小鼠抑胃肽ELISA试剂盒实验操作说明书(科润达独家翻译)

小鼠抑胃肽(活性型)ELISA检测试剂盒

实验操作说明书（翻译）

日本IBL

前言简介

肠降血糖素是一类胃肠激素, 当人体进食后,能诱导其体内胰岛β细胞释放胰岛素同时抑制胰高血糖素的释放.

GIP是1970年从肠粘膜分离出来的一种典型的的类GLP-1肠降血糖素,称为抑胃肽,后又更名为葡萄糖依赖性促胰岛素肽.它是由43个氨基酸组成的直链肽，属于胰泌素和胰高血糖素族，分子量为5100，由小肠粘膜的K细胞所产生。据报道,GIP受体在很多种细胞内(如胰腺β细胞, 脂肪细胞, 人成骨细胞)都会表达,对机体细胞内营养物质的储存起着至关重要的作用,同时可通过调节GIP信号改善胰岛素抵抗综合症.

血液中的活性型GIP(1-42)能通过二肽基肽酶IV(DPP-IV)作用迅速地失活为GIP (3-42)

此ELISA检测试剂盒仅用于活性型小鼠抑胃肽(1-42)的检测

原理

此试剂盒运用了两种特异性抗体,洗板后加入TMB底物液显色剂,显色的强度与样品中小鼠活性型抑胃肽的量成正比.

检测范围

7.8 - 500 pg/mL (1.6 - 100 pmol/L)

预期用途

仅供科研用，不能用于诊断用

此IBL试剂盒能用于EDTA-血浆中小鼠活性型抑胃肽(GIP)的定量检测

样品收集后需加入二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂,或用特定的方法,确保抑胃肽的完整性.

试剂盒成分

1 预包被板: 抗GIP (C)兔子IgG,亲合纯化96T x 1

2 酶标记抗体:

(30倍浓缩)HRP标记抗GIP (N) (6A1A)小鼠IgG,亲合纯化0.4mL x 1

3 标准品: 小鼠GIP (1-42) 0.5mL x 2

4 EIA缓冲液: 含1% BSA, 0.05%吐温20 PBS 30mL x 1

5 标记抗体稀释液: 含1% BSA, 0.05%吐温20 PBS 12mL x 1

6 显色剂: TMB底物液15mL x 1

7 终止液: 1N硫酸12mL x 1

8 浓缩洗涤液:

(40倍浓缩) 含1% BSA, 0.05%吐温20 PBS 50mL x 1

操作指南

1实验所需器材(但试剂盒没有提供)

酶标仪(450nm) 微移液管及其吸嘴

量筒及烧杯去离子水

冰箱(4°C) 坐标纸(log/log)

吸水纸试管(用于标准品稀释)

温育箱(37°C ± 1°C)

洗瓶(用于洗板)

一次性试剂管(用于浓缩酶标记抗体和显色剂)

2准备

1)洗涤液的准备

试剂盒的洗涤液是一种40倍浓缩液,用1950 mL稀释50 mL的浓缩洗涤液,制成2000mL即用稀释洗涤液. 置于冰箱内可保存2周.

2)酶标记抗体的准备

试剂盒中的标记抗体是一种30倍浓缩物,根据所需量用标记抗体稀释液稀释.

示例:

如果你用一条板(8孔),就需800 μL.的标记抗体.就用870 μL的标记抗体稀释液稀释30 μL浓缩液,充分混匀.并每孔各加100 μL

浓缩酶标记抗体需稀释后才能用于实验

剩余的稀释标记抗体液需密封瓶装,存于4°C

3)标准品的准备

加0.5 mL的去离子水到瓶装标准品,制成1,000 pg/mL的小鼠GIP标准品液4)标准品的稀释

准备8支试管,并每支各加230 μL EIA缓冲液.稀释成如下浓度,步骤如下图所示:

试管1 500 pg/mL

试管2 250 pg/mL

试管3 125pg/mL

试管4 62.5 pg/mL

试管5 31.3 pg/mL

试管6 15.6 pg/mL

试管7 7.8 pg/mL

试管8 0 pg/mL(样品空白对照)

吸取230ul的标准品液于1号管混匀，然后从1号管吸取230ul加入2号管混匀，如下图所示,按此规律进行2倍比稀释，7支管的浓度范围为7.8 pg/mL－500 pg/mL，第8号管为0 pg/mL作为样品空白对照

5)样品稀释

样品如需稀释时,必须用EIA缓冲液进行稀释

如果样品中小鼠GIP的浓度范围一无所知的话,预先准备几个不同稀释浓度的样品液来确定最佳的检测浓度.

3实验步骤

使用前，将所有试剂应平衡至室温，大约30min，充分混匀，确保试剂质量无改变，标准曲线和样品检测必须同时进行.

试剂待检测样品标准品样品空白试剂空白

检测样品100ul

稀释标准品（1-7

管）100ul

EIA缓冲液（第8

管）100ul

EIA缓冲液

100ul

盖板，于37°C下温育60min

洗板4次

酶标抗

体

100ul 100ul 100ul -

盖板，于4°C下温育60min

洗板5次

显色剂100ul 100ul 100ul 100ul

室温避光温育30min

终止液100ul 100ul 100ul 100ul

加终止液后,30min内于450nm处读取OD值

1）设试剂空白对照，并于相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液

2）确定好样品空白对照孔，检测样品孔和标准品孔，分别将100ul样品对照品(8号管)、检测样品和稀释好的标准品(1-7号管)加入到相应的微孔中。

3）盖板，37°C下温育60min

4）用洗涤瓶或自动洗板机按以下说明洗板4次

倒去孔内反应液,每孔加满稀释洗涤液洗板,再弃去废液.重复洗板4次.在吸水纸上拍干,去除残留液滴.

5）除试剂空白对照孔外,其余每孔各加100ul酶标抗体

6）盖板，4°C下温育60min

7）按照上述步骤4）洗板5次

8）用一次性试管取所需量的显色剂，各加100ul显色剂于微孔中.为了避免污染，勿将剩余试剂在倒回试剂瓶中

9）室温避光温育30min，加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色

10）每孔各加100ul终止液，溶液颜色会变成黄色

11）擦去微孔板底部的污迹或水滴，确保微孔内溶液无气泡产生.加入终止液后30min内于酶标仪450nm处读取结果

特别注意

1)收集样品后即尽快检测. 如需保存, 冻存样品,但要避免反复冻融.检测前,将

样品解冻至室温.

2)如样品需稀释,用EIA缓冲液稀释

3)建议做双份检测

4)保持样品处于中性PH范围.有机溶剂的污染会影响实验结果

5)只能用本试剂盒提供的洗涤液洗板.不充足的洗板会导致错误的结果

6)在吸水纸上拍干去除残留液滴时,切勿用吸水纸刮擦孔内壁

7)显色剂应避光保存并避免与金属物质接触

8)加终止液后,30 min内就应读取实验结果

结果计算

所有实验数据(包括标准品,检测样品的OD值),都应减去样品空白对照的OD值. 在log-log坐标纸用,以较正的OD值为纵坐标,相对应的浓度为横坐标,建立标准曲线. 样品直接在标准曲线上获取浓度值.

标准曲线示范

*上图所示典型标准曲线仅用于演示示范,不能用于试验数据的获取.每次实验都应建立其标准曲线.

常规事项

1所有试剂置于2 - 8°C保存.实验前将试剂平衡至室温(约30分钟)

2瓶装标准品是冻干品,故小心打开瓶盖

3终止液是强酸物质.使用时,避免其接触皮肤和衣肤.

4弃置用过的物质前,用水冲洗

5 浓缩酶标抗体,EIA缓冲液和浓缩洗涤液可能会出现沉淀,但这并不会影响实验6使用试剂后应洗手

7切勿混用不同批号的试剂

8别使用过期的试剂

9试剂盒仅供研究用,不能用于临床诊断.

存储与有效期

存储条件:2 - 8°C

有效期见试剂盒外包装

本译文由深圳科润达独家翻译，仅供参考，详情请以原文为准。

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