嗜水气单细胞菌转录调控蛋白基因(ahyR )突变株的构建及特性分析

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2006,14(1):55~59

*基金项目:国家自然科学基金(No.30400332)和教育部科学技术计划重点项目(No.105091)资助。毕志香：女，1979年生，硕士研究生。

**通讯作者。Author for correspondence.E-mail:.

收稿日期：2005-01-18接受日期：2005-05-16·研究论文·

嗜水气单胞菌转录调控蛋白基因()突变株的构建及特性分析*

毕志香刘永杰**

(南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京210095)

摘要:根据GenBank公布的嗜水气单胞菌(,Ah)转录调控蛋白基因序列设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增Ah J-1株的部分片段。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经序列测定后定向连接入含有卡那霉素抗性(Kan r)基因的自杀性质粒pJP5603中,构建重组质粒pJP-。将鉴定为阳性的重组质粒转化嗜水气单胞菌J-1株感受态细胞,获得1突变株细菌。PCR方法鉴定该突变株为J-1株基因同源突变株,命名为J-1△。与J-1株相比,突变株的外膜蛋白图谱和部分生化特性发生改变;胞外蛋白酶、淀粉酶、DNA酶、溶血素等几种主要毒力因子同时丧失;致病力明显降低,对小白鼠的半数致死量大于1.0×108CFU(colony forming units)。该研究为基因功能的探讨及嗜水气单胞菌弱毒疫苗的研制奠定了基础。

关键词：嗜水气单胞菌;基因;同源重组;突变株构建

中图分类号:S182S188文献标识码:A文章编号:1006-1304(2006)01-0055-05

Construction and Characterization of Transcriptional Regular Protein

Gene()Mutant Strain of

BI Zhi-Xiang LIU Yong-Jie

**

According to the relevant nucleotide sequence from GenBank,a pair of specific primers was designed to amplify the partial fragment of gene from(Ah)J-1strain by PCR.The PCR product was cloned into pMD18-T vec-tor,and after sequencing,ligated into the suicide plasmid pJP5603which contains a Kan resistant gene to get a recombinant plasmid pJP-.A mutant strain was obtained after the positive recombinant plasmid was transformed into the J-1strain.On the basis of PCR,an gene homologous recombinant mutant strain named J-1△was https://www.wendangku.net/doc/a82431999.html,pared with Ah J-1strain,outer membrane protein profiles and some biochemical characters of the mutant strain had changed,and some genes of main virulent deter-minants could not be expressed,such as proteases,amylase,DNase and hemolysin.In addition,the pathogenicity capability was great-ly decreased and the50%lethal dose for mice was more than1.0×108CFU(colony forming units).The experimental results will apply

a basis for studying gene function and developing the attenuated vaccine

against

;gene;homologous recombination;construction of mutant strain

嗜水气单胞菌(，Ah)是引起水产动物疾病的重要病原菌，给水产养殖业造成极大的经济损失，同时也能引起人类的感染，在公共卫生上占有重要地位(Altwegg and Geiss,1989)。该菌的致病性与其产生多种毒力因子有关，毒力因子主要有胞外蛋白酶、溶血素、肠毒素、乙酰胆碱酯酶等(Pemberton,1997)。其中溶血素和胞外蛋白酶是主要的毒力因子（凌红丽等，1999）。有研究表明，转录调控蛋白基因调控胞外蛋白酶的产生(Swift.,1997)。为探讨Ah基因功能，本实验利用自杀性质粒构建了Ah J-1株基因的突变株，并分析了该突变株的主要生物学特性，为Ah

农业生物技术学报2006年

弱毒疫苗的研制鉴定了基础。

1材料和方法

1.1菌株、质粒与试剂

大肠杆菌()cc118λpir(Kan敏感菌)、自杀性质粒pJP5603（含有基因）均由上海交通大学严亚贤惠赠；大肠杆菌DH5α为本实验室保存；嗜水气单胞菌(，Ah)J-1株由本实验室分离(陈怀青和陆承平，1991)，所有细菌的培养条件为LB液体或LB固体培养基(Sambrook and Russell,2002)，大肠杆菌37℃培养，嗜水气单胞菌28℃培养。胶回收试剂盒及各种工具酶均购自大连宝生物公司。

1.2引物设计

根据GenBank公布的Ah基因的核苷酸序列，利用Primer5.0设计1对特异性引物，扩增该基因的部分片段，从73~728位核苷酸之间656bp 片段，由上海博亚有限公司合成。为了便于基因的克隆及重组质粒的构建，在上、下游引物5'端分别加入RⅠ和HⅠ酶切位点,引物为：

上游引物P1：5'-TAGGATCCTCGGTTCACGCTCGGTATGG-3'；

RⅠ

下游引物P2：5'-TGGAATTCACTGCTCACCCCCCTTGGC-3'。

HⅠ

1.3Ah J-1株基因组的提取

参照梁国栋(2001)方法进行。

1.4基因部分片段的扩增和序列测定

以1.3提取的J-1株基因组为模板，利用引物P1和P2扩增目的基因,扩增参数为95℃预变性5min；94℃1min，58℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳。将回收的PCR产物克隆入pMD18-T载体，挑取单菌落，在含有50μg/mL Amp(氨苄青霉素)的液体LB培养基中培养16h，小量法提取质粒(Sambrook and Russell,2002),用RⅠ和HⅠ酶切鉴定。将鉴定为阳性的菌液培养物送上海博亚有限公司进行序列测定，测序结果用DNAstar分析软件与GenBank公布的序列进行同源性比较。

1.5重组质粒的构建与鉴定

扩增片段及质粒载体的双酶切按常规方法操作。用胶回收试剂盒回收载体及目的片段，16℃连接过夜，转化大肠杆菌cc118λpir感受态细胞。挑取单菌落接种含50μg/mL Kan(卡那霉素)的LB液体培养基中，37℃振荡培养10~16h，按碱裂解法提取质粒，用RⅠ和HⅠ酶切鉴定；同时以提取的质粒为模板按1.4所述PCR条件扩增目的片断。

1.6基因同源突变株的构建与鉴定

按Sambrook and Russell(2002)方法大量提取质粒并纯化，将鉴定为阳性的纯化质粒转化Ah J-1株感受态细胞，用含50μg/mL Kan的LB琼脂平板于20℃培养筛选。将48h内生长的菌落定为可疑阳性菌，接种含Kan的LB液体培养基于28℃培养后提取基因组，进行PCR扩增。扩增Kan抗性基因()与嗜水气单胞菌rDNA以验证重组质粒整合进入J-1株的染色体中，目的片段和基因全长的扩增是用来证实重组质粒整合进入基因中。从GenBank中读取各基因的核苷酸序列设计特异性引物，由上海博亚有限公司合成。

1.6.1基因的扩增

上游引物：5'-GCTGGGTATAAATGGGCTCG-3'；

下游引物：5'-TATCCTGG TATCGGTCTGCG-3'。

扩增片段的长度为616bp，扩增参数：95℃预变性5min；94℃1min，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。

1.6.2Ah rDNA的扩增

上游引物：5'-GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3'；

下游引物：5'-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3'。

扩增片段的长度为685bp，扩增参数：95℃预变性5min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。

1.6.3基因部分片段的扩增同1.4。

1.6.4基因全长的扩增

上游引物：5'-TCAGATGTCTCCATTTCAGTGTT-3'；

下游引物：5'-CCATGACTGTCAATTGCAGGATC-3'。

扩增片段的长度是912bp，扩增参数：95℃预变性5min；94℃1min，48℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。

1.7突变株的主要生物学特性分析

1.7.1主要生化特性分析参照姚火春(2002)方法进行。

1.7.2胞外产物的检测将待检细菌分别接种在含1.5%脱脂乳、0.2%淀粉（菌落形成后在平板上滴加鲁哥氏碱液，以铺满菌落周围为宜，然后观察）、0.1%DNA外加0.5%甲基绿和5%兔鲜血的LB平板上，培养24h后，观察菌落周围是否出现无色的透明圈，以确定菌体是否产生胞外蛋白酶、淀粉酶、DNA酶以及溶血素等毒力因子。

56

1.7.3外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)图谱分析参照孙建和等(1999)的方法进行。

1.7.4半数致死量（）的测定将J-1株及突变株细菌28℃的培养物4℃8000离心10min，弃上清，用生理盐水悬浮至原体积，菌液的浓度为5×109，连续10倍稀释至10-6，每个稀释度0.2mL，分别腹腔注射健康小鼠，每组5只，观察记录7d内死亡数，并根据Reed-Muench法计算出(Reed and Muench,1938)。接种前采小鼠血清做菌体凝集试验，Ah的凝集抗体滴度为0。

2结果

2.1基因部分片段的PCR扩增及序列测定

如图1所示，PCR扩增得到656bp的目的片段。序列测定结果显示该片段与GenBank登录的Ah基因(登录号X89469)的同源性为98%。

图1.基因的PCR扩增

Fig.1.Amplification of Ah gene

1,DNA marker(DL2000);2,partial fragment of gene.

2.2重组质粒的鉴定

如图2所示，提取的质粒用RⅠ和HⅠ双酶切后得到656bp的目的片段与3.0kb大小的载体质粒，同时PCR扩增可得到656bp大小的片段。可见重组质粒中已嵌入目的基因，定名为pJP-。

2.3基因同源突变株的鉴定

由图３可知，从一突变株的染色体上扩增得到616bp，说明重组质粒已存在于J-1株的染色体上，扩增得到基因656bp的部分片段但是没有扩增出其全长片段，证明重组质粒同源整合入J-1株染色体基因中，引起基因突变，将该突变株命名为J-1△。2.4生化特性分析

突变株与亲本株(J-1株)的部分生化特性有差别，从表1中可以看出，同J-1株相比，突变株丧失发酵麦芽糖、甘露醇和蔗糖的能力，同时产脲酶、精氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶的能力也丢失。

图2.重组质粒pJP-的鉴定

Fig.2.Identification of the recombinant plasmid pJP-

1,DNA marker(DL15000);2,recombinant plasmid pJP-

digested by RⅠand HⅠ;3,identification of recombinant plasmid pJP-with PCR;4,DNA marker(DL2000).

图3.突变株J-1△的鉴定

Fig.3.Identification of the mutant strain J-1△

1,10,DNA marker(DL2000);2,3,full length of Ah gene;4, 5,partial fragment of Ah gene;6,7,Ah rDNA gene;8,9, gene.3,5,7,J-1strain genome as template;2,4,6,8,mutant strain genome as template;9,pJP5603as template.

2.5胞外产物分析

在含1.5%脱脂乳、0.2%淀粉、0.1%DNA和5 %兔鲜血的4种LB平板上，菌落周围都没有出现无色的透明圈，表明突变株产胞外蛋白酶、淀粉酶、DNA酶和溶血素的能力都丧失。

2.6株外膜蛋白(OMP)的图谱分析

突变株的OMP图谱与J-1株有差别，J-1株的

主要

OMP

条带有31、38、43和50kD，而突变株J-1

农业生物技术学报2006年

△的缺少31和43kD(图4)。2.7

的测定

J-1株对小白鼠的50为2.5×106

CFU(colony forming units)，而突变株对小白鼠的50大于1.0×108CFU ，说明突变株J-1△已失去毒力(Lenug and Stevenson ，1988)，见表2。

表1J -1株与突变株生化特性的比较

Table 1Comparison of biochemical characters between J-1and

mutant strain

+,positive ;-,negative .

图4.突变株和J-1株外膜蛋白(OMP)的SDS-PAGE Fig.4.Outer membrane protein(OMP)SDS-PAGE

of mutant and J-1strain

1,protein marker ;2,J-1△

;3,J-1strain.

3讨论

本实验构建的自杀性重组质粒pJP-含有

基因和基因的部分片段，

将其转化亲本株J-1感受态细胞时，所含有的基因的部分片段与亲本株染色体上同源的片段可发生同源重组，

基因被随之带入亲本株的染色体中，使得突变株具有Kan 抗性，所以理论上转化后能在含Kan 的LB 琼脂平皿上生长的菌落只能是发生染色体重组

的突变株。为了对突变株作进一步鉴定，

采用PCR 扩增的方法，即扩增出

基因而扩增不出基因全长的突变株即是所要的突变株。

表2Ah J -1和J -1△对小白鼠的计算

Table 2Calculations of

on strain Ah J-1

and J-1△

for mice

大量的事实证明胞外蛋白酶是嗜水气单胞菌主要的毒力因子。有研究显示，若蛋白酶表达较早，机体就会产生有效的防御机制以抵制病原菌的侵入，感染就会中止，因此蛋白酶活性的调节是很重要的(Swift .,1999)。嗜水气单胞菌基因突变会阻止其产生C4-HSL (N-丁酰高源丝氨酸内酯)，反过来减少蛋白酶的产生(Swift .,1997)。本实验利用自杀性重组质粒pJP-插入诱变AhJ-1株

的基因，构建该基因的突变株J-1△，其主要胞外分泌产物蛋白酶、溶血素、淀粉酶、DNA 酶等毒力因子同时丧失，说明基因与嗜水气单胞菌的许多毒力因子的表达有关。突变株的生化特

性与J-1株相比也发生变化，其发酵某些糖，

如麦芽糖、甘露醇和蔗糖等和产某些酶，如脲酶、精氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶等的能力丧失。

Marsden .(1996)将杀鲑气单胞菌的

基因缺失，构建了减毒活疫苗，

进一步研究发现，这

乳糖Lactose 麦芽糖Maltose 甘露醇Mannitol 蔗糖Sucrose 阿拉伯糖Arabinose 蕈糖Funguse

西蒙氏枸橼酸钠Citrate 硫化氢H2S 尿素Urea 七叶苷Aeskulin

精氨酸脱羧酶Arginnine decarboxylase 赖氨酸脱羧酶Lysine decarboxylase

-+++++

--+++

+

----++---+--注射细菌数/CFU ·0.2mL -1死亡小白鼠数Number of injected bacteria Number of mice that died 10810710610510410

3

5433002.5×10

6

000000＞1.0×108

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种活疫苗主要通过刺激鱼体的Ｔ细胞增殖而引起细胞免疫，减毒活疫苗对鱼体的保护率明显高于灭活疫苗。这种在核酸水平上缺失毒力相关基因的方法将成为发展活疫苗的理想途径。作者构建的突变株J-1△对小白鼠没有致病性，是否可以作为有效的弱毒活疫苗，有待进一步的研究。

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基因突变的检测方法

基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。

(3)理解基因突变的检测方法

第十章基因突变 一、教学目的与要求： （1）了解基因突变的类型和性质、特征 （2）掌握基因突变分子机理和诱变因素的作用方式 （3）理解基因突变的检测方法 (4) 掌握基因突变的修复途径 二、教学重点、难点、疑点： 1.突变的概念、类型和性质 2.诱发突变的分子基础 3.诱发突变与人类癌症 4.生物体基因突变的修复机制 5.果蝇基因突变的检出 6.植物基因突变的检出 7.人类基因突变的检出 [解决方法] （1）通过出示基因结构变化的示意图，加深学生对基因突变内涵的理解。 （2）课堂教学中不断提出问题，让学生通过概念的运用达到巩固概念和知识迁移的目的。 2．教学难点及解决办法 基因突变的原因。 [解决办法] 对人类镰刀型细胞贫血症病因结合图解进行分析，使学生真正明白基因突变的原因——DNA复制过程也可能发生差错，基因中个别碱基的变化，就会造成性状改变。 3．教学疑点及解决办法 为什么说基因突变是变异的主要来源？ [解决办法]讲明基因突变与基因重组的区别，联系实际举例。 三、教学方法设计： 四、教具或教学手段：多媒体课件 五、教学过程与板书设计：

第一节基因突变的概念和特征 一、基因突变的概念及类别 1、基因突变：指在染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变基因突变：指染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变 2、类别 隐性突变：A a 显性突变：a A 自发突变—外界环境条件的自然作用或生物体内的生理生化变化而产生的突变 诱发突变—在专门诱变因素影响引起的突变，为“诱发突变” 形态突变型—可见突变：指造成外形改变的突变型 至死突变型—能造成个体死亡或生命力明显下降的突变型 条件突变型—在一定条件下有致死效应 3.一般特征 ①突变的频率：指生物体在每一世代中发生突变的机率，或者在一定时 间内突变可能发生的次数。 高等植物 10-5— 10-8 细菌和噬菌体 10-4—10-10范围大、突变频率比动植物高 例如：氨基酸过程中三种疾病是由三种基因突变导致酶发生变化引起的，有一定的突变频率 苯丙氨酸羟化酶缺乏导致苯丙酮尿症；尿黑尿酸氧化酶缺乏会产生尿黑酸尿症；酪氨酸酶缺乏导致白化病 苯丙氨酸羟化酶 苯丙酮酸苯丙氨酸酪氨酸 积累尿黑尿酸氧化酶 酪氨酸酶 苯丙酮尿症尿黑酸黑色素

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基因突变的鉴定

基因突变的鉴定 (2010-07-05 17:37:50) 转载▼ 标签： 杂谈 一．植物形态突变的鉴定 经人工诱发或自然发生的变异是否属于真实的基因突变，是显性突变还是隐性突变，突变频率的高低等，都应进行鉴定。 1．真实遗传变异的鉴定 变异有可遗传的变异，有不可遗传的变异。基因本身发生化学性质的变化而引起的变异是可以遗传的，因环境条件而导致的表现型变异是不遗传的。所以，在诱变处理材料的后代中一旦发现与原始亲本不同的变异体，首先要鉴定它是否真实遗传。例如，在农作物诱变育种过程中，某种高杆植物经理化因素处理后，在其后代中发现个别矮杆植株，这种变异究竟是基因突变引起的呢？还是由环境条件引起的呢？二者如何鉴别呢？ 把变异体与原来的亲本种植在土壤条件和栽培条件均匀一致的环境下，若变异体与原始亲本的表现大体相似，即原来的变异消失了，说明它不是遗传的变异；反之，若变异体与原始亲本不同，仍然表现为矮杆，说明它是基因突变的结果。 2．如何鉴别显性突变和隐性突变 利用杂交试验的方法，可以区分显性突变还是隐性突变。以上例而言，让矮杆突变体植株与原始亲本杂交，若F1表现高杆，F2中既有高杆，也有矮杆植株，说明矮杆突变是隐性突变。若是显性突变情况又如何呢？F1表现为矮杆，F2中矮杆：高杆为3：1。 3．利用花粉直感现象估算配子的突变率 为了测定玉米子粒非甜籽变为甜粒（Su→su）的基因突变频率，以甜粒玉米纯合体作母本，用经诱变处理过的非甜粒纯合体的花粉授粉。 susu×SuSu 在正常情况下，非甜（Su）对甜(su)为显性，授粉后的果穗应该完全是非甜粒种子，假如在果穗上发现甜粒种子，就可以认为是Su花粉经诱发处理以后发生了Su→su突变，并可计算出突变频率。

5.1基因突变和基因重组练习试题

第五章第1节基因突变和基因重组 (45分钟100分) 一、选择题(包括10小题,每小题5分,共50分) 1.下列关于基因突变的叙述中,正确的是( ) A.基因突变一定能引起性状改变 B.亲代的突变基因一定能传递给子代 C.等位基因的产生是基因突变的结果 D.DNA分子结构的改变都属于基因突变 2.谷胱甘肽(GSH)是普遍存在于生物体内的一种重要化合物。下表为GSH的密码子和氨基酸序列及控制合成GSH的DNA突变后所对应的密码子和氨基酸序列,则下列有关突变原因的叙述正确的是( ) A.增添 B.缺失 C.改变 D.易位 3.(2013·泰安模拟)某个婴儿不能消化乳类,经检查发现他的乳糖酶分子有一个氨基酸改换而导致乳糖酶失活,发生这种现象的根本原因是( ) A.缺乏吸收某种氨基酸的能力 B.不能摄取足够的乳糖酶 C.乳糖酶基因有一个碱基改换了 D.乳糖酶基因有一个碱基缺失了 4.如图为某二倍体生物精原细胞分裂过程中,细胞内的同源染色体对数的变化曲线。基因重组最可能发生在( )

A.AB段 B.CD段 C.FG段 D.HI段 5.据报道,加拿大科学家研究发现选择特定的外源DNA(脱氧核糖核酸)片段并将其嵌入到细菌基因组的特定区域,这些片段便可作为一种免疫因子,抵抗DNA裂解酶入侵,此项技术有望解决某些细菌对抗生素产生抗药性的难题。这种技术所依据的原理是( ) A.基因突变 B.基因重组 C.染色体变异 D.DNA分子杂交 6.(能力挑战题)(2013·长沙模拟)如图为雌性果蝇体内部分染色体的行为及细胞分裂图像,其中能够体现基因重组的是( ) A.①③ B.①④ C.②③ D.②④ 7.农业技术人员在大田中发现一株矮壮穗大的水稻,将这株水稻所收获的种子再种植下去,发育成的植株之间总会有差异,这种差异主要来自( ) A.基因突变 B.染色体变异 C.基因重组 D.细胞质遗传 8.(2013·温州模拟)已知家鸡的无尾(A)对有尾(a)是显性。现用有尾鸡(甲群体)

基因突变和基因重组教学设计

《基因突变和基因重组》的教学设计 一、教材和学情分析 本节课内容包含了两种可遗传变异基因突变和基因重组，而基于前面已经学习了自由组合定律和减数分裂知识，学生们对于基因重组已经有了一定的了解，在这个知识点处理上应注重对学生实际理解能力和图形分析能力的培养，通过实践提高学生的认知能力。这节课的重点和难点就集中于基因突变这个知识点，要通过多种途径来加深对基因突变的内涵和外延的理解。 二、教学目标及重难点 知识目标 1.结合实例.模型.游戏等方法从分子水平（碱基对替换.增添.缺失）分析基因突变发生的时间，内因，推导出基因突变概念。 2. 分析基因突变发生在体细胞和生殖细胞时对其控制合成的蛋白质.对性 状与子代的影响。 3.基因突变的产生外在原因.特点及意义。 4.掌握基因重组的概念.来源.意义，会辨别不同情况下的基因重组。 能力目标 1.结合减数分裂过程，学会用图示形式表示发生基因重组的原因，培养学生的作图和识图能力。 2.借助示意图的观察和对问题的思考，提高学生判断.推理等能力。

3.通过游戏、模型演示推出基因突变概念的过程，锻炼学生们合作探究的能力。 情感态度价值观目标 1.通过分析引起基因突变的外部原因培养学生正确的生活态度，珍惜爱护生命。 2.认同基因简并性保持生物性状稳定性的意义，以及基因突变.基因重组对生物多样性形成的积极意义。 重点 1.基因突变发生的概念.原因及特点。 2.基因重组的来源以及减数第一次分裂后期和交叉互换后对应的的基因变化图。 难点 基因突变及基因重组的意义。 三、教学方法及教具 针对教学内容和教学目标，选择的教学方法为：情境教学法.问题教学法.小组讨论法.学生分析归纳法。 教学流程大体为：提出问题──观察现象──分析探索──得出结论。针对学生的认知规律，由熟悉到陌生，我对教材做了调整，先学习基因重组，再进行基因突变的学习。 教具：多媒体.游戏纸条.磁条（制成基因碱基对）

肿瘤基因突变检测

肿瘤基因突变检测 癌症是一类难以预防的疾病，中晚期癌症治愈的可能性又很小，而早期癌症的治愈率可达65%以上，有些肿瘤可达90%以上，因此，战胜癌症的关键是早期发现癌症。由于癌症早期常无特殊症状，甚至毫无症状，故癌症的早期发现、早期诊断主要是通过定期健康体检和人群筛查完成。目前筛查癌症的方法主要是通过化验血肿瘤指标及B超、CT、MRI、PET-CT 等检查，但这些方法的敏感性和特异性均不高，发现有异常时往往已是中晚期。 17种常见高发肿瘤，包括乳腺癌（breast cancer）、结肠癌（colorectalcancer）、子宫癌（endometrial cancer）、脑胶质瘤（glioma）、白血病（leukemia）、肺癌（lungcancer）、淋巴癌（lymphoma）、成神经管细胞瘤（medulloblastoma）、黑色素癌(melanoma)、间皮瘤(mesothelioma) 、多性骨髓瘤(multiple myeloma) 、卵巢癌(ovarian cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer) 、真性红细胞增多(polycythemia vera) 、前列腺癌(prostatecancer) 、肾细胞癌(renal cell cancer)和恶性内瘤(sarcoma)，其发病机制涉及与多种肿瘤发生共同相关的肿瘤易感基因群介导的分子改变，参与了肿瘤发生的早期分子事件。系统寻找和探讨它们在肿瘤发生发展过程中的遗传学变异，对阐明肿瘤早期发生机制及寻找肿瘤早期预警、早期诊断和早期治疗的分子靶标都具有重要的现实意义。利用高通量分子测序技术平台，可同时开展多个肿瘤基因突变检测项目，如EGFR、K-RAS 、N-RAS、B-RAF、PI3K 、p53、p16、BRCA1、

新教材人教版必修第二册 5.1 基因突变和基因重组 学案

第5章基因突变及其他变异 第1节基因突变和基因重组 课堂互动探究案 课程标准 概述碱基的替换、增添或缺失会引发基因中碱基序列的改变阐明基因中碱基序列的改变有可能导致它所编码的蛋白质 及相应的细胞功能发生变化，甚至带来致命的后果 描述细胞在某些化学物质、射线以及病毒的作用下，基因突变概率可能提高，而某些基因突变能导致细胞分裂失控，甚至发生癌变 阐明进行有性生殖的生物在减数分裂过程中，染色体所发生的自由组合和交叉互换，会导致控制不同性状的基因重组，从而使子代出现变异 素养达成 1．阐明基因突变导致遗传物质的改变，可能引起生物性状的改变。认同基因突变为生物进化提供原材料的观念。(生命观念) 2．通过归纳与概括总结基因突变的特点与意义。(科学思维) 3．结合减数分裂的过程图解，理解基因重组的类型。(科学思维) 4．举例说明基因突变和基因重组在育种、人类遗传病等方面的应用，运用基因突变的原理解释一些变异现象。(社会责任)。 大熊猫的正常颜色是黑白色，科学家在野外偶然发现了一只棕白色大熊猫，经研究发现是由于基因突变引起的。请思考下列问题： (1)什么是基因突变？ (2)引起基因突变的因素是什么？ (3)基因突变的特点是什么？

探究点一基因突变 【师问导学】 一、基因突变的实例 1．阅读教材P80－81实例内容，探讨下列问题： (1)基因突变一般发生在细胞分裂的什么时期？ (2)结合DNA分子的结构特点和复制过程，分析DNA分子复制时容易发生基因突变的原因。 (3)产生镰状细胞贫血的根本原因是什么？变化后导致血红蛋白基因中碱基种类、数量和排列顺序发生了怎样的变化？ (4)根据上述资料分析可知，基因突变导致基因结构的改变，这种改变具体表现在哪些方面？ 2．基因突变一定会改变遗传信息和生物性状吗？试分析原因。 二、基因突变的原因和特点 1．癌变的原因是由于细胞内抑癌基因和原癌基因发生突变，癌细胞的特点之一是能进行无限增殖，医学上通常使用一定量的化学药剂对癌症病人进行化疗。另一方面接受化疗后的病人身体非常虚弱。 结合基因突变分析并回答下列问题： (1)化疗能够治疗癌症的原理是什么？

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。 突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程

《基因突变和基因重组》习题精选

《基因突变和基因重组》习题精选 1．培育青霉素高产菌株的方法是（） （A）杂交育种（B）单倍体育种 （C）诱变育种（D）多倍体育种 2．自然界中生物变异的主要来源是（） （A）基因突变（B）基因重组 （C）环境影响（D）染色体变异 3．产生镰刀型细胞贫血症的根本原因是（） （A）红细胞易变形破裂 （B）血红蛋白中的一个氨基酸不正常 （C）信使RNA中的一个密码发生了变化 （D）基因中的一个碱基发生了变化 4．人工诱变区别于自然突变的突出特点是（） （A）产生的有利变异多（B）使变异的频率提高 （C）可人工控制变异方向（D）产生的不利变异多 5．下面列举了几种可能诱发基因突变的原因，其中哪项是不正确的（） （A）射线的辐射作用（B）杂交 （C）激光照射（D）秋水仙素处理 6．人类的基因突变常发生在（） （A）减数分裂的间期（B）减数第一次分裂 （C）减数第二次分裂（D）有丝分裂末期 7．人工诱变是创造生物新类型的重要方法，这是因为人工诱变（） （A）易得大量有利突变体 （B）可按计划定向改良 （C）变异频率高，有利变异较易稳定 （D）以上都对 8．一种植物只开红花，但在红花中偶尔出现一朵白花，将白花所给种子种下，后代仍为白花。出现这种现象的原因可能是（） （A）基因突变（B）基因重组 （C）染色体变异（D）基因互换 9．下列属于基因突变的是（） （A）外祖母正常，母亲正常，儿子色盲 （B）杂种高茎豌豆自交，后代中出现矮茎豌豆 （C）纯种红眼果蝇后代中出现白眼果蝇 （D）肥水充足时农作物出现穗大粒多 10．一对夫妇所生子女中，性状差别甚多，这种变异主要来自于（） （A）基因重组（B）基因突变 （C）染色体变异（D）环境的影响 11．如果基因中四种脱氧核苷酸的排列顺序发生了变化，则这种变化叫（） （A）遗传性变化（B）遗传信息变化 （C）遗传密码变化（D）遗传规律变化

高一生物《基因突变和基因重组》知识点归纳

高一生物《基因突变和基因重组》知识点归纳 名词： 1、基因突变：是指基因结构的改变，包括DNA碱基对的增添、缺失或改变。 2、基因重组：是指控制不同性状的基因的重新组合。 3、自然突变：有些突变是自然发生的，这叫～。 4、诱发突变(人工诱变)：有些突变是在人为条件下产生的，这叫～。是指利用物理的、化学的因素来处理生物，使它发生基因突变。 5、不遗传的变异：环境因素引起的变异,遗传物质没有改变，不能进一步遗传给后代。 6、可遗传的变异：遗传物质所引起的变异。包括：基因突变、基因重组、染色体变异。 语句： 1、基因突变 ①类型：包括自然突变和诱发突变 ②特点：普遍性;随机性(基因突变可以发生在生物个体发育的任何时期和生物体的任何细胞。突变发生的时期越早，表现突变的部分越多，突变发生的时期越晚，表现突变的部分越少。);突变率低;多数有害;不定向性(一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因。)。 ③意义：它是生物变异的根本来源，也为生物进化提供了最初的原材料。 ④原因：在一定的外界条件或者生物内部因素的作用下，使得DNA复制过程出现小小的差错，造成了基因中脱氧核苷酸排列顺序的改变，最终导致原来的基因变为它的等位基因。这种基因中包含的特定遗传信息的改变，就引起了生物性状的改变。

⑤实例：a、人类镰刀型贫血病的形成：控制血红蛋白的DNA上一个碱基对改变，使得该基因脱氧核苷酸的排列顺序—发生了改变，也就是基因结构改变了，最终控制血红蛋白的性状也会发生改变，所以红细胞就由圆饼状变为镰刀状了。b、正常山羊有时生下短腿“安康羊”、白化病、太空椒(利用宇宙空间强烈辐射而发生基因突变培育的新品种。)。 ⑥引起基因突变的因素：a、物理因素：主要是各种射线。b、化学因素：主要是各种能与DNA发生化学反应的化学物质。c、生物因素：主要是某些寄生在细胞内的病毒。 ⑦人工诱变在育种上的应用：a、诱变因素：物理因素---各种射线(辐射诱变)，激光(激光诱变);化学因素—秋水仙素等b、优点：提高突变率，变异性状稳定快，加速育种进程，大幅度地改良某些性状。c、缺点：诱发产生的突变，有利的个体往往不多，需处理大量的材料。d、如青霉素的生产。 2、基因突变是染色体的某一个位点上基因的改变，基因突变使一个基因变成它的等位基因，并且通常会引起一定的表现型变化。 3、基因重组： ①类型：基因自由组合(非同源染色体上的非等位基因)、基因交换(同源染色体上的非等位基因)。 ②意义：非常丰富(父本和母本遗传物质基础不同，自身杂合性越高，二者遗传物质基础相差越大，基因重组产生的差异可能性也就越大。);基因重组的变异必须通过有性生殖过程(减数分裂)实现。丰富多彩的变异形成了生物多样性的重要原因之一。 4、基因突变和基因重组的不同点：基因突变不同于基因重组，基因重组是基因的重新组合，产生了新的基因型，基因突变是基因结构的改变，产生了新的基因，产生出新的遗传物质。因此，基因突变是生物产生变异的根本原因，为进

KRAS基因突变的检测及其临床意义

KRAS基因突变的检测及其临床意义 RAS基因家族由KRAS、HRAS 和NRAS组成，基因家族各成员间同源性可达85%。RAS 基因编码p21蛋白，分子量为21KD，位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参于传导细胞增殖信号的调控系统。其激活状态为GTP结合状态，失活状态为GDP结合状态，其转变为活性致癌基因的主要部位是第12、13 和61 密码子的突变，其中以第12 密码子点突变最常见。 RAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因，该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15%-30%，在结直肠癌患者中为20%-50%。作为EGFR信号通路下游最重要的的效应因子，KRAS在肿瘤信号转导中发挥重要作用。对KRAS基因突变的检测，可以为肿瘤患者的个体化治疗提供更确切的依据。 西妥昔单抗和帕尼单抗都是特异性针对人类EGFR胞外区的单克隆抗体。美国FDA批准该药单药用于治疗难治性结肠癌，及在放疗基础上治疗进展性头颈部癌。已知EGFR信号途径下游的基因突变则会使患者对西妥昔单抗和帕尼单抗治疗产生耐药性。2009年7月15日，美国FDA批准了对帕尼单抗和西妥昔单抗的说明书的修改，在西妥昔单抗和帕尼单抗说明书的“适应证和用法”部分明确指出，KRAS基因第12或13密码子突变的患者接受治疗无生存获益；不推荐这两种表皮生长因子受体（EGFR）抗体用于KRAS基因突变的转移性结直肠癌（mCRC）患者治疗。根据这一提示，临床医生可以将KRAS基因突变的患者排除在接受抗EGFR单抗治疗之外，重新安排其接受其他药物替代治疗，避免对不能获益的患者进行不必要的治疗。 此外，研究表明，K-ras基因突变状态与非小细胞肺癌对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关，直肠癌患者中K-ras的突变对西妥昔单抗等药物的耐药性有关。美国国家癌症综合网络(NCCN) 2011年版临床治疗指南指出：K-ras基因突变是EGFR酪氨酸激酶抑制剂疗效的预测指标，肿瘤患者在接受EGFR靶向药物治疗前必须进行K-ras基因突变检测，以帮助决定患者是否接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂类药物（易瑞沙/特罗凯/埃克替尼等）治疗。携带K-ras永久激活性突变的患者本检验所不建议使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂类药物（易瑞沙/特罗凯/埃克替尼等），建议使用靶向的Ras抑制剂药物治疗。 作为RAS/FTI（法尼基转移酶抑制剂）的安卓健通过抑制Ras 的活性，进而影响其下游讯息传递因子，包括抑制PI3K 的表现量与降低Akt 的磷酸化程度；以及活化AMPK促使TSC1/TSC2 结合更紧密，进而大大的降低mTORC1 的活性，开启癌细胞的自噬作用机制；安卓健同时会活化MEK1/ ERK1/2 的路径，促进癌细胞的自噬作用机制；另外，安卓健会使线粒体不稳定，降低Bcl-2、Bcl-XL 与MCl-1 的蛋白质量，使癌细胞程序性凋亡。由于安卓健能同时诱导癌细胞启动自噬作用与程序性凋亡的机制，而实验室的细胞毒性测试亦指出安卓健对多数的癌细胞（脑癌、淋巴癌、血癌、肺腺癌、乳癌、肝癌、胰脏癌、胃癌、直肠癌、前列腺癌与膀胱癌等) 都有药用效果。 上海佳辰投资发展有限公司联合上海张江转化医学研发中心研发K-ras基因突变检测，详细如下： 检测内容：K-ras基因突变 检测方法：ARMS法 主要材料：ABI荧光定量试剂盒 主要设备：ABI 7500荧光定量PCR仪 检测项目和样本类型：

《基因突变与基因重组》说课稿

《基因突变和基因重组》说课稿 一、教学背景分析。 1.教材内容、地位及学情分析 本节是人教版普通高中标准实验教科书生物必修2《遗传与进化》的第五章《基因突变及其他变异》的第一节内容。通过前面各章的学习，学生对“基因是什么”、“基因在哪里”和基因如何起作用“等问题已有了基本的认识。本章内容既是对前四章内容合乎逻辑的延续，又是学习第六章《从杂交育种到基因工程》和第七章《现代生物进化理论》的重要基础。 本节介绍了基因突变，从实例入手，通过对镰刀型细胞贫血症的分析，引入基因突变的概念，然后详细阐述基因突变的原因和特点、意义。本节内容引导学生从分子水平上理解遗传物质如何引起基因突变的。 学生对于生物变异的现象并不陌生，通过初中生物课的学习学生已初步认识到生物变异首先与遗传物质有关，其次与环境有关，本节内容在此基础上，进一步引导学生学习遗传物质究竟是如何引体生物变异 2.教学目标 1、知识目标： （1）举例说明基因突变的概念。 （2）举例说明基因突变的特点和原因。 （3）说出基因突变的意义。 2、能力目标： （1）通过对课本中实例的分析，培养学生分析归纳总结的逻辑推理能力。 （2）通过学生之间相互启发、相互补充、激发灵感，提高学生合作—探究的能力。 3、情感目标： （1）通过生物变异的事例，增强学生对生物世界探究的好奇心及保护意识，培养学生们严谨的科学态度和热爱科学的兴趣。 （2）引领学生进入“自主—合作—探究”新课程理念氛围，让学生真正成为学习的主人。 3.教学重点、难点 （1）教学重点 基因突变的概念、特点及原因。 （2）教学难点 基因突变的意义。 二、教学展开分析 1.教具准备 实物投影仪、电脑演示教学软件 2.课时安排 1课时 3.教学方法和手段 利用多媒体课件，创设形象生动的教学氛围；同时应用讲述法、谈话法、指导读书法

7基因重组和基因突变

2016-2017学年度基因重组和基因突变学校:___________姓名：___________班级：___________考号：___________ 一、选择题 1．某红眼（A）、正常刚毛（B）和灰体色（D）的正常果蝇经过人工诱变产生基因突变，下图表示该突变个体的X染色体和常染色体及其上的相关基因．下列叙述错误的是（） A．人工诱变常用的物理方法有X射线、紫外线辐射等 B．如图可知控制果蝇的眼色、体色及刚毛类型的三对等位基因，在减数分裂过程中都遵循基因的自由组合定律 C．基因型为ddX a X a和DDX A Y的雌雄果蝇杂交，F1果蝇的基因型及其比例是DdX A X a：DdX a Y=1：1 D．若只研究眼色，白眼雌果蝇与红眼雄果蝇杂交，F1雌雄果蝇的表现型及其比例是雌性红眼：雄性白眼=1：1 2．下列关于基因重组和染色体畸变的叙述，正确的是（） A．不同配子的随机组合体现了基因重组 B．染色体倒位和易位不改变基因数量，对个体性状不会产生影响 C．通过诱导多倍体的方法可克服远缘杂交不育，培育出作物新类型 D．孟德尔一对相对性状杂交实验中，F1紫花植株自交后代发生性状分离的现象体现了基因重组 3．2015年诺贝尔化学奖颁给了研究DNA修复细胞机制的三位科学家．纳米科技是跨世纪新科技，将激光束的宽度聚焦到纳米范围内，可对人体细胞内的DNA分子进行超微型基因修复，有望把尚令人类无奈的癌症、遗传疾病彻底根除，这种对DNA进行的修复属于（） A．基因重组 B．基因互换 C．基因突变 D．染色体畸变 4．将两个抗花叶病基因H导入大豆（2n=40），筛选出两个H基因成功整合到染色体上的抗花叶病植株A（每个H基因都能正常表达），植株A自交，子代中抗花叶病植株所 占比例为．取植株A上的某部位一个细胞在适宜条件下培养，连续正常分裂两次， 产生4个子细胞．用荧光分子检测H基因（只要是H基因，就能被荧光标记）．下列叙述正确的是（） A．获得植株A的原理是基因重组，可以决定大豆的进化方向 B．若每个子细胞都含有一个荧光点，则子细胞中的染色体数是40 C．若每个子细胞都含有两个荧光点，则细胞分裂过程发生了交叉互换 D．若子细胞中有的不含荧光点，则是因为同源染色体分离和非同源染色体自由组合 二、综合题 5．果蝇是用于研究遗传学的模式生物，其四对相对性状中长翅（B）对残翅（b）、灰身（D）对黑身（d）、细眼（E）对粗眼（e）、棒眼（H）对圆眼（h）为显性。现有一批果蝇Q为实验材料，其四对染色体上的有关基因组成如左图。

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。 突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适

基因突变和基因重组

淮阳一高高效课堂自主学习型高一生物导学案 高一班姓名：日期：2013-4-29 编号： NO.32 编制人：常娟丽审核人： ____比一比看谁表现最好！拼一拼力争人人过关！ 课题：第四节：基因突变和基因重组 【自研课导学】 预习课（晚自习40分钟）自读自研§4.4基因突变和基因重组。20分钟内完成如下随堂笔记任务。资料准备：教材学法指导： 1．内容： P76-P80基因突变和基因重组内容。 2．学法：认真阅读教材，用笔画出相关内容中的关键字，并注意总结其各自的概念、类型、特点、意义及应用。 3．达成目标：理解掌握基因突变和基因重组的概念、类型、特点、意义；能够说出基因突变和基因重组在育种中的应用。【展示课导学】 展示提升 质疑评价环节总结归纳环节 展示方案（内容·方式·时间30 分钟） 随堂笔记（成果记录·知识生成·同步演练） 展示单元一：基因突变的概念、类型、发生时期、原因、特点、意义、及应用。（7Min）方案预设： 1.书面展示随堂笔记中的填空内容。 2.口头展示合作探究第1-2题。（展示要求：一定要做到脱稿展示）。 在丰富多彩的生物界中，生物的变异是普遍存在的。生物的变异有的仅仅是由于_______________影响造成的，遗传物质__________（是/否）发生改变，这种变异_________（能/否）遗传给后代，我们称为不可遗传的变异；有的则是由于生殖细胞内的________________发生改变而引起的，这种变异性状_________（能/否）遗传给后代，我们称为可遗传的变异，其类型主要包括______________、________________、和_________________（包括____________________和___________________）。 一、基因突变 1．概念：_______________________________________________________________________________。2．类型：__________________和__________________。 3．发生时期： ___________________________________________________________________。 4．传递特点：基因突变若发生在配子中，将遵循遗传规律传递给后代；若发生在体细胞中，一般不能遗传。（但有些植物的体细胞发生基因突变，可通过无性繁殖传递。） 5．原因：①外因：________________（如_______________、________________等）、________________（如_______________、____________等）以及_________________（如_________、__________等）。 ②内因：在自然状态下，____________________偶尔发生错误、___________________发生改变等。6．特点：_____________（在生物界中普遍存在）；______________（可以发生在生物个体发育的任何时期）；_____________（在自然状态下，基因突变的频率是很低的）；____________（一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因）；_______________（基因突变往往是有害的，少数是有利的）。7．意义：①是新基因产生的途径，是_______________________；②是生物进化的___________________。8．实例：镰刀型细胞贫血症 ①直接原因：组成血红蛋白分子的一个______________（其密码子为_________）被替换成了_____________（其密码子为_________）。从而引起蛋白质结构发生了改变。 ②根本原因：由于____________碱基对被替换成了____________碱基对。 9．应用：诱变育种（如青霉素高产菌株的获得）。 【注意】：诱变育种能产生新基因、新性状，但其盲目性大，有利变异少。 【合作探究】1．基因突变包括碱基对的增添、缺失、替换（即改变）三种情况，哪种影响最小？为什么？2．基因突变一定会导致生物性状发生改变吗？为什么？ 【注意】：基因突变能产生新的基因，但基因的数目和位置并未改变。

基因突变和基因重组

基因突变和基因重组

基因突变和基因重组 【课前复习】 在学习新课程前必须复习有关DNA的复制、基因控制蛋白质的合成、表现型与基因型的关系等知识，这样既有利于掌握新知识，又便于将新知识纳入知识系统中。 温故——会做了，学习新课才能有保障1．DNA分子的特异性决定于 A．核糖的种类B．碱基的种类 C．碱基的比例D．碱基对的排列顺序答案：D 2．基因对性状控制的实现是通过A．DNA的自我复制 B．DNA控制蛋白质的合成 C．一个DNA上的多种基因 D．转运RNA携带氨基酸 答案：B 3．下列关于基因型与表现型关系的叙述中，错误的是 A．表现型相同，基因型不一定相同B．基因型相同，表现型一定相同C．在相同生活环境中，基因型相同，表现型一定相同

D．在相同生活环境中，表现型相同，基因型不一定相同 答案：B 4．实现或体现遗传信息的最后阶段是在细胞的哪一部分中进行的 A．线粒体中B．核糖体中C．染色质中D．细胞质中 答案：B 知新——先看书，再来做一做 1．变异的类型有_________和_________两种。后者有三个来源_________、___________、___________。2．基因突变 (1)概念：由于DNA分子中发生碱基对的___________、___________或___________，而引起的基因结构的改变，就叫做基因突变。 (2)实例：镰刀型细胞贫血症 ①根本原因：控制合成血红蛋白的DNA 分子的一个___________发生改变。 ②直接原因：血红蛋白多肽链中___________被___________代替。(3)结果：基因突变使一个基因变成它的___________基因，并且通常会引起—定的___________型的变化。