法测定蛋白质含量（自配试剂） P7. 安玛西亚定量试剂盒使用方法 P8. 利用微板（96 孔板）定量测定蛋白质浓度 P9. BIO-RAD PROTEIN ASSAY 使用方法P10. BCA Protein Assay Kit 使用操作规程 三、蛋白质电泳及凝胶染色操作规程（03） P1. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 P3. 固相pH 梯度-SDS 双向凝胶电泳实验操作程序
琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程1
琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程 凝胶电泳操作注意事项： 1.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5.电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7.DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。
琼脂糖加样时候注意事项： 1、用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。 2、常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。 3、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。 4、在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。 5、电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。 6、电泳结束后，将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA 带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。 7、在紫外灯下，由于EB发出强烈的橘红色的荧光，所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样，利用特制的照相机和调焦器，也可以对凝胶拍照。 8、如果要对某一条带（如质粒）进一步分析，可用小刀将含该带的凝胶切割下来，从带中回收DNA。
蛋白质SDS-PAGE电泳注意事项.doc
匀浆： 1.匀浆缓冲液含有多种蛋白酶抑制剂，降低蛋白酶活性，以防蛋白降解。 2.SDS在匀浆以后再加入，以防起沫。 3.所有操作尽量在冰上进行。 4.94℃水浴（或沸水浴）处理的作用是为了是蛋白变性，以防降解（水浴锅事 先要打开升温）。 5.PMSF是有毒试剂，处理时注意。 6.操作过程尽量带上手套，以防人手表面的蛋白和脂肪的污染。 7.热水浴后，离心是用的可以控温的离心机，使用前15分钟打开使温度降到 4℃，即可。 8.离心后分装，可以用枪头先把表面的一层吸走，换取新的枪头在分装。 9.SDS,DDT,PMSF是用时临时加入缓冲业的，根据母液的浓度计算所需的量。制胶： 10.APS和TEMED是促凝的，根据温度加入的量是可以变动，一般不超过30％。 11.玻璃板一定要洗干净，否则制胶是会有气泡。 12.丙烯酰胺是有毒的，操作时注意安全。（凝胶以后，聚丙烯酰胺毒性降低。） 13.1.5mm的玻璃板有黑色条带封低，1mm的玻璃板用白色条带封底。（封紧以防 漏胶） 14.凝胶的时间要严格控制好，一般在20-30min。 15.样品处理时，沸水浴使蛋白充分变性以防在电泳时产热蛋白质降解。一般要 5-10分钟。而且要注意把样品的管口封好，以防沸水浴时冲开（出错了）。 16.点样时，如果孔比较多，尽量点在中央。（点在边上时，跑出的带是斜的） 17.点样前要排尽胶底部的气泡，防止干扰电泳。 18.开始电泳时，电压调到80V,当跑过浓缩胶时电压调到100V。 19.电泳结束后，取胶时，小心把玻璃板翘起（防止再次落下） 20.脱色时，尽量多次进行换水。 21.上样量不宜太高，蛋白含量每个孔控制在10μg-50μg,，一般＜15μl. 22.做胶时，凝胶时间控制在25min。梳子不能歪来歪去。 23.上样时，Mark最好标在中间，边上的孔尽量不要上样。
小分子蛋白电泳技术分享
Tricine SDS-PAGE实用方案 Tricine-SDS-PAGE是用于分离分子量在1-10kD的肽类用的。 一、试剂配配制： 1．Low Bis acrylamide（49.5% T, 3% C） Acylamide 48.0g Bis 1.5g Water make up to 100ml 2. High Bis acrylamide (49.5% T, 6% C) Acrylamide 46.5g Bis 3.0g Water make up to100ml 3. Gel Buffer (3M Tris/cl, PH8.45, 0.3% SDS) SDS 0.3g Tris 36.4g Water make up to 100ml PH to 8.45 with HCL 注: 3M Tris 配制时不容易溶解,因此配制时我配制了2M Tris,配方如下: Tris 36.4g SDS 0.3g Water make up to 150ml 4. Anode (Lower) buffer 阳极缓冲液(0.2M Tris/cl, PH8.9) Tris 12.11g Water make up to 500ml PH to 8.9 with HCL 5. Cathode (Upper) buffer 阴极缓冲液(0.1M Tris/cl, 0.1M Tricine, 0.1% SDS, PH 8.25) Tris 6.06g Tricine 8.96g SDS 0.5g Water make up to 500ml
注:不用调PH值 6. 4×Tricine SDS Sample buffer 4×上样缓冲液 (Final concentration: 0.05M Tris/cl, 4% SDS, 12% glycerol, 200mM DTT, 0.01% Commasie G 250) 8×Tris.cl/SDS PH 6.8 2ml Glycerol 4.8ml SDS 1.6g Commasie Blue G 250 4mg Water make up to 10ml 注:8×Tris.cl/SDS PH 6.8配方 Tris 6.05g SDS 0.4g Water make up to 100ml PH to 6.8 with HCL 二、胶的配制 1. 16.5% T 6% C separating gel 30ml 49.5% T 6% C 10ml Gel buffer 15ml Glycerol 3.2ml Water 1.8ml 2. 10% T 3% C spacer gel 30ml 49.5% T 3% C 6.1ml Gel buffer 15ml Water 8.9ml 3. 4% T 3% C stacking gel 12.5ml 49.5% T 3% C 1ml Gel buffer 4.65ml Water 6.85ml 注: 用Bio-Rad系统, 0.75mm的胶,separating gel 配3ml, 加2.5ml; Spacer gel 配1ml,加0.7ml; Stacking gel 配1.25ml. 灌胶前临时加10%AP（过硫酸铵）和TEMED. 胶配制的通用配方: