各种表达载体

表达载体

一、原核细胞表达载体

1. pBAD载体:

特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。

请注意:

1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。

2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。

本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:

(a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域

SD

P BAD….TACCCGTTTTTTTCC….GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT

A M A

TTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT

Nco1 Pst1 Hind111 (b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域

EcoR1 Kpn1 BamH1 Pst1

P BAD….TACCCGTTTTTTTGG.GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT

Nde1 Sac1 Smal 1 Hind111

下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:

pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞

Origami(DE3)内高效表达

2. pCAl-n & pCAl-pelB载体

特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。因此，该表达载体在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血酶切点，故该蛋白产物易于纯化和产业化。

此外，本公司利用分泌信号肽PelB，构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal-PelB。此载体表达的蛋白产物能在分泌肽PelB的指引下进入细胞周质。

(a). Pcal-n

BamH1 Sma1 EcoR1 Nco1 Sal1 Xho1 Sac1 Hnd111

(b). Pcal-PelB:

Nde1

actggagact cat ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG GGC

M K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P

Nco1 Msc1 BamH1 EcoR1 Sal1

GCC ATG GCC taagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtct agagccc cgacgcgctggg

A M A * * * * * *

3. pPOW3.0 表达载体

特点: 该原核表达质粒含有噬菌体的重叠λP R P L热诱导启动子和编码热敏感抑制子的C1857基因，可使宿主细胞在合成蛋白前获得高密度的宿主细菌，进行高水平目的蛋白表达，并对蛋白合成提供紧密控制。PelB分泌信号肽能指引合成的外源蛋白通过胞浆膜进入胞质。特别提示: 在进行重组质粒时，最好在N-未端用Nco1或Msc1位点，C-末端则可用BamH1、EcoR1位点进行拼接。

图示为启动子、PelB分泌信号肽和多克隆位点区域

Xho1

λP R P L 启动子ggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggcgcc tcgagt aatttaccaacactactacgttttaactgaaacaa RBS Nde1

actggagact catATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG

M K Y L L P T A A A G L L L L A

Nco1 Msc1 BamH1 EcoR1 Sal1

GGC GCC ATG GCC taagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtct agagccc

A Q P A M A * * * * * *

说明: RBS 为核糖体结合位点; * 为终止密码子

二、真核细胞表达载体

1.pCMVp-NEO-BAN载体

特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。扦入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2.pEGF P, 增强型绦色荧光蛋白表达载体

(Enhanced Fluorecent Protein Vector)

特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，

将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。

Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507

图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：

gcc acc Nhe1 Age1

3. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体

特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。

Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507

图示为启动子和多克隆位点区域：

.Nhe1….Age1…Bgl11BamH1

4. pSV2表达载体

特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。

pCambia1391Z 植物表达载体

北京华越洋?生物?首页关于我们新闻中?心产品展?示在线留?言加?入我们 联系我们 pCambia1391Z pCambia1391Z 产品编号载体名称北京华越洋?生物VECT0010 pCambia1391Z pCambia 1391Z 载体基本信息 出品公司:Cambia 载体名称: pCambia1391Z, pCambia 1391Z 质粒类型: 植物表达载体?高拷贝/低拷贝:低拷贝启动?子:CAMV 35S 克隆?方法 :多克隆位点，限制性内切酶 载体?大?小: 11227 bp 5' 测序引物及序列:M13-F: TGTAAAACGACGGCCAGT 3' 测序引物及序列 : M13-R: CAGGAAACAGCTATGAC 载体标签: GusA 载体抗性: 卡那和潮霉素筛选标记: HPTII 详情产品分类 ?生化试剂 精细化学品 中间体/标准品 病理实验试剂 其他关键词：　 热线电话：400-818-1148150  1148  1284

备注:-- 产品?目录号:1391Z 稳定性:稳定表达 组成型:?非组成型 病毒/?非病毒:?非病毒 pCambia 1391Z载体质粒图谱和多克隆位点信息 pCambia 1391Z载体序列 LOCUS pCAMBIA1391Z 11227 bp ds-DNA circular SYN DEFINITION Agrobacterium binary vector for plant transformation, with hygromycin- and kanamycin-resistance and LacZ-GUS genes plus the pUC9 MCS. ACCESSION AF234312 VERSION . KEYWORDS pCAMBIA1391Z SOURCE synthetic DNA construct ORGANISM synthetic DNA construct REFERENCE 1 (bases 1 to 11227) AUTHORS Cambia TITLE Direct Submission JOURNAL Exported from SnapGene Viewer COMMENT The GenBank record was corrected by inserting a G at position 4743. FEATURES Location/Qualifiers

真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 令狐采学 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与

几种新型植物基因表达载体的构建方法

几种新型植物基因表达载体的构建方法 摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。 关键词: Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法 基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。从1969 年Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到

植物表达载体 Pcambia1302 序列图谱

载体质粒图谱和多克隆位点信息 载体简介 载体序列 LOCUS AF234298 10549 bp DNA circular SYN 24-APR-2000 DEFINITION Binary vector pCAMBIA-1302, complete sequence. ACCESSION AF234298 VERSION AF234298.1 GI:7638073

KEYWORDS . SOURCE Binary vector pCAMBIA-1302 ORGANISM Binary vector pCAMBIA-1302 other sequences; artificial sequences; vectors. REFERENCE 1 (sites) AUTHORS Hajdukiewicz,P., Svab,Z. and Maliga,P. TITLE The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation JOURNAL Plant Mol. Biol. 25 (6), 989-994 (1994) PUBMED 7919218 REFERENCE 2 (bases 1 to 10549) AUTHORS Roberts,C., Rajagopal,S., Smith,L.M., Nguyen,T.A., Yang,W., Nugrohu,S., Ravi,K.S., Vijayachandra,K., Harcourt,R.L., Dransfield,L., Desamero,N., Slamet,I., Hadjukiewicz,P., Svab,Z., Maliga,P., Mayer,J.E., Keese,P.K., Kilian,A. and Jefferson,R.A. TITLE A comprehensive set of modular vectors for advanced manipulations and efficient transformation of plants JOURNAL Unpublished REMARK Full description of constructs REFERENCE 3 (bases 1 to 10549) AUTHORS Roberts,C., Rajagopal,S., Smith,L.M., Nguyen,T.A., Yang,W., Nugrohu,S., Ravi,K.S., Vijayachandra,K., Harcourt,R.L., Dransfield,L., Desamero,N., Slamet,I., Hadjukiewicz,P., Svab,Z., Maliga,P., Mayer,J.E., Keese,P.K., Kilian,A. and Jefferson,R.A. TITLE Direct Submission

各种表达载体

表达载体 一、原核细胞表达载体 1. pBAD载体: 特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。 请注意: 1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N- 末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。 2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。 本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下: (a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域 SD P BAD….TACCCGTTTTTTT CC….GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT A M A E L TTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT Nco1 Sac1 Kpn1 Smal1 BamH1 (b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域 Pst1 P BAD GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT Nde1 Sac1 Smal 1 Hind111 下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果: pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞 Origami(DE3)内高效表达 2. pCAl-n & pCAl-pelB载体 特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体， 含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。 因此，该表达载体在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水 平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血 酶切点，故该蛋白产物易于纯化和产业化。 此外，本公司利用分泌信号肽PelB，构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal-PelB。此载体表达的蛋白产物能在分泌肽PelB的指引下进入细胞周质。

过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1

过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月

目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)

简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。

叶绿体表达载体--如何构建载体

如何构建载体 1 启动子的选用和改造 外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。 在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。 2 增强翻译效率 为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容： 2.1添加5｀-3｀-非翻译序列 许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa 蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的 3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。 2.2 优化起始密码周边序列 虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。例如，有一个细菌的几丁质酶基因，原来的起始密码周边序列为UUUAUGG，当被修饰为ACCAUGG，其在烟草中的表达水平提高了8倍。因此，利用非植物来源的基因构建表达载体时，应根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改造。 2.3对基因编码区加以改造

过表达质粒的构建及转染

过表达质粒的构建及转染 质粒及菌液说明过表达质粒为高纯度的DNA 粉末制品，经过真空冷冻干燥的质粒是呈薄膜状或粉末状附在离心管中，请适当离心(10000r/min 10~15s)后小心开启，以免飞扬丢失。请根据实验需要的质粒浓度和质粒的总量加入适量的ddH2O (通常建议储存液浓度500ng~1μg/μL），合上管盖充分震荡使其溶解后可用于细胞转染及其他分子生物学实验。粉末制品的DNA 可长期保存（建议最好不要超过6个月），质粒溶解后建议在-20℃的环境中存贮，避免多次冻融处理。 2、甘油菌液为含有重组质粒的菌液的过夜培养物与甘油的混合物，甘油的终浓度为20% 。客户收到甘油菌液建议即刻活化（例如取50~100μL到5mL 含有相应抗性(根据载体种类可以选择25~50μg/mL 卡那霉素或50~100μg/mL 氨苄霉素）的LB 培养基过夜活化（12~16h），活化后的菌液与适量甘油混匀后于-80℃保存。） 3、重组质粒测序峰值图文件结果请参见附件报告中的.abl 文件。测序序列文件参见与峰值图文件同名的.seq 文件。 基因过表达实验设计在使用载体法针对某一基因进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。 1. 实验对照组的确立在一个完善的基因过表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。通常，这些对照组包括阴性对照、转染试剂对照。阴性对照通常是用基因过表达选择的载体对应的空载体来作为对照。 2. 细胞转染条件的确定使用DNA 载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通

常采用报告基因来检测DNA 的导入情况。最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。 3. 基因表达效率的检测通常用两大类方法来检测过表达质粒中目的基因表达的效率，一类方法是直接检测目的基因在不同水平如mRNA 和蛋白水平的变化，具体的方法如qPCR 和Western blot 等；另一类方法是通过检测目的基因的生物学效应和细胞效应来间接的反映目的基因的表达变化，这一类方法很多，不同的基因有不同的检测方法。通常多选用qPCR 和Western blot 等方法直接检测目的基因的变化情况。由于细胞种类和蛋白表达翻译及抗体因素，吉玛构建表达载体通常可保证qRCR 检测转染工程细胞293T，目的基因mRNA 表达水平有2倍上调。基因过表达实验操作由于在基因过表达实验中有多种条件选择，如试剂和细胞株等，在本实验操作中仅以pEX-1 空载体为阴性对照，Lipofectamin2000 为转染试剂，293T 细胞为实验细胞株，按照上述条件分步阐述过表达质粒转染实验的操作过程。如果用户使用不同的细胞株和转染试剂，可根据不同的目的基因和实验条件进行相应的调整。 1、293T 细胞在6cm dish 中培养至80-90%融合时，倾去培养液，用3mL PBS 洗涤细胞两次。 2、加1mL Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃ 放置3 分钟。 3、再加入2 mL 含10% FBS 的DMEM 培养液，吹打使细胞形成单细胞悬 液。 4、血球计数板计数，将细胞稀释至3×105 细胞/mL。 5、按5×103细胞/孔的浓度接种96 孔板，混匀后于37℃ 5% CO2培养24h。 6、转染试剂Lipofectamin2000 用于转染过表达质粒，剂量如下，每个剂量

克隆载体表达载体构建详细版

一、稀释引物 1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温） 2、根据OD值加DD水。 3、静置30min（冰上） 4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。 5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。 二、跑MIX检测引物（20ul体系）、 上引物0.8ul 下引物0.8ul Mix 10ul DNA（日本晴）1ul DD水7.4ul 三跑高保真酶（50ul体系） DNAorCDNA 2ul 上引物2ul 下引物2ul 5*buffer 10ul dNTPs 5ul DD水28ul Pfu（最后加）1ul 四胶回收流程 1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。 2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。 3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。 4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。 5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次） 6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。 7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。 8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。 五、胶回收产物检测（10ul）体系 上引物0.4ul 下引物0.4ul Mix 5ul 回收产物1ul DD水 3.2ul 六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系） 胶回收产物 3.5ul Blunt cloning 0.5ul 混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃

pCambia35s-ECFP植物表达载体

pCambia35s--‐ECFP 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT1010 pCambia35s--‐ECFP pCambia35s--‐ECFP载体基本信息 出品公司: --‐--‐ 载体名称: pcambia35s--‐ECFP 质粒类型: 植物双元表达载体 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: --‐--‐ 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: ECFP 载体抗性: --‐--‐ 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ 其他植物载体质粒： pBI101 pDF15 pBI121 pEarleyGate 100 pBI221 pEarleyGate 101 pBI221--‐GFP pEarleyGate 102 pBin19 pEarleyGate 103 pBINPLUS pEarleyGate 104 pCambia0105.1R pEarleyGate 201 pCambia0305.1 pEarleyGate 202 pCambia0305.2 pEarleyGate 203 pCambia0380 pEarleyGate 204 pCambia0390 pEarleyGate 205 pCambia1105.1 pEarleyGate 301 pCambia1105.1R pEarleyGate 302 pCambia1200 pEarleyGate 303 pCambia1201 pEarleyGate 304 pCambia1281Z pFGC5941 pCambia1291Z pGA643 pCambia1300 pGreen

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选

质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）

表达载体的构建

关于表达载体的构建 1.表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类 载体既有复制子，更要有强启动子； 2.大肠杆菌中的表达载体应含有 （1）强启动子 （2）在启动子下游区和A TG上游区有一个好的SD序列。 （3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。 我们实验室常用的就是PBI121的表达型载体，该载体具有35S强启动子，下游有MCS，并且具有T-DNA插入片段和Tet和Kan的抗性位点，有利于作为农杆菌浸染植物的表达载体。 3.载体构建的步骤 （1）.设计引物 1.引物的长度用于PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16个碱基以上，一般以20—30个碱基为宜，引物过短会使PCR特异性降低，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。 2. 引物自身序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列，引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。 3. Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G) 4. 引物的GC含量引物中GC含量应占到45％一60％左右。在引物设计时应尽量避免引物二聚体和发卡结构，尤其是在引物3，端不应有互补结构。引物3，端应与目的片段完全配匹，而其5’端碱基可不与模板配匹，故在引物设计时可在其5，端加上限制酶位点或其他短的序列，这些与原初模板并不配对的非互补序列在后续的循环中将被带到双链DNA中去，这样反应产物不仅含有目的序列，同时在目的基因的两侧又有了新的限制酶位点，用相应

pCambia1291Z植物表达载体

pCambia1291Z VECT0110 pCambia1291Z pCambia 1291Z : Cambia : pCambia1291Z, p Cambia 1291Z : /: : CAMV 35S : : 11379 b p 5' : M13-F: T GTAAAACGACGGCCAGT 3' : M13-R: C AGGAAACAGCTATGAC : GusA : : HPTII : -- : 1291Z : : /: pCambia 1291Z

pCambia 1291Z LOCUS pCAMBIA1291Z 11379 b p d s-DNA circular S YN DEFINITION Agrobacterium b inary v ector f or p lant t ransformation, w ith hygromycin- a nd c hloramphenicol-resistance a nd L acZ-GUS g enes plus the p UC9 M CS. ACCESSION AF234295 VERSION . KEYWORDS pCAMBIA1291Z SOURCE synthetic D NA c onstruct ORGANISM synthetic D NA c onstruct COMMENT This f ile i s c reated b y V ector N TI COMMENT The G enBank r ecord w as c orrected b y i nserting a G a t p osition 4743. FEATURES Location/Qualifiers source 1..11379 /organism="synthetic D NA c onstruct" /lab_host="Plant C ells" /mol_type="other D NA" CDS join(2..16,207..2024)

小鼠microRNA-125b过表达载体构建 毕业论文

小鼠microRNA-125b过表达载体构建 目录 摘要 (1) Abstract (3) 1 前言 (4) 2 材料与方法 (5) 2.1 材料 (5) 2.2主要试剂与仪器 (5) 2.2.1主要试剂 (5) 2.2.2主要仪器 (5) 2.3 方法 (6) 2.3.1质粒提取 (6) 2.3.2鼠尾基因组DNA提取 (6) 2.3.3 PCR引物设计与合成 (7) 2.3.4 PCR扩增 (7) 2.3.5琼脂糖凝胶电泳检测 (7) 2.3.6 DNA产物纯化及回收 (8) 2.3.7酶切及鉴定 (8)

2.3.8载体构建 (9) 3 结果与分析 (9) 4 讨论 (11) 5 结论 (11) 6 参考文献 (12) 致谢 (14)

摘要 NPC1是一种以溶酶体内脂质异常沉积为特征的中枢神经系统退行性疾病，迄今为止对NPC1的发病机制仍得不到合理的解释。研究发现miRNA对tau蛋白的调控和神经元存活至关重要，通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶来调节tau蛋白磷酸化水平。Tau 蛋白过度磷酸化损伤神经细胞功能和结构，如过度磷酸化使Tau 蛋白结合微管能力降低[1]，Tau 蛋白在神经元内聚积导致神经元轴突转运障碍[2]、乙酰胆碱释放减少[3]、蛋白酶体活性抑制[4-7]，这些功能和结构的改变可能导致神经元呈慢性进行性变性构建miR-125b表达载体，从tau蛋白磷酸化调控的研究入手，系统地研究参与tau蛋白磷酸化调控的miR-125b 的靶基因，阐释其中的分子作用机制，为tau蛋白异常病变引起的神经退行性疾病的研究与防治提供新的思路。 本实验目的：构建小鼠microRNA-125b（miR-125b）过表达载体。 方法：参考小鼠miR-125b前体序列的PCR扩增引物，重新设计限制性内切酶位点为Nhe I和EcoR I，PCR扩增，然后将目的片段和pcDNA3.1-EGFP质粒进行双酶切鉴定，使用T4 DNA连接酶进行连接，转化DH5α感受态细胞，挑取重组阳性克隆，对重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。

真核细胞常见表达载体复习过程

真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN 载体特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔B -球蛋白基因 内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo 基因以及pBR322 骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sall、BamHI和EcoRI位点。注意在此载体中有二个EcoRI 位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点： pEGFP 表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。 Neo 抗性盒由SV40 早期启动子、Tn5 的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK 基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin 抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途：该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV 启动子,Acet1-Nhe1) 。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆B -肌动蛋白基因，在PCMV启动 子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin 使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo 抗性盒由SV40 早期启动子、Tn5 的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK 基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G41 8筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin 抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途： pEGFP-Actin 载体在真核细胞表达EGFP-Actin 融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2 表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40 启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为 Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点：该真核细胞表达载体由CMV 启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl 单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo 基因，转染細胞后不能用G418 筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25ug pUC19 DNA 25ug 说明： pBluescript II kS、pUC18 &Puc19 载体适合于DNA 片段的克隆、DNA 测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ 基因中含有多克隆位点，当外源DNA 片段扦入，转化lacZ 基因缺乏细胞，并在含有IPTG 和X-gal 的培养基上培养时，含有外源DNA 载体的细胞

几种新型植物基因表达载体的构建方法

几种新型植物基因表达载体的构建方法 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-

几种新型植物基因表达载体的构建方法 摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载 体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半 功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、 三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建 方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体 PCR 置换法适用于构建小分子 RNA 表达载体；重组融合 PCR 法特 别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用 In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连 接的克隆方法 (Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础 上，分析这 6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工 程表达载体的构建提供新的思路。 关键词: Micro RNA 前体 PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法 基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。而载 体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。随着植物基因 工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在 转基因植物中最常用的是质粒载体。传统的载体构建方法在进行构建多 片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多 个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的