用CRISPR Cas9方案构建双基因敲除鼠, 获得双基因敲除纯合子小鼠的交配方案

双基因敲除小鼠繁殖工作：

CRISPR/Cas9方案构建双基因敲除鼠，得到F0杂合子之后，如何建系才能获

得双基因敲除纯合子小鼠？这是经常被问到的问题，下面就简单回答一下。

假设我们的目的基因为A和B，通常用CRISPR/Cas9方法得到的基因敲除鼠

为杂合子，双杂合子小鼠基因型为AaBb，大写字母代表野生型（dominant），小写字母代表突变型（recessive）。得到F0杂合子（AaBb）之后，可以用

以下方案之一来获得双基因敲除纯合子小鼠：

方案一：

1.将双杂合子小鼠（AaBb）与野生鼠（AABB）交配，理论上将得到25%的

野生型（AABB），25%基因A单杂合子（AaBB）,25%基因B单杂合子

（AABb）及25%双杂合子小鼠（AaBb）。

2.将所得到的双杂合子小鼠（AaBb）互交（inter-cross），理论上6.25%

的后代将会是双基因敲除纯合子小鼠（aabb），见下图。

3.由于双基因敲除实验中一般都需要单基因敲除动物作为对照，所以在

进行上面小鼠breeding的同时可以将基因A单杂合子（AaBB）互交，

在后代中鉴定出基因A纯合子（aaBB）,同样将基因B单杂合子（AABb）互交，在后代中鉴定出基因B纯合子（AAbb）。

方案二：

将双杂合子小鼠（AaBb）与单基因纯合子（如aaBB）交配，所生小鼠

中约25%为基因A纯合子而基因B杂合子（aaBb,见下图左）。然后将

aaBb小鼠互交，理论上后代小鼠中25%为双基因敲除纯合子小鼠

（aabb），见下图右。

需要特别注意的几个问题：

1)上面所讲的方法适用于位于不同的染色体两个基因的基因敲除，如

果两个基因位于同一条染色体上，要通过上述方法得到双基因敲除

纯合子小鼠很难；

2)上述方法有赖于基因特异性的Genotyping PCR assays。在开始set

up breeding之前必须将两个目的基因特异性的Genotyping PCR

assays 准备好；

3)要事先研究一下目的基因敲除后有无胚胎致死性，是否影响其生长

发育等。当然单基因敲除无胚胎致死性并不表示双基因敲除无胚胎

致死性。

基因敲除小鼠的制作方法

.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.

crispr-cas9基因敲除

CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA 的片段整合到CRISPR 中，并利用相应的CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。 原理 此系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导Cas9 对DNA 的定点切割。 作为一种RNA 导向的dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9（Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的sgRNA ，可靶定任何dsDNA 序列，而sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。 应用 基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。 2013 年1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA 将Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过RNA 注射的方式将CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关G 蛋白偶联受体Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。 CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。 技术优缺点 CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。 传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。

CRISPR cas9基因敲除原理及其应用

CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用 CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。 目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。 由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。 通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。

目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：Cas9质粒构建 设计2条单链oligo序列； 退火形成双链DNA pGK1.1 将双链DNA连接到载体 中 转化G10competent cell 筛选阳性克隆；测序验证 序列；质粒大提；电转染 靶细胞 在细胞内crRNA识别靶 位点，Cas9对靶位点进行 随机剪切 Cruiser TM酶切细胞池，计 算突变率；Cruiser TM酶切 初筛阳性克隆；将阳性克 隆测序验证；做敲除序列 比对分析。

基因敲除技术样本

基因敲除技术 点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢 绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的 使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):

图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子 都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]

基因敲除小鼠技术共9页word资料

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项 高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。

二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程 图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建

敲除鼠的构建

如何设计条件性基因敲除小鼠模型 摘要： 小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。 小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。 条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。它们都是位点特异性重组酶系统。这里以Cre/LoxP系统为例。比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre 的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。此外，若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。 Cre/loxP系统来源于噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列)，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。LoxP的方向由中间这8个碱基决定。这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。令一个组成部分是Cre重组酶。它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失。如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。跟Flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。 所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。这种小鼠跟Cre工具小鼠交配，由于Cre的表达，介导两个LoxP位点序列的重组，从而敲除两个LoxP之间的序列。由于不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/细胞特异性，就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标。比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等。 那如何设计条件性基因敲除小鼠呢?这里所说的设计主要是Flox小鼠的设计。所谓条件性敲除，是说除了特定细胞外，其它细胞里面没有任何的基因表达异常。一般情况下，不要在第一个外显子前面放置LoxP序列。因为第一个外显子前面一般是启动子。放置LoxP 序列有可能会破坏或改变启动子活性。条件性敲除一般是敲掉最早引起移码突变的外显子。这样的话，最好不要敲除有起始密码子ATG的外显子。否则的话，基因可能会利用ORF 内的ATG编码一个缺少部分N端序列的蛋白，这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能。在选择要敲除的外显子的时候(各放一个LoxP在一个外显子的两侧)，该外显子的碱基数目不能是3N，否则新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能产生移码突变。会产生一个

基因敲除技术的原理、方法和应用

基因敲除技术的原理、方法和应用 2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验浏览次数：6302 网友评论 0 条 1．基因敲除概述 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2利用随机插入突变进行基因敲 除。 2.3.RNAi引起的基因敲除。 3．基因敲除技术的应用及前景 4．基因敲除技术的缺陷 关键词：基因敲除 1．基因敲除概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。

B-Cas9敲进小鼠

B-Cas9敲进小鼠——一个神奇的基因敲除小鼠制备工具CRISPR/Cas9技术自问世以来就受到了科学家们的青睐。随着基因敲除技术不断更新完善，最近诞生了一种可以快速、高效制备基因敲除小鼠的工具模型--B-Cas9敲进小鼠。B-Cas9敲进小鼠自身携带Cas9蛋白，只需注射sgRNA就可以对基因进行编辑。那么，我们为什么需要B-Cas9敲进小鼠？它有哪些优势、应用领域如何呢？B-Cas9敲进小鼠又是如何制备的呢？ 1）B-Cas9敲除小鼠的优势 不仅可以缩短敲除小鼠的制备周期，还可以提高敲除效率。在携带有Cas9蛋白的小鼠体内注射sgRNA病毒，便可即时获得敲除小鼠；若在小鼠体内注射多个sgRNA病毒，就可以实现多基因同时敲除。 2）B-Cas9敲除小鼠的应用 不仅可以快速制备组织特异性基因敲除小鼠模型；其多基因变异更接近于肿瘤的异质性，还可以制备多基因敲除的癌症模型；除此之外, B-Cas9敲进小鼠还可以结合sgRNA文库进行高通量筛选。 3）B-Cas9敲除小鼠的制备原理 将表达Cas9蛋白的序列插入到Rosa26位点当中，并在Cas9前面添加TetO元件，以达到控制Cas9表达，实现可诱导型、组织特异性表达的效果。B-Cas9敲进小鼠只有在注射了Dox后，Dox与Teto复合体结合才能诱导Cas9蛋白的表达。（打靶策略如下图）

4）B-Cas9敲进小鼠与国外引进的Cas9敲进小鼠作比较，我们不难发现，B-Cas9敲进小鼠更加有优势。时间上省去了运输和隔离的3-4个月，费用也减少一半多。从遗传背景和技术改造来看，B-Cas9敲进小鼠的遗传背景是纯净的C57BL/6背景，而国外引进的Cas9敲进小鼠是129背景上回交的。B-Cas9敲进小鼠最大的优势在于其可诱导、可逆性表达Cas9,让实验更加方便,易于操控。

基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠(Cas9-KO)的制作方法-2018-2-28

基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠（Cas9-KO）的制作方法 一、CRISPR/Cas9靶向基因敲除小鼠制作的基本技术原理： 通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合，形成双链RNA。这一tracrRNA:crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA。在与crRNA引导序列互补的位点，Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域剪切互补链而Cas9 RuvC-like 结构域剪切非互补链，实现敲除目的基因的功能，制备基因敲除小鼠模型。 二、具体步骤如下： 一）模型制作策略制作：利用生物信息学手段(NCBI&IMPC&MGI)，分别仔细分析目的基因敲除后小鼠的生存能力及繁育能力，并结合邻近基因的影响，最终选择合适的敲除区域进行敲除方案的设计，出具相应的制作策略。 二）载体的设计和构建：使用麻省理工学院的CRISPR Design工具 （https://www.wendangku.net/doc/af2014458.html,/），依据中靶Score的高低及脱靶Score的高低设计一对长度为20bp的针对靶标DNA的寡聚核苷酸链序列用于制备sgRNA，并在该靶区域设计引物用于后续阳性小鼠的基因鉴定。 1、制备sgRNA的实验方法步骤： 1）线性化pUC57-GDNA-T7载体 中提pUC57-GDNA-T7载体，用BsaI线性化过夜。胶回收保存备用。 2）引物退火及加磷酸 将上下游引物（干粉）稀释，再进行引物退火及加磷酸。 3）连接&阳性菌落筛选

取步骤二中的加磷酸产物与线性化载体pUC57-GDNA-T7进行连接，该连接反应在干式恒温器中进行。对连接产物进行转化，涂板，37°C培养箱过夜培养。再用PCR&测序的方法筛选阳性克隆，再将测序正确的克隆进行甘油菌保种，-80°C保存备用 4）制备转录模板 以构建好的sgRNA载体为模板进行PCR扩增，将PCR产物切胶回收，回收产物离心后倒掉上清留DNA沉淀，再溶解DNA。再吸1 μl测DNA浓度，浓度应介于300-500ng/μl，OD260/280介于1.8-2.0范围内。 5）最后进行sgRNA转录，将得到的sgRNA测浓度，跑电泳，分装保存。 三）Cas9/sgRNA的显微注射：将转录好的Cas9 mRNA，sgRNA混合使用显微操作仪将混合物显微注射到小鼠受精卵的胞浆中，再将受精卵移植到假孕的母鼠子宫中，等待F0代小鼠出生。 四）F0 小鼠的鉴定：在F0代小鼠出生后5-7天时，采用剪脚趾法标记小鼠，并将剪取鼠尾组织用在靶区域设计的引物进行鉴定，选取PCR阳性的样品进行测序。 五）F0代小鼠的可遗传性检测：将PCR以及测序正确的F0代小鼠与野生型C57BL/6小鼠进行交配，产生F1代小鼠，依据F0代小鼠的鉴定方法对F1代小鼠进行鉴定，获得的阳性F1代杂合子小鼠即可稳定遗传。

CRISPRCas基因敲除原理及其应用

C R I S P R C a s基因敲除原 理及其应用 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020

CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用 CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解 入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR 系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。 目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。 由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。 通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。 目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下： Cas9质粒构建 设计2条单链oligo序列；退火形成双链DNA

使用CRISPR-CAS系统构建可遗传的基因敲除小鼠和大鼠

使用CRISPR-CAS系统构建可遗传的基因敲除小鼠和大鼠致编辑：CRISPR-CAS系统已经成为一种细胞和模式生物中有效的基因编辑技术。我们使用CRISPR-CAS系统，通过同时注入两种单导向RNA靶向Uhrf2,同时带入Cas9 mRNA来诱导小鼠的DNA片段缺失。此外，我们通过一种单一的显微注射方法得到了敲除Mc3R和Mc4R两种基因的大鼠。在小鼠和大鼠中均观察到较高的种系转移效率（突变可遗传）。 成簇有序间隔短回文重复关联蛋白系统（CRISPR-CAS系统）是一种在细菌和古细菌中演变的针对病毒和质粒入侵的基于RNA的后天免疫系统。【Bamboo注：该系统由一段Cas基因（双链DNA核酸酶）加一段特异序列组成，Cas作用为结合导向RNA,切割目的基因，导向RNA为CRISPR序列转录而成，有二级结构】根据作用机制不同，CRISPR-CAS系统目前有三种类型。在第二类型（下文称该系统）中，CRISPR序列转录RNA（crRNA）和反式激活RNA(TraceRNA)结合后有能力引导Cas9核酸内切酶到特定的序列，从而导致目标DNA双链缺失。【Bamboo注：机理：摄取了病毒DNA后，CRISPR 序列在转录产物tracrRNA,表达产物CAS蛋白，RNA酶共同作用下产生导向RNA,导向RNA含有病毒DNA序列，可遗传给下一代，再遇到病毒DNA时将其剪切】之前的研究表明在哺乳动物中有多种基因工程使用RNA介导的Cas9核酸酶系统。最近，使用该系统进行高效基因编辑已经在斑马鱼、小鼠和细菌中实现。几个小组也证明通过该系统介导的在细胞和斑马鱼中基因靶向效率与ZFNs（锌指核酸酶）和TALENs（转录活化因子效应核酸酶）【Bamboo注：另外两种常见DNA编辑方式】相似或较高。虽然已经有报道在单个小鼠胚胎中可使用该系统打乱多个基因，但是在动物体中尚未见该系统介导的突变种系转移。此外，长的特异的基因组DNA片段能否被该系统敲除也是未知的。CRISPR-CAS系统基因打靶在其他哺乳动物模型，例如实验室大鼠的效用，还需要确定。在这里，俺们报告俺们使用该系统在小鼠和大鼠中实现了高效的，可遗传的基因敲除。 图1使用该系统产生基因突变鼠。(a)该系统构建：Spacer-核酸引导序列；DR-分隔核酸引导序列的小重复片段；NLS-核酸定位信号序列。(b) F0代大鼠注射导向RNA后突变体的检测：Mc4r靶向前后（-，+）分别使用T7E1酶切Mc4r F0代大鼠尾基因组PCR产物。箭头为突变带，M是Marker.(c) Mc3r和Mc4r基因的序列。红框为核苷酸替换。右侧显示碱基对序列改变。通过DNA测序分析六组克隆扩增的PCR产物序列。各基因型在六组克隆的发生率列在右侧。 为了测试该系统在小鼠中的活动，初始试验选用了细胞中基因组Th位点已经被有效靶向的小鼠。首先，我们向FVB小鼠品系雄性原核（受精卵核物质融合前）中注入不同浓度的线性DNA(针对特定CrDNA和tracrRNA的人工编码Cas9核酸内切酶基因)（图1a），在子鼠中检测Th位点基因突变情况。同ZFNs（锌指核酸酶）和TALENs （转录活化因子效应核酸酶）相似，该系统诱导的双链DNA缺失主要被NHEJ(非同源

基因敲除技术

基因敲除技术 1．概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1． 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2，3] ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重

TSC1转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究

基金项目：国家自然科学基金资助（３１２７１２７１ ）＊通讯作者文章编号：１ ００７－４２８７（２０１９）０７－１２３９－０６Ｔ ＳＣ１转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究 王　红１， ２，３，蒋　莉４，王　岩５，许振凯６，王威平６，方　航１，２，３，孙　鹏７，８，９＊，白晓春１，２，３，６＊（１． 南方医科大学附属第三医院，广东广州５１０６３０；２．广东省骨科研究院，广东广州５１０６３０；３．广东省骨科医院，广东广州５１０６３０；４．吉林大学第一医院急诊科，吉林长春１３００２１； ５． 吉林大学中日联谊医院科学研究中心，吉林长春１３００３３；６．南方医科大学，广东广州５１０５１５；７．中山大学肿瘤防治中心麻醉科，广东广州５１００６０；８．华南肿瘤学国家重点实验室广东广州５１００６０； ９． 肿瘤医学省部共建协同创新中心，广东广州５１００６０）摘要：目的　为探讨ｍＴＯＲ信号通路在骨骼发育过程中的机制作用，建立骨骼发育相关的ＴＳＣ１转基因小鼠， 提供稳定的动物模型。方法　取８周龄健康清洁级ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠分别与肢芽干细胞特异性重组酶（Ｐｒｘ－１－Ｃ ｒｅ）小鼠、软骨细胞特异性重组酶（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）小鼠及成骨细胞特异性重组酶（Ｏｓｘ－Ｃ ｒｅ）小鼠进行杂交。将繁殖出的小鼠继续与ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠回交，并对其子代小鼠的基因型进行鉴定及ｍＴＯＲ活性检测。结果　杂交后分别获得肢芽 干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠和成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠各８只。与正常组 比较，上述３种转基因小鼠ｐ－ Ｓ６均比正常组升高（Ｐ＜０．０５）。结论　本实验成功应用Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统构建肢芽干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠，均提示ｍＴＯＲ活性增高， 有明显ＴＳＣ１敲除效果，为ｍＴＯＲ信号通路研究骨与软骨发育的机制作用提供实验基础。 关键词：基因敲除小鼠；骨发育；Ｔ ＳＣ１；ｍＴＯＲ信号通路中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：Ａ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇ ｅｎｉｃ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ＷＡＮＧ　Ｈｏｎｇ１，２，３，ＪＩＡＮＧ　Ｌｉ４，ＷＡＮＧ　Ｙａｎ５，ｅｔ　ａｌ．（１．Ｔｈｅ　Ｔｈｉｒｄ　Ａｆｆ ｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｃａｄｅｍｙ　 ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｏｒｔｈｐａｅｄｉｃ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇ　ｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；４．Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　 Ｊｉ　Ｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；５．Ｃｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ　Ｕｎｉｏｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　 Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００３３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊ ｅｃｔｉｖｅ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｓ　ａｉｍｅｄ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ａｂｏｕｔ　ｂｏｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ　ｔｏ　ｐｒｏ－ｖｉｄｅ　ａ　ｓｔａｂｌｅ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　 ｉｎ　ｂｏｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ　ｈｅａｌｔｈｙ　 ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ　ｍｉｃｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ　ｗｉｔｈ　ｌｉｍｂ　ｂｕｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｐｒｘ－１－Ｃｒｅ）ｃｈｏｎｄｒｏ－ｃｙ ｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｏｓｘ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ．Ｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ａｒｅ　ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ　ｔｏ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ　ｗｉｔｈ　ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ　ｍｉｃｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍＴＯＲ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　 ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｏｆｆ－ｓｐｒｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ｉｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　 ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｆｔｅｒ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｗｅ　ｏｂｔａｉｎ　８ｌｉｍｂ　ｂｕｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ．Ａｎｄ　ｐ －Ｓ６ｏｆ　ｔｈｏｓｅ　３ｔｒａｎｓ－ｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ｉｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｌｉｍｂ　ｂｕｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｐ ｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ａｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｂｙ　 Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｙ　ｓｈｏｗ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈ　ｍＴＯＲ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ　ｈａｖｅ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　ｅｆｆｅｃｔ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ　 ａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙ　ａｂｏｕｔ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｂｏｎｅ　ａｎｄ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｂｙ　ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　 ｐａｔｈｗａｙ．Ｋｅｙ　 ｗｏｒｄｓ：Ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ；ｂｏｎｅ　ａｎｄ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ＴＳＣ１；ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇ ｎ，２０１９，２３：１２３９） 结节性硬化复合物１（Ｔｕｂｅｒｏｕｓ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　 ｃｏｍ－ｐ ｌｅｘ１，ＴＳＣ１），是人类的一种抑癌基因，与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Ｔｈｅ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｒａｐ ａｍ－ｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）有着密切的联系。目前研究发现，ｍＴＯＲ能整合细胞内外各种信号，是机体与细胞感受营养的信号通路［１］。ＴＳＣ１位于ｍＴＯＲ信号通路的上游，对ｍＴＯＲ有一定抑制作用。既往研究主要集中ｍＴＯＲ信号通路对心脑疾病及肿瘤发病机制的探讨，而近期实验发现ｍＴＯＲ信号通路在骨骼— ９３２１—中国实验诊断学　２０１９年７月　第２３卷　第７期

课题_基因敲除小鼠的pcr鉴定

一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），

利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程

用CRISPR Cas9方案构建双基因敲除鼠, 获得双基因敲除纯合子小鼠的交配方案

双基因敲除小鼠繁殖工作： CRISPR/Cas9方案构建双基因敲除鼠，得到F0杂合子之后，如何建系才能获 得双基因敲除纯合子小鼠？这是经常被问到的问题，下面就简单回答一下。 假设我们的目的基因为A和B，通常用CRISPR/Cas9方法得到的基因敲除鼠 为杂合子，双杂合子小鼠基因型为AaBb，大写字母代表野生型（dominant），小写字母代表突变型（recessive）。得到F0杂合子（AaBb）之后，可以用 以下方案之一来获得双基因敲除纯合子小鼠： 方案一： 1.将双杂合子小鼠（AaBb）与野生鼠（AABB）交配，理论上将得到25%的 野生型（AABB），25%基因A单杂合子（AaBB）,25%基因B单杂合子 （AABb）及25%双杂合子小鼠（AaBb）。 2.将所得到的双杂合子小鼠（AaBb）互交（inter-cross），理论上6.25% 的后代将会是双基因敲除纯合子小鼠（aabb），见下图。

3.由于双基因敲除实验中一般都需要单基因敲除动物作为对照，所以在 进行上面小鼠breeding的同时可以将基因A单杂合子（AaBB）互交， 在后代中鉴定出基因A纯合子（aaBB）,同样将基因B单杂合子（AABb）互交，在后代中鉴定出基因B纯合子（AAbb）。 方案二： 将双杂合子小鼠（AaBb）与单基因纯合子（如aaBB）交配，所生小鼠 中约25%为基因A纯合子而基因B杂合子（aaBb,见下图左）。然后将 aaBb小鼠互交，理论上后代小鼠中25%为双基因敲除纯合子小鼠 （aabb），见下图右。 需要特别注意的几个问题： 1)上面所讲的方法适用于位于不同的染色体两个基因的基因敲除，如 果两个基因位于同一条染色体上，要通过上述方法得到双基因敲除 纯合子小鼠很难； 2)上述方法有赖于基因特异性的Genotyping PCR assays。在开始set up breeding之前必须将两个目的基因特异性的Genotyping PCR assays 准备好； 3)要事先研究一下目的基因敲除后有无胚胎致死性，是否影响其生长 发育等。当然单基因敲除无胚胎致死性并不表示双基因敲除无胚胎 致死性。

基因敲除小鼠的制作方法

一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。