毕业论文
葡萄酒中酵母的检测研究
摘要：当前葡萄酒中酵母菌的检测菌数方法较多，但至今仍没有一种常用的方法能准确测出葡萄酒的实际菌数。本论文采用了葡萄酒微生物检验的几种方法，对酵母菌的检测进行了研究，为酵母引起的葡萄酒病害的防治提供一些数据。
关键词：葡萄酒；酵母；测定
前言
葡萄酒中存在的微生物主要有霉菌，酵母菌，醋酸菌，乳酸菌它们可能引起葡萄酒变质[1]。引起葡萄酒腐败变质的微生物主要是酵母菌。酵母菌广泛分布于自然界中，长期以来，人们利用一些酵母加工一些食品但在某些情况下，酵母也可造成食品腐败变质。酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以酵母计数来判定食品被污染的程度。
酵母菌种类繁多，与霉菌同属于真菌，是一种单细胞生物，形态通常有圆形、椭圆形、细长或柠檬形。大小为6-20 um呈半透明。葡萄酒与葡萄汁中的酵母菌主要属于子囊菌纲酵母属(Saccharomyces)，主要包括葡萄酒酵母(Saccharomyceseuipsoideus)，卵形酵母(S.oviformis)，产酸酵母(S.acidifaciens)，罗氏酵母（S.rosei）,柠檬形克勒克氏酵母(pichia)，星形球拟酵母（Torulopsisstellata），尚德酒香酵母(Brettanomyces)等[2]。
葡萄酒中存在的微生物主要有霉菌，酵母菌，醋酸菌，乳酸菌它们可能引起葡萄酒变质[1]。引起葡萄酒腐败变质的微生物主要是酵母菌。酵母菌广泛分布于自然界中，长期以来，人们利用一些酵母加工一些食品但在某些情况下，酵母也可造成食品腐败变质。酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以酵母计数来判定食品被污染的程度。
1材料与方法
1.1仪器和设备
超净工作台
光照培养箱
干燥灭菌箱
高压蒸汽灭菌器
电子天平
显微镜、
酒精灯
血球计数板
载玻片
盖玻片
平底漏斗
取样枪
容量瓶
移液管
培养皿
接种环
涂布玻棒
镊子
1.2材料
葡萄酒酵母菌种、冰白(开启半年)、天然甜红(开启8月)、干红(开启2月)、贺兰山干白(开启1年)，西夏王蛇龙珠干红和梅鹿辄干红(均自然发酵)、梅鹿辄干红、干白，少量菌膜、最臭、次臭(表面感染酵母菌，己长膜、混合)。
YEPD培养基：酵母膏10 g，蛋白陈20 g，葡萄糖20 g，氯霉素l00 mg，琼
脂20 g；韩尼伯格(Henneber)培养基：蔗糖150 g，磷酸二氢钾5 g，琼脂20 g，硫酸镁2 g，蛋白胨5 g，磷酸钙5 g; PDA培养基:马铃薯20 g，葡萄糖10～20 g，琼脂18 g，水1000ml；麦芽膏琼胶培养基；麦芽膏25g,琼胶17g,水1000ml；孟加拉红培养基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氢钾1g，琼脂20 g，硫酸镁500mg，1 /3000孟加拉红溶液100 ml。
1.3方法
1.3.1培养基的筛选
接种液的稀释：挑取少许菌种，放入10 ml的灭菌水中，按100，10-2，10-4，10-6，10-8，10-10，进行稀释，制成不同浓度的酵母菌悬浮液。
接种：取0.1ml涂布接种在不同培养基上，每个浓度重复三次，并做空白对照。
培养:接种好的培养皿，置于光照箱中进行培养，温度为25～27℃，培养3～5天并计数[7]。
1.3.2活菌计数法
操作方法：用微量加样器将0.01ml经适当稀释的样品均匀涂而于载玻片上的1cm2面积的方格内，经干燥，固定后用显微镜的油镜观察计数每个视野的菌数。注意操作时涂片要厚薄均匀，最好洗用特制圆形划痕的载玻上。在计数前先用物镜测微尺测出微镜油镜视野的直径，然后将染色的载玻片置于载物台上进行计数[8]。
本试验中取酒样，用涂布法接种于YEPD培养基和孟加拉红培养基上，培养3～5天，并菌落计数。
1.3.3混浊度计数
基本原理：在浊度计或比色计上测定培养液中微生物的生长数量。某一波长的光线通过混浊的液体后，光的强度被减弱。入身光与诱射光的强度之比和样品液的混浊度与液体厚度相关[9]。
本试验中采用分光光度法，波长520入测出各酒样的透光度（T），由D(混浊度)=2-1 gT求出混浊度。
1.3.4血球计数法
操作方法：将适当稀释的样品注入血球计数板的计数室中。由于计数室内的容积已知（0.1mm3），计算一定数量刻度内的菌数，即可计算出每克或每毫升样品中的酵母菌数[10]。
2结果与分析
2.1培养基的筛选：
用YEPD，Henerberg（韩尼伯格培养基），孟加拉红、PDA培养基、麦芽膏琼胶培养基5种培养基培养葡萄酒酵母菌，其结果见表2-1。
表2-1 葡萄酒酵母菌接种五种不同培养基的培养结果
编号培养基菌落出现接种液菌落数对照
1# YEPD 72h 10-425 0
10-612
2# 孟加拉红48h 10-428 0
10-620
3# henerberg 72h 10-422 0
10-610
4g PDA培养基72h 10-421 0
10-610
5# 麦芽膏琼胶50d 10-421 0
10-69
五种培养基培养的菌落均为圆形，灰白色。挑取培养菌种在显微镜下观察，酵母形态为圆形、椭圆形，主要为葡萄酒酵母(saccharomycesellpsoideus)。孟加拉红培养基菌落长出的时间最短为48h，菌落数最多为28 (10-4)和20(10-6) (图2、3)；其次YEPD培养基为25 (10-4)和12(10-6)；最差为麦芽膏琼胶培养基21(10-4)和9 (10-6)。此外，孟加拉红培养基菌落分布均匀，菌落的面积也明显大于其它培养基。
2.2 活菌计数法
表2-2 YEPD和孟加拉红培养基菌落培养结果
编号样品开启时间接种方式样品稀释培养基48h后菌落数培养基48h后菌落数1# 天然甜红8月涂布10°孟加拉红4YEPD 3 2# 冰白6月涂布10°孟加拉红 2 YEPD0 3# 干红2月涂布10°孟加拉红 3 YEPD 1 4# 贺兰山干白1年涂布10°孟加拉红 2 YEPD 1 5# 梅鹿辄干红自然发酵涂布10°孟加拉红14 YEPD 13 6# 蛇龙珠干红自然发酵涂布10 孟加拉红19 YEPD 16 7# 梅鹿辄干红1年涂布10°孟加拉红45 YEPD 30 8# 干白(少量菌末) 1年涂布10°孟加拉红25 YEPD23 9# 干白(最臭) 1年涂布10°孟加拉红 3 YEPD 3 10# 干白(次臭) 1年涂布10°孟加拉红77 YEPD64 11# 干白(混合) 1年涂布10°孟加拉红10 YEPD8 12#空白(自来水) 涂布10°孟加拉红 1 YEPD
从表2-2看出1#，3#，5#，6#，7#，8#，9#，11#，12#均培养出了酵母菌落。
最多的为10#干白，用孟加拉红培养基培养其酵母菌落为77用YEPD培养基培养其酵母菌落数为64；其次为7#梅鹿辄干红，用孟加拉红培养基培养酵母菌落数为45, 用YEPD培养基培养酵母菌落数为30。最少为2#冰白，用孟加拉红培养基培养酵母菌落数为2，用YEPD培养基培养酵母菌落数0。10#干白葡萄汁，镜检下细胞呈椭圆形式球形，从而可断出其表面形成的白膜由酵母菌中的葡萄酒假红酵母(Cadidovini)引起的酒花病。
2.3混浊度计数法
表2-3 混浊度计数法检测不同酒样的结果
编号酒样稀释度吸光度透光度(T) 混浊度
1# 冰白10°0.028 94.1 0.03
2# 贺兰山干白10°0.035 92.2 0.04
3# 干白(菌株) 10°0.84 14.4 0.84
4# 干白(最臭) 10°0.608 25 0.6
5# 干白(次臭) 10° 1.25 5.8 1.24
6# 干白(混合) 10°0.215 62.2 0.21
7# 天然甜红10-10.155 70.0 0.05
8# 干红10-10.124 75.6 0.02
9# 梅鹿辄10-10.064 86.2 0.06
10# 蛇龙珠干红10-10.372 42.2 0.37
11# 梅鹿辄1 10-10.652 22.2 0.65
12# 梅鹿辄2 10-10.562 27.2 0.57
由表3可以看出,用活菌计数据检测酒样,干白酒样中,5#干白(次臭)的混浊度最大,为1.24其次为3#干白(少量菌膜),混浊度为0.84。红酒中以梅鹿辄干红（1）的混浊度最大，为0.65；其次为梅鹿辄干红（2）混浊度为0.57；最少的为8#干白，混浊度为0.02。其结果与活菌计数法(表2)的结果相符合，干白(次臭)的酵母菌落数数最多，含酵母菌落数最少的为冰白。
2.4 血球计数法
表2-4 血球计数法检测不同酒样的结果
编号酒样取样量(m1) 酵母数
1# 天然甜红0.0lml 4
2# 冰白0.0lml 2
3# 干红0.0lml 3
4# 贺兰山干白0.0lml 2
5# 梅鹿辄干红0.0lml 6
6# 蛇龙珠干红0.0lml 8
7# 梅鹿辄1 0.0lml 13
8# 梅鹿辄2 0.0lml 10
9# 干白(少量菌摸) 0.0lml 9
10# 干白(最臭) 0.0lml 4
11# 干白(次臭) 0.0lml 30
12# 干白(混合) 0.0lml 8
13# 空白(自来水) 0.01m1 1
由表2-4结果可以看出，血球计数法检测不同酒样的酵母数，最多的为11#干白(次臭)，酵母菌数为30其次为7#梅鹿辄干红，酵母菌数为13最少的2#冰白，酵母菌数为与表2(活菌计数法检测)和表3(混浊度计数)的结果相符。此外，此法只能用于含微生物10万个／ml以上的葡萄汁和葡萄酒，且无法区分死细胞和活细胞。对酵母活细胞和死细胞的区别，应用染色法，取一滴0.01％亚甲蓝，
染色，死细胞染成蓝色。
3结果与讨论
3.1在筛选酵母培养基的过程中，培养基的优劣判定以培养的酵母菌尽可能的多，菌落长出的时间短，培养出的菌落大，纯度高，以及培养出的酵母与原菌种一致为判定依据。
3.2对于葡萄酒或葡萄汁中存在的酵母菌采用活菌计数法计数时，孟加拉红培养基培养结果最好，YEPD培养基次之。培养温度一般为2 5-27℃度，培养时间3-5天。
3.3对固体培养基的接种，采用涂布接种比倾注接种好，这是因为酵母生长需要氧气，倾注接种使酵母与外界氧气隔绝，从而缺氧死亡。
3.4对于含酵母菌极少的酒样中酵母菌的检测，宜采用活菌计数法，而对于酵母菌含量高的样品，用混浊度计数法和血球计数法最好。
谢辞
本论文从选题，调研到论文的撰写都是艾乃吐拉老师的悉心指导下完成的。艾乃吐拉老师严肃的治学态度，一丝不苟的工作作风和深厚的理论修养深深的影响着我。在整个论文的写作过程中倾注了老师的大量心血，感谢之情难以言表。在此表示我的导师艾乃吐拉致意崇高的谢意敬意。
在论文的开题和撰写过程中，有幸得到学院个位老师的热诚指导，他们对我的论文都提出了宝贵的意见。使我能够顺利完成这次论文。
参考文献：
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