噬菌体展示肽库技术及其应用研究现状
噬菌体展示肽库技术的研究及应用进展
2010.01
2010.01 的目的基因克隆进表达载体(fuse phage)，与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达，使得一个噬菌体上含有一种序列的肽。与有机合成法相比较，该方法有其独特的优越性：它可将特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，并且将选择能力和扩增能力联系在一起，即通过与配体的结合从数量众多的多样性群体中选择出表达有相应配体的噬菌体颗粒，再通过感染大肠杆菌使选择出的噬菌体颗粒得到扩增。其不足在于肽库的容量及短肽的大小受到了限制，且只能表达L 型天然氨基酸形成的短肽。 3噬菌体肽库的筛选技术 如何从噬菌体肽库中筛选到特异的重组噬菌 体是肽库技术的关键。经典的方法有两种：①将纯抗体包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；②将抗体与生物素基因相连，再将其固定在包被有 Streptavidin 的磁珠上对噬菌体进行筛选。3.1 宿主菌直接洗脱 经典筛选过程中，一般利用pH 的变化来洗脱与目标分子结合的噬菌体，这可能对噬菌体造成伤害。利用噬菌体与宿主之间的亲和性可以直接用宿主菌来洗脱，以避免对筛选的影响，并且将洗脱和感染合并到一步[7]。 3.2双层膜筛选系统 获得重组噬菌体蛋白的方法是将筛选出的特 异噬菌体转入不含校正基因的菌株，将外源蛋白以可溶性蛋白的形式表达出来。通过细胞膜间隙最终进入培养基质中。针对这种情况，Skerra 等[8]建立了双层膜筛选系统。第一层膜为亲水性多孔膜，这种膜对蛋白质的结合能力小，孔径能让蛋白质分子自由通过，但细胞不能通过；第二层膜为疏水膜，膜表面包被目标蛋白(抗原或抗体)，两种膜分别覆盖在固体培养基上。细胞在第一层膜上培养一段时间后，将这层膜转移到第二层膜上培养，分泌的可溶性蛋白透过第一层膜，与第二层膜上的目标蛋白结合，然后再用已知的抗原或抗体筛选。这种方法避免了蛋白常遇到的细胞碎片的干扰，提高了筛选 效率。 3.3选择性感染噬菌体筛选系统 传统的筛选系统中基因重组的噬菌体仍有野 生型的gene Ⅲ蛋白的存在，因重组噬菌体具有感染能力，这导致在筛选后扩增时特异性和非特异性的噬菌体均可以进入宿主菌增殖。选择性感染噬菌体筛选系统把筛选和扩增合并为一步，只有特异性的噬菌体才能感染宿主菌扩增，而非特异性噬菌体却不能。此筛选系统是以噬菌体感染宿主菌的机理为基础，其基本原理是把其中之一用特定的多肽或蛋白替代，使噬菌体丧失感染力，再通过这些多肽与其配基的结合恢复感染能力。这样只有特异性的噬菌体可以通过配基配体结合才能恢复感染能力，进入宿主菌细胞内繁殖[9]。具体的做法有两种，其一是将噬菌体所有P Ⅲ外壳蛋白的N 端用所展示的多肽或蛋白取代，使其丧失感染能力，再把与所筛选的目的多肽或蛋白的特异配基同P Ⅲ蛋白的N 端相连作为筛选的探针，只有特异 性噬菌体才能与连接有P Ⅲ蛋白N 端的配基相结合，这种结合使噬菌体重新具有P Ⅲ蛋白的N 端，因而具有感染力；其二是将作为配基的多肽或蛋白融合在E.coli 的纤毛上，这样纤毛失去了介导的能力，只有特异性的噬菌体可与修饰了的纤毛结合，从而恢复纤毛的介导能力，使特异性的噬菌体进入细胞体内增殖，这一系统显示了较高的筛选效率。 4噬菌体肽库的应用4.1 抗原表位的研究 传统的抗原表位分析主要是通过分析抗原经 物理化学降解得到的片段或人工合成一系列来源于抗原的肽段与相关抗体的结合活性而得到，此方法成本高，必须首先确定蛋白质的氨基酸序列，才能合成相应的肽，而在实际研究中，许多蛋白质的序列并不清楚。噬菌体肽库技术将抗体作为受体暴露于肽库中，筛选到能与特异性抗体相结合的重组噬菌体肽的序列，弥补了合成肽筛选的不足。在抗原-抗体的识别研究中，不必源于天然抗原，可以从随机肽库中直接筛选出能和抗体结合的表位。尽管有时与天然表位在氨基酸顺序上可能不一致，但是
噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用
噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用 1985年,SmithGP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1]。1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3]。这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响。传统的药物筛选大多数是从自然界的动、植物及微生物中分离天然的具有特定药理作用的化学物质,然后直接应用或再以此作为药物化学的先导化合物,再进一步设计、加工、合成,筛选有效的功能药物。此方法具有一定的盲目性,筛选周期长。而采用分子进化工程技术则会大大加速这一过程。根据所需要的药物特性,选用适当的方法构建含有大量异质性分子的组合库,用靶分子进行筛选,先筛选药物先导化合物,然后进一步优化设计,最终确定候选的药物结构。近年来,引入组合策略和模拟进化思想,建立了一种从噬菌体随机肽库中筛选药物先导化合物的新方法[4],即用库容量极大的随机肽库去快速筛选具有较高特异性和亲和力的理想目的肽。通过此种方法可以快速筛选生物活性肽、蛋白质、受体及其他化合物等新型药物或先导化合物。这一方法具有传统的药物筛选无法比拟的优越性,将药物开发带入了一个崭新的时代。1噬菌体展示系统的建立早在1986年Geysen就认为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定族。在多数情况下,几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分,即蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部残基肽段间的相互作用来实现的。1982年,Dulbecco提出将病原体的免疫原与λ噬菌体和其他病毒的衣壳蛋白融合,便可产生能够用作疫苗的表面展示外来多肽的病毒颗粒。1985年,Smith描述了外源肽段在丝状噬菌体fd表面的展示结果。1988年,他们建立了新的表达载体——可选择抗体的丝状噬菌体fd载体,能将外源短肽表达并伸展到噬菌体表面,用亲和筛选可选到表达特异肽的噬菌体,通过测定噬菌体序列,就可以知道所表达肽段的氨基酸序列。这为噬菌体展示肽库的建立提供了技术保障。2噬菌体展示系统的类别噬菌体展示系统因载体和宿主细胞不同分别有:丝状噬菌体展示系统(包括p 、p 和噬菌体粒展示系统)、λ噬菌体展示系统及T4噬菌体展示系统。2.1丝状噬菌体展示系统:丝状噬菌体展示系统是外源基因与g3p或g8p基因融合,并将它以外壳蛋白表面多肽的形式展示出来。它是最早被用来展示外源肽或蛋白质的系统,也是目前应用最广、发展最完善的噬菌体展示系统。丝状噬菌体是单链DNA病毒,其通过与细菌纤毛的相互作用感染宿主细胞,然后将病毒DNA注入细菌的胞质,利用细菌胞质内的酶转变成复制的双链DNA,并通过滚动复制产生子一代DNA分子。噬菌体展示技术正是利用丝状噬菌体DNA的结构和复制特点,把丝状噬菌体M13或fd 作为良好的基因工程的载体。因它的DNA复制与装配不受DNA分子的限制,因此可以将外源DNA插入到其一些非必须区,仅导致噬菌体颗粒的加长,而不影响其感染宿主及装配,这样即可得到一些插入外源DNA的基因重组体。噬菌体还可把插入的DNA片段以融合蛋白的形式表达在衣壳蛋白上。2.2λ噬菌体展示系统:是将外源肽或蛋白质与λ噬菌体的主要尾部蛋白PV或λ噬菌体头部组装的必需蛋白——D蛋白融合而被展示。2.3T4噬菌体展示系统:T4噬菌体展示系统是将外源肽和蛋白质与T4噬菌体的小衣壳蛋白SOC的C端融合而被展示,也有将外源蛋白与T4噬菌体的次要纤维蛋白(Fibritin)的C末端融合而被展示。由于T4噬菌体是在寄主细胞内组装而不必通过分泌途径,因此它可展示的肽/蛋白质范围较广,尤其适合于展示那些不能被E.coli分泌的复杂蛋白质[6]。3噬菌体展示肽库的筛选方法3.1生物淘金法:是目前常用的、最早由Smith等设计的一种筛选方法。将靶分子包被在固相介质上,加入噬菌体肽库与之吸附,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收等亲和性的噬菌体,经过几轮“淘选”,可富集到特异性的噬菌体多肽。用于噬菌体肽库筛选的目标蛋白可以直
噬菌体展示总结技术
噬菌体展示总结技术 各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢篇一：噬菌体展示技术 噬菌体展示技术 关键词：噬菌体展示组装融合蛋白2008-07-21 00:00 来源：互联网点击次数：3662 噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。本文主要概述了噬菌体展示技术的基本原理、噬菌体展示系统研究以及技术特点等，并跟踪了目前该领域的最新研究进展和发展前景。 关键词：噬菌体展示；组装；融和
蛋白 1985年，Smith G P[1]第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。 另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。近年来，随着噬菌体展示技术的日益完善，该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显。 一、噬菌体展示技术的原理 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳
蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。思想汇报专题被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集 [2]。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。 二、噬菌体展示系统 单链丝状噬菌体展示系统 （1）PⅢ展示系统。 丝状噬菌体是单链DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个～5个拷贝
噬菌体随机肽库_中文说明书_phage_display
目录 简介 (2) 培养基和溶液 (5) 常规M13方法 (6) 淘选程序（固定靶分子） (8) 结合克隆的特征 (12) 其他淘选方法（液相结合法） (15) 其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法） (16) 附录：优化肽结合相互作用 (19) 文库的氨基酸分布 (21) 试剂盒组成：（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存）： ?随机十二肽噬菌体展示文库100 μl, 1.5×1013 pfu/ml。贮存于含50%甘油的TBS溶液中。复杂度~2.7×109个转化子。 ?-28 gIII测序引物5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/μl ?-96 gIII测序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/μl, 1 pmol/μl ?E.coli ER2738宿主菌F’lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk –m k–McrBC–)。该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。贮存于-70℃。 ?链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉1.5 mg ?生物素，10 mM 100 μl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。 概述 噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。 展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。）生物活性肽分子的鉴定可以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15）。蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体（16）。另外，大的蛋白质分子[如：抗体（17）、激素（18）、蛋白酶抑制剂（19）、酶（20）和结合蛋白（21）]也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。 Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，因
噬菌体抗体库技术(1)
噬菌体抗体库技术 张爱华 余模松 【摘要】 噬菌体抗体库技术是20世纪90年代继噬菌体展示技术发展而来。这一技术彻底改变了抗体制备的传统途径,使抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。本文对与基因工程抗体相关的噬菌体展示技术以及噬菌体抗体库技术作一综述。 【关键词】 噬菌体展示技术;噬菌体抗体库技术;免疫抗体库 【中图分类号】R 392.11 【文献标识码】A 【文章编号】1673-4211(2006)01-0013-04 作者单位:430060武汉生物制品研究所免疫学研究室 20世纪80年代,随着DNA 重组技术的进展和抗体基因结构的阐明,产生了基因工程抗体技术。早期用于构建基因工程抗体的抗体基因主要来源于小鼠杂交瘤细胞。由于要获得杂交瘤细胞必须经过动物免疫、细胞融合及克隆筛选这样一个长期、复杂的过程;而且利用杂交瘤技术很难制备人源抗体和抗自身抗原或弱免疫原性抗原的抗体,所以限制了基因工程抗体技术的推广和应用。20世纪90年代,人们又将噬菌体展示技术应用到抗体的表达和克隆,将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因文库和抗体在大肠杆菌功能性表达与高效快速的筛选手段结合起来,产生了噬菌体抗体库技术,这一技术彻底改变了抗体制备的传统途径,由此抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术[1]。 1 噬菌体展示技术 1985年Smith [2]首次阐述了噬菌体展示技术,该技术通过将外源蛋白或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA 中,与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,从而使该外源分子呈现于噬菌体表面。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内,即在噬菌体表面表达特定蛋白,而在噬菌体核心DNA 中含有该蛋白的结构基因,通过表型筛选就可以获得其编码基因,因此噬菌体展示技术是一种强有力的基因表达筛选技术。 蛋白质可以展示在更小的丝状噬菌体颗粒的表面,这就是噬粒展示系统[3] 。噬粒的基因组中包含丝状噬菌体的基因间隔区,包括病毒颗粒和互补链合成的复制起始点以及发夹包装信号,同时也含 有质粒的复制起始点和抗性基因。噬粒也可以像质粒一样操作,假如需要,可以直接在细菌中表达目的蛋白。采用丝状辅助噬菌体感染细菌可以激活噬菌体的复制起始点,从而导致单链噬粒DNA 被包装进由辅助噬菌体蛋白形成的丝状噬菌体样的颗粒中,由于辅助噬菌体缺乏包装信号,所以产生的大多数噬菌体为含有噬粒单链DNA 的颗粒[4],将这种噬粒和噬菌体混合物感染细菌,筛选具有抗性的克隆,这种带抗性的克隆只含有噬粒DNA,可再次通过辅助噬菌体的感染进行扩增。由于噬粒颗粒可以传播抗性基因,所以有时又把这种颗粒称为“转导颗粒”。 p Ⅲ蛋白是一种最常用于展示外源片段的噬菌体外壳蛋白。其缺点是每个噬菌体颗粒表面仅有5个p Ⅲ分子,但是它的优点是带大的插入片段的p Ⅲ分子可以被很好地包装进噬菌体颗粒中。在绝大多数情况下,外源蛋白插入在信号序列和p Ⅲ蛋白第一结构域(N 1)的起始位点之间,一方面外源蛋白不影响噬菌体的包装,另一方面,外源蛋白位于包装颗粒的最末端,所以当通过p Ⅳ蛋白孔时,其空间位阻较小。但问题是大片段的插入降低了噬菌体的感染能力,甚至使噬菌体无感染性,因此限制了某些特殊蛋白的选择。这一问题可以通过杂交噬菌体得到解决,即仅有一个p Ⅲ分子用于展示蛋白,具体方案是将外源蛋白构建到噬粒载体中,转化细菌后,再用辅助噬菌体超感染,这样细菌中的大多数p Ⅲ蛋白为来源于辅助噬菌体的野生型分子[5] 。噬菌体展示活性蛋白的能力主要依赖于以下几个方面的因素,比如融合蛋白能否被正确地转移到细菌内膜,能否正确地折叠,能否在外周质中逃避降解以及能否被包装进噬菌体颗粒中。外源蛋白也可以插入到p Ⅲ蛋白的N1和N2以及N 2和CT 结 ? 13?国际生物制品学杂志2006年2月第29卷第1期 Int J Biolog icals,February 2006,Vol 29,No.1
噬菌体展示技术解析
噬菌体展示技术解析 噬菌体展示技术经过近20年的发展和完善，已被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。噬菌体展示系统模拟了自然免疫系统，使我们有可能模拟体内抗体生成过程，构建高亲和力抗体库。由于噬菌体展示技术实现了基因型和表型的有效转换，使研究者在基因分子克隆基础上实现了蛋白质构象体外控制，从而为获取具有良好生物学活性的表达产物提供了强有力手段。另外，噬菌体展示技术已成为不经过免疫获取特异性人源抗体的新途径，为获取对人类和动物疾病有诊断和治疗价值的单克隆抗体提供了重要手段。 应用面这么高大上，那么原理到底是什么呢？那接下来将由小编为您揭开其神秘的面纱！ 一、噬菌体展示技术的原理 噬菌体展示技术（phage display）是将多肽或蛋白质的编码基因插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。展示到噬菌体表面的多肽或蛋白保持相对独立的空间结构和生物活性，可以与靶分子结合和识别。噬菌体展示的肽库或蛋白库与固相抗原结合，洗去未结合的噬菌体，然后用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。下图粗略展示了技术筛选的过程： 二、噬菌体展示系统的分类 1.M13噬菌体展示系统 M13噬菌体属于单链环状DNA病毒，其基因组为6.4kb，编码10种蛋白，其中5种为结构蛋白，包括主要衣壳蛋白的PⅧ和次要衣壳的pⅢ、pⅥ、PⅦ和PⅨ。其中，pⅢ和PⅧ是噬菌体展示中最常用的两种蛋白，构建了pⅢ和PⅧ展示系统。pⅢ蛋白分子量为42 kDa，
噬菌体展示技术操作步骤
筛选多肽 试剂及配制 （1）LB培养基： 胰蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 5g 溶于去离子水，至1L，高压灭菌，4℃保存。 （2）IPTG/Xgal： 称取1.25g IPTG，1.0g Xgal，溶于二甲基甲酰胺，至总体积25ml，-20℃避光保存。（3）LB/IPTG/Xgal平板： 1L LB培养基+15g琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃以下，加入1ml IPTG/Xgal，立即铺板，4℃避光保存。 （4）顶层琼脂糖凝胶： 胰蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 5g MgCl2.6H2O 1g 琼脂糖7g 溶于适量去离子水中，至总体积为1L。高压灭菌，分装为50ml/份，室温保存，使用时于微波炉内融化。 （5）2×M9盐： Na2HPO412g KH2PO46g NaCl 1g NH4Cl 2g 溶于适量去离子水中，至终体积为1L。 （6）小型平板： 500ml 2×M9盐 500ml 3%琼脂粉 20ml 20%葡萄糖 2ml 1M MgSO4 0.1ml 1M CaCl2 1ml 硫胺素（10mg/ml） 在混合之前，将上述成分分别高压灭菌并冷却至70℃以下，葡萄糖和硫胺素采用过滤除菌。平板储存于4℃。 （7）封闭缓冲液： 0.1M NaHCO3(PH 8.6) 5mg/ml BSA 0.02% NaN3 过滤除菌，储存于4℃。 （8）TBS： 50mM Tris-HCl (PH 7.5) 150mM NaCl
高压灭菌，室温储存。 （9）PEG/NaCl： 20%（w/v）聚乙二醇-8000 2.5M NaCl 高压灭菌，室温储存。 （10）碘化物缓冲液： 10mM Tris-HCl (PH 8.0) 1mM EDTA 4M NaI 室温避光保存。 操作步骤： 1．第一天 （1）以0.1M NaHCO3(PH 8.6)制备 100μg/ml的靶分子溶液。如果需要稳定靶分子，可以用含有金属离子的相似离子强度缓冲液。 （2）在每孔内加入1.5ml 靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润（这一步要多注意，尽量避免溶液形成液珠）。 （3）在湿盒中，4℃温和振荡孵育过夜。4℃保存于湿盒中备用。 2．第二天 （4）将ER2537（滴度测定时用来铺板的细菌培养物）接种至10ml LB培养基中。如果是在同一天扩增洗脱的噬菌体，也可以将ER2537过夜培养物接种于含有20ml LB培养基的250ml锥形瓶中（比例为1：100）。37℃剧烈振摇。 （5）将平皿反扣在洁净的纸巾上，去除包被液，加满封闭液，4℃孵育至少1h。 （6）去除包被液。用TBST（TBS+0.1%Tween-20）快速洗涤6次。反复旋转确保孔底及孔侧面都被洗涤。按照步骤5的方法去除洗涤液（也可利用自动洗板机洗涤）。洗涤要迅速，避免平皿干燥。（注意每次更换纸巾，以避免交叉污染）。 （7）用1ml TBST稀释4×1010噬菌体（10μl原库），加至包被后的平皿内，室温下轻缓摇动10-60min。 （8）以步骤5的方法去除未结合的噬菌体。 （9）以步骤6的方法用TBST洗涤板子10次，每次换用洁净的纸巾，避免交叉污染。 （10）用1ml的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。洗脱液可以是含有配体（0.1-1mM）的TBS，或是含有靶蛋白（100μg/ml）的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白竞争结合噬菌体。室温下轻缓摇动10-60min。将洗脱液转入微量离心管中。 （10a）或使用通用缓冲液，0.2M甘氨酸-盐酸（PH2.2），1mg/ml BSA。轻缓摇动不超过10min，将洗脱液转入微量离心管中，以150μl 1M Tris-HCl(PH 9.1)中和。 （11）取小量洗脱液（1μl）测定滴度，如果有必要，可将第一轮或第二轮测定滴度的噬斑进行测序（见后续操作）。（未用的洗脱物可4℃保存过夜，第二天进行扩增。在这种情况下，用LB过夜培养ER2537，第二天，用LB培养基以1：100将该培养物稀释至20ml，加入未扩增的洗脱液，在250ml的锥形瓶内，37℃剧烈振摇孵育4.5h，进入步骤13）。 （12）将剩余的洗脱物进行扩增：将洗脱物加入20ml ER2537培养物中（对数早期），37℃剧烈振摇孵育4.5h。 （13）将培养物转入微量离心管中，4℃，10000转离心10min，将上清转入新的离心管中，再次离心。 （14）将80%的上清转入新的离心管中，加入1/6体积的PEG/ NaCl。4℃沉淀噬菌体至
噬菌体展示肽库说明书
ProteIn tooLS Ph.D.? Phage Display Libraries Instruction Manual neB #e8100S, #e8101S, #e8102L, #e8110S, #e8111L, #e8120S, #e8121L Store at –20°C
table of Contents: Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 Media and Solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 General M13 Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7 Construction of pIII-Display Libraries using M13KE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9 Panning Protocols Protocol 1: Surface Panning Procedure (Direct Target Coating) . . . . . . . . .14 Protocol 2: Solution-phase Panning with a Biotinylated Target and Streptavidin Plate Capture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18 Protocol 3: Solution-phase Panning with Affinity Bead Capture . . . . . . . . .19 Post Panning Protocols Plaque Amplification for ELISA or Sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22 Sequencing of Phage DNA Rapid Purification of Sequencing Templates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23 Phage ELISA Binding Assay with Direct Target Coating . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 Use of Synthetic Peptides in Specificity Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27 Expression of Selected Sequences as Monovalent MBP Fusions . . . . . . . . . . . . . . . .27 Appendix: Optimizing Peptide Binding Interactions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29 Choice of Library . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 Selection of Cell-Specific Peptides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38 Ordering Information . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41 1
噬菌体展示技术的原理及应用
噬菌体展示技术的原理及应用 将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合（插入信号肽与衣壳蛋白基因间）后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，每个噬菌体只含1个外源基因，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性，展示在噬菌体的表面。导入了各种各样外源基因的一群噬菌体，就构成一个展示各种各样外源肽的噬菌体展示库。 当用一个蛋白质去筛查一个噬菌体展示库（展示文库为流动相，被筛蛋白为固定相）时，就会选择性地同与其有相互作用的某个外源肽相结合，从而分离出展示库里的某个特定的噬菌体，研究该噬菌体所含外源基因的生物学功能。 技术发展 噬菌体展示优越性 1、将蛋白与其遗传信息之间提供了直接的物理联系，可有效的对所需功能的克隆进行反复筛选并扩增。 2、被展示多肽或蛋白结构功能与天然状态接近，可简便快速筛选得到与靶分子高亲和力的被展示物。 3、筛选过程中，特定的噬菌体克隆由于对其配体的特意亲和性而不断的得到富集，从而使相对稀少的可以结合配体的克隆能够快速、有效地从一个大文库中被筛选出来。 4、与其它技术相比，容易对库容量较大的文库进行筛选。
噬菌体展示局限性： 1、肽库容量受大肠杆菌转化效率影响，容量一般在109，高于此限制的较多基因将难以表达； 2、编码多肽的基因带有一定的密码子偏爱性，限制了肽库的复杂度； 3、噬菌体宿主大肠杆菌的生物合成系统有自身的限制因素，如缺乏氨基酸修饰、蛋白糖基化、不能合成D型氨基酸。 4、在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就限制了所建库的分子多样性。 5、不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。 应用范围 肿瘤研究及药物靶向治疗 诊断用疫苗研发 酶抑制剂筛选 构建抗体/cDNA文库 研究蛋白质与核酸相互作用的生物学过程 研究新型的基因导向系统 Eg1：从HBx（肝癌相关抗原）单抗细胞中克隆重链可变区基因，重组入M13噬菌体，验证表达产物具有活性，然后表达出单链抗体、单域抗体或嵌合抗体，为肝癌导向治疗研究提供基础。 Eg2：为解决非典型嗜血流感杆菌毒力因子表面蛋白混合寡糖LOS制备疫苗遇到的免疫原型弱的问题，用兔抗LOS筛选肽库，得到4个一致性序列，其中3个与兔抗亲和力高。用筛选得到的3个高亲和力肽免疫兔得到的抗体对染病小鼠模型具有抗体保护性作用。
噬菌体展示肽库说明说 中文版
应用噬菌体表面展示肽库快速筛选肽配体使用手册 含tet选择性F因子的新大肠杆菌宿主菌：不再需要minimal平板 贮存于：-20℃ 目录： 简介 (2) 培养基和溶液 (5) 常规M13方法 (6) 淘选程序（固定靶分子） (8) 结合克隆的特征 (12) 其他淘选方法（液相结合法） (15) 其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法） (16) 附录：优化肽结合相互作用 (19) 文库的氨基酸分布 (21) 试剂盒组成：（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存）： ?随机十二肽噬菌体展示文库100 μl, 1.5×1013 pfu/ml。贮存于含50%甘油的TBS溶液中。复杂度~2.7×109个转化子。 ? -28 gIII测序引物5’-HO GTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/μl ? -96 gIII测序引物5’-HO CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/μl, 1 pmol/μl ? E.coli ER2738宿主菌F’ lacI q Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (Tet R)/fhuA2 supE thi Δ (lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (r k –m k–McrBC–)。该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。贮存于-70℃。 ? 链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉1.5 mg ? 生物素，10 mM 100 μl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。该产品仅售为研究用，不得以任何形式进行商业再销售。用该类产品发现的序列的商业化可能需要来自Dyax公司的美国专利5,223,409、 5,403,484和/或5,571,698及其相关专利权的授权。有关授权信息请与Dyax Corp. 的企业发展部主管联系：Director of Corporate Development, Dyax Corp., Bldg. 600, Cambridge, MA 02139, fax 617-225-2501。 概述： 噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体（见图1）。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。 展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。）生物活性肽分子的鉴定可以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15）。蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体（16）。另外，大的蛋白质分子[如：抗体（17）、激素（18）、蛋白酶抑制剂（19）、酶（20）和结合蛋白（21）]也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。 Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，因而是一个组合文库。所展示的十二肽表达在pIII的N末端，即：成熟蛋白的第一个氨基酸就是随机十二肽的第一个氨基酸, 十二肽后面是一段短小的间隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser组成，然后是
病原微生物第4章 噬菌体习题与答案
第 4 章噬菌体 一、填空题 1.噬菌体的主要化学组成是____________和____________。 2.整合在细菌基因组中的噬菌体基因组称为___________，带有噬菌体基因组的细菌称为______________。 3.根据噬菌体与宿主菌的相互关系，可将噬菌体分为__________和_________。 4.毒性噬菌体的复制周期包括____________、_________、_________、________。 二、判断改错题 1.噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 2.噬菌体感染宿主菌具有高度特异性，是一种专性细胞内寄生的真核细胞型微生物。 3.严格寄生在敏感宿主菌细胞内只有裂解期，而无溶原期的噬菌体称为溶原性噬菌体。 三、选择题 【A型题】 1.溶原性细菌是指 A.带有毒性噬菌体的细菌 B.带有前噬菌体基因组的细菌 C.带有 R 因子的细菌 D.带有 F 因子的细菌 E.带有 Coi 因子的细菌 2.前噬菌体是指 A.整合在宿主菌染色体上的噬菌体基因组 B.尚未装配好的噬菌体 C.毒性噬菌体 D.未感染宿主菌的噬菌体 E.未整合到宿主菌染色体上的噬菌体 3.下列致病菌中，产生毒素与噬菌体有关的是 A.霍乱弧菌 B.大肠杆菌 C.肺炎杆菌 D.白喉杆菌 E.破伤风梭菌 4.关于噬菌体的叙述，哪一项是错误的？ A.侵袭细菌、真菌、螺旋体等微生物的病毒 B.主要由核酸和蛋白质组成 C.由严格的宿主特异性 D.对理化因素的抵抗力比一般细菌强 E.每个噬菌体都含有 RNA和 DNA 【X 型题】 1.噬菌体的特性有 A.能通过滤菌器 B.没有完整的细胞结构 C.只含有一种核酸 D.专性活细胞寄生 E.以复制方式生长繁殖 3.毒性噬菌体溶菌周期的步骤有 A.吸附 B.穿入 C.生物合成 D.组装成熟 E.释放 四、名词解释 1.噬菌体（phage） 2.毒性噬菌体（virulent phage） 3.溶原性噬菌体活温和性噬菌体（lysogenic phage or temperate phage） 4.溶原性细菌（lysogenic bacterium）
基因工程 考试 重点 噬菌体载体
第二章 DNA重组克隆的单元操作 练习题 噬菌体载体(练习题) 一、填空题 1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。2．第一个报道的全测序的单链DNA 噬菌体是φX174，DNA 长5386 个碱基对，共个基因，为一环状DNA 分子，基因组的最大特点是。 3．λ噬菌体的基因组DNA 为kb，有多个基因。在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按复制，成熟包装(晚期复制)则是按复制。它有一个复制起点，进行向复制。λ噬菌体的DNA 既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。其原因主要是在λ噬菌体线性DNA 分子的两端各有一个个碱基组成的天然黏性末端。这种黏性末端可以自然成环。成环后的黏性末端部位就叫做位点。4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为kb，插入的外源片段最大不超过kb。 5．野生型的M13 不适合用作基因工程载体，主要原因是和。 6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS 位点序列来 自，最大的克隆片段达到kb。 7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。从酶切点看，插入型为个，取代型为个。 8．野生型的丸噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。9．M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1) (2) (3) 。10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA 共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 11 ．M13 单链噬菌体基因2 和基因4 之间的IG 区有三个最重要的功能，即(1) (2) (3) 。 12．野生型的M13 有10 个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是：和。 13．以λ噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA 的长度是不同的，前者为 kb，后者为kb。 14．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA 片段后，总的长度应在噬菌体基因组的的范围内。 二、判断题 1. 取代型载体(replacement vector)是指同一种限制性内切核酸酶在),DNA 中具有两个切 点，外源DNA 通过取代这两个切点间的片段被克隆。 2. 现在最常用的pUC 载体是pUCl8,它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制。另外，这种载体可在辅助质粒的帮助下合成单链DNA。 3. 噬菌粒(phagemid)pUCll8／pUCll9 载体是集质粒和丝状噬菌体有利特征于一身的载体，既能合成单链DNA,又能合成双链DNA。 4. λ噬菌体DNA 和M13 单链噬菌体DNA 在成熟前的DNA 复制都是用滚环模型。 5. M13 噬菌体每个世代裂解宿主后，可释放100 个子代噬菌体。 6. 以黏粒为载体的重组体虽然在平板上生长的速度不同，但是转化子中插入片段的扩增量
!噬菌体展示随机肽库及其在抗原表位研究上的应用
第13卷第1期 2005年1月 中国兽医寄生虫病 Chinese Journal of Veterinary Parasit ol ogy Vol .13No .1 Jan .2005 收稿日期:2004208209 噬菌体展示随机肽库及其在抗原表位研究上的应用 王欣之 傅志强 (中国农科院上海家畜寄生虫病研究所,上海200232) 摘 要:本文主要介绍了噬菌体展示系统的原理,并就噬菌体表面展示系统的不同表达载体类别,分别做了描述,同时讨论该展示系统在抗原表位研究上的应用。关键词:噬菌体展示;随机肽库;抗原表位 中图分类号:Q939.48 文献标识码:A 文章编号:100520868(2005)0120042204 PHAGE D I SPLAY RAN DOM L I BRAR Y AND I TS APPLY I N EP I TO PE RESEARCH WANG W in 2zhi,F U Zhi 2qiang (Shanghai Institute of D o m estic A ni m al Parastitology,Shanghai 200232,China ) Abstract: This paper maj ors in intr oducing the p rinci p le of phage dis p lay syste m ,and describing the s orts of this syste m individually as different exp ress vect or .Furher more,we discusse the app licati on of this syste m es pecial 2ly in ep it ope research . Key words: phage dis p lay;random library;ep it ope 抗原表位(ep it ope )或抗原决定簇(antigen de 2ter m inant )一般有两种类型:一种是连续抗原表位,其氨基酸序列在一级结构上是连续的;另一种是不连续的,由一级结构上不连续的氨基酸残基经过肽链的空间折叠而聚集在一起形成的。研究抗原表位的方法很多,对于连续的抗原表位一般采用合成一系列部分重叠的小肽来确定表位的位置以及每个氨 基酸残基的作用[1] ,对于不连续的抗原表位,则可以采用表面模拟合成(surface si m ulati on synthesis )技术等。这些方法都有很大的局限性:需要预先知道该表位的一级结构的序列或结构信息。 随机肽库(Random pep tides library,RP L )是包括了20种氨基酸所有可能排列的多肽的组合体。按表达载体的不同,随机肽库又分噬菌体、质粒、细菌、核糖体等表面展示随机肽库和化学合成的随机肽库等,其中表面展示的随机肽库及其筛选技术最成熟,应用也最广泛。 1 噬菌体展示的基本原理 S m ith (1985)最先将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ,使目的基因编码的多肽能以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面,从而创建了噬菌体展示 技术[2] 。 噬菌体展示技术是一种基因表达产物与亲和选择相结合的技术。这项技术的主要原理是将蛋白质或多肽的DNA 序列插入到噬菌体颗粒外壳蛋白的一个结构基因的适当位置,外源基因随外壳蛋白的表达而表达,由于被修饰了的外壳蛋白仍然保持与噬菌体颗粒的兼容性,外源基因产物随病毒颗粒的 重新组装而展示到病毒外壳蛋白的表面[3] 。被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立空间结构和生物活性。通过反复的亲和选择和扩增,可直接测定所展示的多肽或蛋白质的某些地区生物活性并分离出带有目的基因的噬菌体。 2 噬菌体表面展示系统 按表达外源蛋白的噬菌体类别的不同,可将噬 菌体展示系统分为丝状噬菌体展示系统、 λ噬菌体