电击转化步骤

ATCC17978电转化感受态细胞制备流程及转化方法

第一天：

1. 将ATCC 17978菌株置于2ml LB培养基上，在37°C下过夜培养

2. 高温灭菌大的(250-500ml)锥形瓶，锥形瓶泡酸（浓硫酸），增加清洁度，以备第二天用

3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用

第二天：

4. 转移1ml过夜培养物至装有100ml LB锥形瓶，同时取1ml培养基到1.5ml离心管中（用于测OD值）。

5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时）（这个期间就要制冰，提前半个小时制冰）

6. 定时监控OD600值(培养1小时后每半小时测定一次) ，当od值到0.8时停止培养。（这个时候打开离心机遇冷）

7.随后将菌液分装到50ml 预冷的离心管中，在冰上预冷15-30分钟。

8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟

9. 弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心管，5000g，4℃，离心15min。

7. 弃上清，往离心管中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 5000g, 离心10min。

7. 弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加10ml 10%甘油, 4℃, 5000g, 离心15min。

8. 弃上清，每个离心杯中加入500ul（看菌体浓度，浓度大则多加，浓度小则少加）10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以100ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。（取2份40ul的感受态细菌装在1.5ml离心管中，0.1cm的电极杯要对应20μL）

二、电击转化

1.将0.2CM的电极杯置于冰上预冷

2. 取1 μl纯化后的pet28a质粒和5ul u+k+D pcr产物添加到感受态细菌离心管中，小心混匀。冰上放置10min。将其和0.2CM的电极杯一起置于冰上预冷。

3. 打开电转仪，调至Manual，(200 欧姆，25μFd，2.5千伏)(检查时间常数，应该在3以上)。

4. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；

将电击杯插入电击槽中，将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，此时检查时间常数t（TIME CONST.按扭），时间常数应该在4以上。记下时间常数

5.向电击杯中迅速加入1000μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。6．37℃，220－250rpm复苏1小时。

7. 取100ul转化产物涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30％的甘油后混匀－80℃保存。

三.电击杯清洗流程

1．用清水将电击杯稍冲一下。

2．向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。

3．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

4．加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。

5．弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。6．将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用。注：1．不同样品使用的电机杯应分开；2．每周用1％酒精浸泡30分钟。

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法 制备转化用的农杆菌菌液 准备： 1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。 2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。 1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。 3．步骤： 共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。 4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。 （注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。 2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。 4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。 5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。 花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥

【VIP专享】电转化注意事项

电转化注意事项 作者: global.wun(站内联系TA)发布: 2009-10-20 一、制备感受态的菌液收集时间： 1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。 1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！ 2）OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min ）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。 2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。 3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好 二、制备感受态的菌液量 如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。 山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。 三、感受态的保存 感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP 管分装，-70 或-80 摄氏度保存。 另附：酵母GS115点种分离纯化 接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30℃培养48 小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。 四、电转化注意点： 1、感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。 2、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（怕量不够，吸得很多，电转时效果

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证

农杆菌电击感受态的制备及电击转化 表达载体pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的农杆菌（EHA105）电击转化 （1）抽提纯化pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的重组质粒 pB-2mb-FRO-1.7A重组载体和pB-2mβ-1.7A空载体的（DH5α）菌种接种于5ml LB（含卡那霉素50mg/L）液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取pB-2mb-FRO-1.7A重组质粒。 （2）取200ml型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。 （3）农杆菌EHA105电击预备处理。 I. 接种于5ml YEP（含链霉素Sm50mg/L）液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。EHA105 II. 离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。1.5ml III. 去残液，沉淀用200μl ddH2O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。 IV. 重复步骤ⅲ三次。 V. 去残液，沉淀用200ml ddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。加入200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。 （4）电击 I. 分别取10ml pB-2mb-FRO1-1.7A和pB-2mb-1.7A重组质粒至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。 II. 准备好电击装置（BioRad），电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。 III. 室温静置2min后加入800ml YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h。IV. 离心30s，收集菌液，沉淀用200ml ddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含含卡那霉素50mg/L 和含链霉素Sm50mg/L的YEP固体培养基平板，28℃培养48h。8000rpm 1.制备农杆菌电转感受态 (1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素 100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。 (2)将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28'C, 220rpm震荡 3-4小时，至OD560=0.5左右。 (3) 5000rpm离心5分钟，去上清。 (4) 加入40m1 10%甘油悬浮菌体，冰浴30min. (5) 4'C, 5000rpm离心5分钟，去上清。 (6 加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4'C, 5000rpm离心5分钟， (7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200 p 1/ 管)备用。 2 农杆菌感受态的电转化 〔I)取2 ul质粒加到200 u I EHA 105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴 30分钟。 (2)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。 (3)马上加入lml新鲜的LB液体培养基，28'C, 150rpm轻摇4-6小时。 (4)收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培

水稻农杆菌转化方法

方法1 NB基本培养基(右边的为N6,大量相同,加glycine甘氨酸2 mg/L) KNO3 2830 mg/L (NH4)2SO4 463 mg/L KH2PO4 400 mg/L MgSO4.7H2O 185 mg/L CaCl2.2H2O166 mg/L FeSO4.7H2O 27.8mg/L 5.6 Na2EDTA 37. 5 mg/L 7.5 MnSO4.4H2O 10 mg/L 27.8 H3BO3 3 mg/L 1.6 ZnSO4.7H2O 2 mg/L 1.5 Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 mg/L 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 mg/L 0.025 KI 0.75 mg/L 0.8 盐酸硫胺素thiamine CHL VB1 10 mg/L 0.1 盐酸吡哆醇pyridoxine-CHL VB6 1 mg/L 0.5 烟酸nicotinic acid 1 mg/L 0.5 肌醇myo-inositol 100 mg/L 100 水解酪蛋白300 mg/L 谷氨酰胺500 mg/L 脯氨酸500 mg/L 蔗糖30,000 mg/L PHytagel 2.6 mg/L pH 5.8 Basic培养基 B N6（大量）50ml （20倍） A Ms-Fe盐10-20ml（100倍）CH 0.3g/L S B5 macro 10ml （100倍）phytogel 4g/L或agar 8g/L I B5 vita 10ml （100倍）sucrose 30g/L C proline 0.5g/L glutamine 0.5g/L N6 (大量梗稻种子) 终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O185 mg/L 3.7 g/L 养(NH4)2SO4463 mg/L9.26 g/L CaCl2.2H2O 166 mg/L 3.32 g/L 基KH2PO4400 mg/L8.00 g/L 制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌, 使之完全溶解.

农杆菌转化法原理

农杆菌转化法原理 This manuscript was revised on November 28, 2020

农杆菌转化法原理： 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。 方法：（根据不同受体环境基因要求而不同） 1．农杆菌准备 2．外植体的准备（愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片）; 3．用 MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍（1.5ml / 20ml）或离心后稀释3倍; 4．外植体与菌液共培养20 分钟; 5．放置在带滤纸的培养皿上（注意充分吸干多余的菌液）; 6．将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基，培养2－3天 ; 7．移至含卡那霉素（Kan）300mg/L和羧苄青霉素（Cb 300mg/L）的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8．隔20天，进行第二次筛选； 9．抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗； 10 在生根培养基上生根，获得完整的再分化植株。

转供电必须具备的条件及费用关系

转供电必须具备的条件及费用关系 一是必须经供电企业委托；二是征得该地区有供电能力的直供用户同意；三是供电企业与委托转供户签订协议。 转供电委托费用 转供电协议应当约定转供费用，转供委托费用按委托的业务项目的多少，由双方协商确定。 转供电损耗承担 向被转供户供电的公用线路与变压器的损耗电量应由供电企业负担。 相关法律法规规定 《中华人民共和国电力法》 第二十六条供电营业区内的供电营业机构，对本营业区内的用户有按照国家规定供电的义务；不得违反国家规定对其营业区内申请用电的单位和个人拒绝供电。 《电力供应与使用条例》 第二十条在公用供电设施未到达的地区，供电企业可以委托有供电能力的单位就近供电。非经供电企业委托，任何单位不得擅自向外供电。 《供电营业规则》

第十四条用户不得自行转供电。在公用供电设施尚未到达的地区，供电企业征得该地区有供电能力的直供用户同意，可采用委托方式向其附近的用户转供电力，但不得委托重要的国防军工用户转供电。 委托转供电应遵守下列规定： 1、供电企业与委托转供户（以下简称转供户）应就转供范围、转供容量、转供期限、转供费用、转供用电指标、计量方式、电费计算、转供电设施建设、产权划分、运行维护、调度通信、违约责任等事项签订协议。 2、转供区域内的用户（以下简称被转供户），视同供电企业的直供户，与直供户享有同样的用电权利，其一切用电事宜按直供户的规定办理。 3、向被转供户供电的公用线路与变压器的损耗电量应由供电企业负担，不得摊入被转供户用电量中。 4、在计算转供户用电量、最大需量及功率因数调整电费时，应扣除被转供户、公用线路与变压器消耗的有功、无功电量。最大需量按下列规定折算： （1）照明及一班制：每月用电量180千瓦时，折合为1千瓦； （2）二班制：每月用电量360千瓦时，折合为1千瓦； （3）三班制：每月用电量540千瓦时，折合为1千瓦； （4）农业用电：每月用电量270千瓦时，折合为1千瓦。 5、委托的费用，按委托的业务项目的多少，由双方协商确定。

农杆菌介导转基因的原理

农杆菌介导转基因的原理？ 转基因技术的飞速发展为生物定向改良和分子育种提供了一种较佳的方法，并使其成为基因工程和育种的最有效途径，目前应用较广泛的转基因技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法等等，其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌转化的详细机理已有大量综述, 并介绍新进展. 野生型根癌农杆菌能够将自身的一段DNA转入植物细胞. 因为转入的这一段DNA含有一些激素合成基因, 因而导致转化细胞自身激素的不平衡从而产生冠瘿瘤. 这些致瘤菌株都含有一个约200 kb的环状质粒, 被称为Ti(tumor inducing)质粒, 包括毒性区(Vir 区)、接合转移区(Con区)、复制起始区(Ori区)和T-DNA区4部分. 其中与冠瘿瘤生成有关的是Vir区和T-DNA区. 前者大小为30 kb, 分virA～J等至少10个操纵子, 决定了T-DNA的加工和转移过程. T-DNA可以将携带的任何基因整合到植物基因组中, 但这些基因本身与T-DNA的转移与整合无关, 仅左右两端各25 bp的同向重复序列为其加工所必需, 其中14 bp是完全保守的, 分10和4 bp不连续的两组. 两边界中以右边界更为重要. VirA作为受体蛋白接受损伤植物细胞分泌物的诱导, 自身磷酸化后进一步磷酸化激活VirG蛋白; 后者是一种DNA 转录活化因子, 被激活后可以特异性结合到其他vir基因启动子区上游的一个叫vir框(vir box)的序列, 启动这些基因的转录. 其中, virD基因产物对T-DNA进行剪切, 产生T-DNA单链. 然后以类似于细菌接合转移过程的方式将T-DNA与VirD2组成的复合物转入植物细胞], 在那里与许多VirE2蛋白分子(为DNA单链结合蛋白)相结合, 形成T链复合物(T-complex). 在此过程中VirE1作为VirE2的一个特殊的分子伴侣具有协助VirE2转运和阻止它与T-DNA链结合的功能. 实验表明, 转基因植物产生的VirE2蛋白分子也能在植物细胞内与VirD2-T-DNA形成T链复合物. 之后, 这一复合物在VirD2和VirE2核定位信号(NLS)引导下以VirD2为先导被转运进入细胞核. 转入细胞核的T-DNA以单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上. 研究表明T-DNA优先整合到转录活跃区, 而且在T-DNA的同源区与DNA的高度重复区T-DNA的整合频率也比较高. 整合进植物基因组的T-DNA也有一定程度的缺失、重复、填充和超界等现象发生, 例如在用真空渗透法转化的拟南芥中有66%出现超界现象, 甚至有整个Ti质粒整合进植物基因组的报道, T-DNA超界转移现象的机理尚不完全清楚, 可能与其左边界周边序列有关. 现在, 对农杆菌感染过程中其本身因子的转录与调控已研究得相当深入, 但

电转化

电转化实验方案 准备转化用质粒DNA，线性化，去磷酸化 1 GS115 的纯化和感受态处理 2 确定电击转化条件，DNA转化GS115 3 选择His+转化子 4 筛选His+转化子的遗传霉素抗性 5 证实重组菌的Mut+Muts表型 6 PCR 鉴定基因是否存在7 检测基因表达8 1、准备转化用质粒DNA，线性化，去磷酸化 1.1 质粒DNA提取（大量） 利用试剂盒提取质粒DNA 1.2质粒的线性化 利用Sacl进行线性化，线性化步骤如下：（新构建载体，和亲本载体，单拷贝质粒抗0.25mg/ml 遗传霉素） 试剂标准体积实际体积 Sac1 1 ul 1.5 10XL buffer 2 ul 4 底物DNA 3.5ul 40 灭菌蒸馏水13.5ul 34.5 37℃下反应3h（60℃，15min） 利用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物，可直接用于转化。 １

利用PCR产物回收试剂盒回收和利用乙醇沉淀的方法都能获得转化子。 乙醇回收酶切质粒： 1）加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3MNaAc（PH5.2），混匀，沉淀质粒DNA。 2）零下20℃数小时（大于2小时），12000rpm离心10-20min，弃去上清。 3）300ul 70%乙醇洗涤一次，12000转离心10min，弃去上清。 4）37℃烘干水和乙醇 5）用20ulddH2O重新溶解，电泳检测。 注意： 由于重组质粒的DNA分子量较大，同样的酶切条件下酶切效果不一样。 酶切质粒的含量较低，应该大提质粒。 1.3去磷酸化（可选步骤） 去磷酸化可以提高转化效率，在转效率低的情况下，可以考虑磷酸化处理. 2、GS115 的纯化和感受态处理 2.1接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD 平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。 2.2 感受态制备 1)挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、 250-300r/min培养过夜；（最好每次都从平板上挑酵母菌） 2)取1ml的培养物接种至含有100ml新鲜培养基的250三角摇瓶中，30℃、 150r/min培养过夜（12h），至OD600达到1.3-1.5（1.0-1.3）； 3)将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用100ml的冰预冷的无菌水将 菌体沉淀重悬； 4)按步骤3离心，用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； ２

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤(精)

一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂： YEB 液体培养基（1升）：酵母提取物1g ，牛肉膏5g ，蛋白胨5g ，蔗糖 5g ， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌； 链霉素（Sm ）储液：125mg/ml

0.15 N NaCl，高压灭菌。 20mM CaCl2，高压灭菌。 四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB 液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C 振荡培养过夜； 2. 取过夜培养菌液0.5ml 接种于50mlYEB(Sm 125mg/l液体培养基中，28°C 振荡培养至OD600为0.5； 3. 5000rpm, 离心5min ； 4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min ； 5. 弃上清，置于冰上，加入1ml 预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml ，液氮中速冻1 分钟，置70°C 保存备用。

电转化

电转化感受态细胞的制备 1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培 养基和枪头的空白对照） 2. 37℃，220rpm，培养14-16个小时。 3. 第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm， 振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。 4. 将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm 离心10分钟。 5. 弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm 离心10分钟。 6. 弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。 7. 弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。 8. 弃上清，每个离心杯中加入5ml10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装 于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。 9. 次日观察转化子生长情况，并记录。 2．连接产物纯化 1．将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂: 10ul of ddH2O 2ul of 3M NaAC（PH5.2） 50ul of 无水乙醇 轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上； 2.4℃，top Speed 离心30分钟； 3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；

电穿孔法转化大肠杆菌TG1的条件优化

药　物　生　物　技　术 Pharmaceutical Biotechnology　2001,8(3):143～146 电穿孔法转化大肠杆菌TG1的条件优化Ξ 李　南,凌世淦2,吴梧桐1 (11中国药科大学生物制药学院,南京210009;21军事医学科学院基础医学研究所分子病毒学实验室,北京100850) 摘　要　研究了质粒pFab74X经电穿孔转化大肠杆菌TG1菌株的影响因素,并优化其转化条件。电场强度和脉冲时间的影响较为复杂,两者适当组合才可获得高转化效率。此外,采用对数生长早期的细菌,提高细菌浓度和降低筛选用氨苄青霉素的浓度均可提高转化效率。 关键词　电穿孔;转化效率;大肠杆菌TG1 中图分类号:Q68,Q936　文献标识码:A 文章编号:100528915(2001)0320143204 构建cDNA文库或基因文库时,转化效率高低是决定其多样性的关键因素之一。但常用的磷酸钙及原生质体等转化法转化效率均较低,批间差异较大,转化后再生时间长。电穿孔法(E lec2 troporation)则较好的解决了这个难题,它是利用瞬间高压电脉冲作用于受体细胞,使细胞表面产生暂时性的孔隙,从而将DNA、RNA、蛋白质等多种生物分子或颗粒导入胞内的方法,也称为电转化法。由于电穿孔是一个物理过程,适用范围广,转化效率高,特别是针对易受溶酶体消化的生物分子[1]及没有合适遗传转化系统或转化效率低的细胞,效果显著。目前,电穿孔法已经广泛应用于生物学、医药学、食品学等各个领域,成为转化细胞的常用方法。 电穿孔法最早是应用于真核细胞。1982年, W ong和Neumann成功的用电穿孔法转化小鼠成纤维细胞[2],但效率不高。现在,由于技术改进,操作简便快速,转化效率高,已广泛应用于原核细胞外源生物分子的导入。但影响转化效率的因素众多,不同的电穿孔体系[3]、受体细胞[4]、外源生物分子[5],其最佳转化条件均有一定差异。因此要获得高转化效率必须寻找这些因素的最佳组合。本文探讨了电场强度、脉冲时间、细菌浓度、细菌生长周期及转化子筛选过程氨苄青霉素浓度对TG1细菌转化效率的影响,并优化转化条件,以便利用TG1菌株建立高度多样性的基因文库,促进基因工程药物的发展。1　材料与方法 111　材料与仪器 E1coli TG1supE hsdΔ5thiΔ(lac2proAB)F’[traD36proAB+lacI q lacZΔM15]和质粒pFab74X (613kb,Ap r),由军事医学科学院基础医学研究所分子病毒学实验室保存;蛋白胨和酵母提取物为Ox oid公司产品,MOPS购自北京鼎国生物工程公司,氨苄青霉素(简称Ap)和其余试剂为进口或国产分析纯;S B培养基(3%蛋白胨,2%酵母提取物,1%MOPS,014%葡萄糖,10mm ol/L MgCl2, pH710),S OB培养基(2%蛋白胨,015%酵母提取物,0105%NaCl,215mm ol/L K Cl,10mm ol/L MgCl2, pH710),S OB2A培养基(含100mg/L Ap的S OB培养基),S OC培养基(S OB培养基,加20mm ol/L葡萄糖),S OC2A培养基(含100mg/L Ap的S OC培养基);I N2101型基因脉冲导入仪(天津理工学院), Lambda2UV/VIS型光谱分析仪(美国Perkin2 E lmer公司)。 112　菌株制备 将270℃冻存的TG1菌种分别于S OB和S OB2 A琼脂平板上划线培养,验证其为Ap s。从S OB 平板上挑取单菌落,37℃于S B培养基中培养至OD600约为110。取培养物按1∶100的比例重接于S B培养基中,37℃培养至OD600约为016。培养物冰浴中放置30min后,在4℃以4000r/min离心 341 Ξ收稿日期:2001203212 基金项目:北京市自然科学基金资助,N o.7002031 作者简介:李南(1976年生),男,江苏南京人,中国药科大学硕士生,分子生物学,E2mail:s outh-lee@etang1com

农杆菌转化法原理

农杆菌转化法原理： 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。 方法：（根据不同受体环境基因要求而不同） 1．农杆菌准备 2．外植体的准备（愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片）; 3．用MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍（1.5ml / 20ml）或离心后稀释3倍; 4．外植体与菌液共培养20 分钟; 5．放置在带滤纸的培养皿上（注意充分吸干多余的菌液）; 6．将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基，培养2－3天; 7．移至含卡那霉素（Kan）300mg/L和羧苄青霉素（Cb 300mg/L）的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8．隔20天，进行第二次筛选； 9．抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗； 10 在生根培养基上生根，获得完整的再分化植株。

电转条件

（1）将第4步得到的连接物与300μl感受态细菌混匀旋转1min,转移到电穿孔小槽中电脉冲穿孔。 （2）电穿孔时的参数可选择 2.5kV,0.2cm电击杯,25μFD和200欧姆(BioRad公司的Electroparation Pulser)或用BioRad公司的E.coli Pulser转化。立即冲洗电击杯,先用1ml,然后用2ml室温SOC冲洗细菌,立即于37℃振荡培养(250r/min)1h。 （3）加入10ml 37℃预热的SB(含20μg/ml氨苄青霉素,Amp),立即涂布平板,做100μl,10μl,1μl三种涂布; （4）其余培养物于37℃振荡培养(以下均为300r/min)1h,补加Amp至终浓度为50μg/ml,再于37℃培养1h。 （5）将培养物全部转接于100ml含50μg/ml Amp的SB中,37℃过夜培养。 （5a）制备质粒DNA,插入另一条链的可变区基因。通常先构建轻链库,再构建重链库；回到步骤（1）将第二条链插入已构建的第一链的库中。插入第二条链后,进行步骤（6）,省略步骤（5）和（5a）。 （6）加入辅助噬菌体M13K07 1012pfu;将培养物转入100ml SB(含50μg/ml Amp),37℃振荡培养2h。 （7）加入卡那霉素至70μg/ml,30℃或37℃振荡培养过夜。 （8）4000r/min离心细菌,4℃15min,将上清转移至一个干净的无菌瓶中,加入4％PEG 8,000和3％NaCl,用摇床振荡5min以使其溶解。 （9）冰浴沉淀噬菌体30min。 （10）9000r/min离心(4℃)20min弃上清。在纸巾上吸干10min,尽可能除去PEG。 （11）用2ml TBS/1％BSA重悬,转移入5ml离心管中,14,000r/min离心5min,取上清贮存4℃(长期保存应加入0.02％NaN3)。只有新鲜制备的噬菌体可以用下面的筛选,因为残存的蛋白酶很容易将ScFv从噬菌体表面切下。长期贮存的制备物应重新感染扩增再用于筛选。（12）从离心的细菌中制备噬菌粒DNA,贮存。

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期：2010-04-28 发布 人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889 一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂： YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌； 链霉素（Sm）储液：125mg/ml 0.15 N NaCl，高压灭菌。 20mM CaCl2，高压灭菌。

四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜； 2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5； 3. 5000rpm, 离心5min； 4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min； 5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。 一．农杆菌感受态细胞的制备 二．双元载体转化农杆菌EHA105 三．杆菌转化子的鉴定 A．农杆菌转化子的PCR鉴定 B．农杆菌转化子的酶切鉴定 关键词：农杆菌感受态细胞转化子 一．农杆菌感受态细胞的制备（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。 取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养2天。挑单 菌落接种于5ml YM（0.5g/L KH 2 PO 4 ,10 g/L Mannitol,2 g/L L-Glutamine,0.2 g/L NaCL,0.2 g/L MgSO 4,0.3 g/L Yeast extract,PH 7 .0）液体培养基中，220rpm， 28℃振荡培养18 hr 左右。将5ml菌液转接于100ml YM液体培养基中， 28℃,220rpm,振荡培养至OD 600 =0.5。转入无菌1.5ml的EP管，5000g离心5min, 去上清液。加入1ml预冷的0.1M的CaCl 2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min， 4℃下，5000g离心5min，去上清。加入200μl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-80℃。 二．双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；-70℃放置10min ；取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min；冰浴2min；加入800μl YM液体培养基,28℃，175rpm摇培3hr；取出后涂在含50μg/ml Kanamycin 的YM平板上，28℃培养到形成单菌落。

电转化方案

一、酵母菌电转化方案: 方案一。 1、负80度取出涂平板。30度培养二天。 2、取平板单菌落接种到10ml YPD培养基的50ml的三角瓶中30度过夜摇培 3、4度3000~4000rpm半分钟离心收获细胞。 4、用20ml TE/LioAC(0.1M/0.1M pH7.5)重悬细胞，并在30度摇床摇培45分钟 5、加0。5ml 1M DTT 再摇15分钟 6、加20ml双蒸水4度3500rpm离心半分钟 第一次沉淀用30ml冰冷的无菌水重悬 第二次沉淀用20ml冰冷的1M 的山梨醇重悬 第三次沉淀用1ml冰冷的1M 的山梨醇重悬 8、每40ul一个转化体系分装 9、转化条件1。5KV 20uF 200Ω 40ul yeast /reaction 100ng DNA/reaction<5ul 10、加150ul 1M山梨醇快速混合酵母和DNA，然后涂在选择培养基上。 方案二、 1、负80度取出涂平板。30度培养二天。 2、取平板单菌落接种到10ml YPSD（加SORBITOL）培养基的50ml的三角瓶中30度过夜摇培 3、4度3000~4000rpm半分钟离心收获细胞。 4、加20ml双蒸水4度3500rpm离心半分钟 5、第一次沉淀用30ml冰冷的无菌水重悬 第二次沉淀用20ml冰冷的1M 的山梨醇重悬 第三次沉淀用1ml冰冷的1M 的山梨醇重悬 6、每40ul一个转化体系分装 7、转化条件1。5KV 20uF 200Ω 40ul yeast /reaction 100ng DNA/reaction<5ul 8、加1000ul 1M山梨醇快速混合酵母和DNA， 9、30度温浴1~2小时，不能摇动。然后涂在选择培养基上。

农杆菌介导法

农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究A Highly Efficient Agrobacterium - mediated Rice Transformation Method 水稻是基因组研究的模式植物 ,近年来水稻基因组研究取得了很大进展 ,构建了遗传图谱和物理图 谱 ,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2 - 3序 ,以及第 1 号和第 4 号染色体的精细测4 - 5序 ,并对第 10 号染色体的结构进行了详细分析。在此基础上 ,各实验室大规模地 ,系统地进行水稻功能基因研究 ,普遍采用的研究手段是基因标签技术。基因标签技术包括 T - DNA 和转座子标签 ,创建大量的基因标签体是功能基因研究的材料平台。而根癌农杆菌介导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之一。本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法 ,以期为水稻功能基因研究提供丰富材料 , 为水稻重要农艺性状的改良开辟途径。 1材料 以水稻品种日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)为试验材料。菌株类型为 EHA105 超毒力菌株 ,载体为增强子捕获载体 pFX- E24. 2 - 15R(见图 1) ,载体上带有 GUS报告基因、35 S的 CaMV 启动子序列和潮霉素选择标记基因(HYG) 。农杆菌菌株为EHA105。 2方法 2.1水稻愈伤组织的诱导诱导方法参照 HIEI7等。将日本晴水稻种子去壳 ,用 75 %乙醇灭菌 5min ,再用2. 5 %的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min ,37 min ,30 min 和 25 min) ,以确定最佳灭菌时间 ,灭菌后用无菌水冲洗 6～8 次 ,于 MS 固体培养基上28 ℃避光培养 ,30 d 后 ,将愈伤组织进行继代培 养 ,得到胚性愈伤组织。 2.2农杆菌转化愈伤组织用 AB 固体培养基+氯霉素 25 mg/L + 利福平 20 mg/L + AS 20 mg/L培养农杆菌 ,在20 ℃下培养5～6 d。用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌 ,放入 AAM液体培养基中(加有2 mg/L 2 ,4

农杆菌介导法

实验九植物遗传转化——农杆菌介导法 一、目的 了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术 二、原理 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。下列因子与转化过程有关： 1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA) T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。置于该边界内的任何外源基因均可被转化。LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。 LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’ RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’ 2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子 转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。该操纵子的表达顺序如下： vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。 3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。 4. 寄主细胞表面受体 5.诱导条件: 小分子酚类化合物：如乙酰丁香酮（AS，acetosyringone）、羟基乙酰丁香酮（OH-AS，hydroxyacetosyringone）；它们是植物细胞创伤反应的一部分，或创伤细胞合成木质素的一部分，是莽草酸合成途径的产物。植物细胞必须在创伤和活跃的代谢状态下才能产生AS及OH-AS。农杆菌对一系列植物酚类化合物具有趋化性，同时高浓度的AS又可使农杆菌的vir 基因活化表达。这些化合物是双子叶植物细胞壁合成的前体，通常不存在于单子叶植物中，这正说明了为什么根癌农杆菌不易感染单子叶植物。若要实现农杆菌对水稻的转化，必须添加这类诱导物。 糖类：如D-葡萄糖、D-木糖等。它们在Vir区基因诱导和农杆菌毒力上起一定作用。 高浓度的肌醇可促进vir基因的表达。 低pH：pH 5.1－5.8 时Vir区基因的诱导达到最高水平。

高效电转化率条件的探索_张建琼

第23卷第2期南京师大学报(自然科学版)V o l.23N o.2 2000年JOU RNAL O F NAN J I N G NORM AL UN I V ER S IT Y(N atural Science)2000 高效电转化率条件的探索 张建琼1,张雪萍1,谢维2,单祥年2,林陵1 (11南京铁道医学院微生物免疫学教研室,南京,210009) (21南京铁道医学院生物学教研室,南京,210009) [摘要]　对影响DNA电转化效率的主要因素进行探索.结果表明:在相同的电场强度、电阻和电 容条件下,电脉冲时间的长短对电转化效率有较大影响,电脉冲时间太长或太短均使转化效率降 低;用对数生长早中期的细菌制备感受态细胞,经液氮速冻后储存于-70℃,能获得高转化效率. [关键词]　大肠杆菌;电转化;转化效率 [中图分类号]R392.11;　[文献标识码]A;　[文章编号]1001-4616(2000)02-0072-04 0　引言 噬菌体抗体库技术已广泛用于许多疾病,尤其是病毒性疾病体液免疫应答的研究,从噬菌体抗体库获得的重组抗体可成为研究、诊断和治疗的有效分子工具.要使目的抗原能从抗体库中筛选出相应的抗体,就得保证抗体库有足够的库容量及库中的抗体片段有足够的多样性,影响这一有效表位多样性的主要因素除了设计优良的PCR引物外,还有细菌的转化效率.目前所用的转化方法首选的是电穿孔法,其转化效率高达1010个转化子 Λg DNA,但如果在培养基中加入抗生素,其转化效率将显著地降低,而氨苄青霉素和四环素是构建抗体库常用的抗菌素.所以目前所报道的抗体库的容量最高为108,平均介于106～107之间[1～3].影响转化效率的因素很多,为了构建优良的噬菌体抗体库,通过优化各个参数,获得高转化效率,为构建高库容量噬菌体抗体库奠定了基础. 1　材料与方法 111　主要仪器 美国B i o2R ad公司电脉冲基因转移仪,美国IEC高速冷冻离心机,美国B eckm an DU270紫外分光光度计. 112　主要试剂及培养基 W izard P lu sM in i p rep s DNA Pu rificati on System为美国P rom ega产品;酵母提取物为英国O xo id产品;蛋白胨为日本制药株式会社产品;四环素、卡那霉素、M O PS为上海生工(Sangon)生物工程公司产品;其余试剂为国产分析纯产品.SOB、SOC、SB培养基自配,无菌10%甘油(用纯水配制). 113　菌株与质粒D NA 大肠杆菌XL12b lue,-70℃保存.pU C18质粒为本室保存,经W izard P lu s M in i p rep s 　收稿日期:1999-09-05 基金项目:江苏省应用基础基金资助(BJ97070) 作者简介:张建琼,女,1960—,博士,南京铁道医学院副教授,从事分子病毒学与免疫学教学与研究.