基因敲除技术最新研究进展及其应用_陶果

基因敲除技术最新研究进展及其应用

陶果1，2，信吉阁1，2，肖晶2，刘海京2，成文敏1，2，查星琴1，2，曾养志2*

（1．云南农业大学动物科学技术学院，云

南昆明650201；2．云南省版纳微型猪近交系重点实验室，云南昆明650201）

摘要基因敲除技术是基因功能研究的最直接和有效的方法之一。近年来发展起来多种基因组功能性研究的高效工具，包括ZFNs 、TALENs 和Cas9等，为高效率基因打靶开辟了一条全新的思路。这些基因编辑的革命性技术，能大力推动生物学、医学研究的发展。但

对这些新技术还没有进行系统研究。文中对基因敲除发展历程、

技术原理以及新技术的应用等进行概述，为基因敲除技术的进一步发展应用提供依据

。关键词基因敲除；ＲNA 干扰；ZFNs ；TALENs ；Cas9中图分类号S188文献标识码A 文章编号0517－6611（2013）29－11605－04Ｒesearch Advance of Gene Knockout Technology and Its Application

TAO Guo et al （Animal Science and Technology College ，Yunnan Agricultural University ，Kunming ，Yunnan 650201）

Abstract The gene knockout technology was deemed to be one of directly and effectively methods in gene function research．Ｒecently ，several effective tools ，including ZFNs ，TALENs ，Cas9，were developed quickly and opened the new mentality for gene targeting．These revolutionary technologies of gene editing would significantly promote the development of biology and medicine．However ，reviews for the new technology are still few．In this paper ，it gives a quick overview of develop history ，technical principle ，application for gene knockout technology ，which will provide a reference for further development and application of gene knockout technology．Key words Gene knockout ；ＲNAi ；ZFNs ；TALENs ；Cas9

基金项目

国家自然科学基金项目（31360532）；云南省应用基础研究

计划项目（2013FB041）；云南农业大学动物科学技术学院科研基金项目（SW000126）。

作者简介陶果（1986－），男，云南宜城人，硕士研究生，研究方向：胚

胎生物技术，E-mail ：synlelovely@163．com 。*通讯作者，教

授，从事遗传学研究，

E-mail ：zengyangzhi@sina．com 。收稿日期2013-08-18基因敲除技术是建立在基因同源重组技术以及胚胎干细胞技术的基础上而发展起来的一种分子生物学技术。1987年Thompsson 建立了完整的ES 细胞基因敲除的小鼠模型

［1］

。2007年度诺贝尔生理学或医学奖授予了美国科学家Mario Ｒ．Capecchi 、Oliver Smithies 和英国科学家Martin J．Ev-ans ，以表彰他们在

“涉及使用胚胎干细胞进行小鼠特定基因修饰方面的一系列突破性发现”［2］

。而近年来新兴起了

ZFNs 、TALENS 、Cas9等多种基因高效靶向修饰和调控技术。2012年1月基因组编辑核酸酶技术的《Nature Methods 》杂志评选为年度研究方法

［3］

，2012年12月被Science 杂志评为

2012年度十大科学进展之一［4］。这些技术极大地提高了基因敲除的效率，

且具有极高的特异性，为研究基因功能创造了新的途径必将极大地推动生物学、医学研究的发展，但阐述这些新技术原理及最新进展的研究鲜有报道。因此，笔者将就基因敲除发展历程、技术原理以及新技术的应用等进行概述，现报道如下。1传统基因敲除方法

1．1

利用同源重组进行基因敲除

基因敲除（gene knock －

out ），又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA 同源重组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的

［5］

。传统的基因敲除技

术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换，但在体

细胞内，基因同源重组的效率特别低（低于10－6），增加了实

际操作的工作量，

限制了该项技术的应用。而且，用单纯的同源重组实现人类基因组的永久修复是不切实际的，这也严重阻碍了生物学研究的发展

［6］

。

基因敲除技术分为完全基因敲除和条件型基因敲除。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除［7］

。现阶段条件型基

因敲除以噬菌体的Cre /Loxp 系统和酿酒质粒的FLP /FＲT 系

统应用最为广泛

［8］

。基因敲除技术已从最初简单的完全敲

除发展到条件敲除阶段，

现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。常见的策略有正负双向筛选、启动子捕获、进退策略、双置换法、标记和交换法以及重组酶介导的盒子交换法等，这些技术从不同方向发展了基因敲除技术。

小鼠基因敲除操作技术得以较广泛的应用，这是基于完善的胚胎干细胞系统和胚胎重建技术，

由于大多数动物尚未建立胚胎干细胞系统以及胚胎重建技术发展缓慢，大动物基

因敲除的发展受到了很大限制。目前只有通过在体细胞中打靶并进行克隆即体细胞克隆与基因敲除技术相结合可补弥大动物中没有ES 细胞的缺陷、实现定点整合。但由于体细胞扩增能力的有限和同源重组发生的几率低下，且在体外进行长期、

大量的筛选，经过长时间的培养和药物筛选，供体细胞易衰老，染色体也可能受到损伤，所以大动物基因敲除模型获得成功的报道并不多［9－11］

。

1．2

利用随机插入突变进行基因敲除

大规模的随机插入

突变理论上可实现在基因组范围内敲除任一基因。这项技术具有效率高、基因完全失活以及容易分离鉴定等优点。目前较为有效的方法是随机插入突变可以分为T-DNA 插入突变和转座子插入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲除手段。T-

DNA 插入失活技术是利用根癌农杆菌T-DNA 介导安徽农业科学，Journal of Anhui Agri．Sci．2013，41（29）：11605－11608，11644责任编辑石金友责任校对卢瑶

DOI:10.13989/https://www.wendangku.net/doc/a05371230.html,ki.0517-6611.2013.29.001

转化，将一段带有报告基因的DNA序列标签整合到基因组DNA上。可以直接在植物基因组DNA中产生稳定的插入突变，而且插入位点的随机性较强，但是只适用于那些容易被T-DNA转化的植物，且常常会引起染色体重排现象，使突变体表型与T-DNA插入无关而难以进行遗传学分析。这种方法在拟南芥中可产生35% 40%的突变率，19%的突变体具有外观可察觉到的表型特征［12］。近年将T-DNA插入突变在拟南芥研究中应用广泛［13］。转座子插入突变是利用转座子在染色体上可移动的特点，当其跳跃插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型。植物特别适合于转位插入突变，因为获得的基因突变可以保留在杂合子的植株中，而通过F1代植株自交产生的F2代植株中可获得纯合子的突变体植株。利用转座子进行基因敲除具有很大便利，仅需已知外显子，载体构建简单，可携带多种不同抗性基因，同时处理多基因［14］。转座子插入突变只适用于存在内源活性转位子的植物种类，但这样的植物并不多。

2新兴的基因敲除技术

2．1利用ＲNA干扰引起的基因敲除ＲNA干扰（ＲNA in-terference，ＲNAi）是ＲNA依赖的基因沉默现象，是双链ＲNA （double strandedＲNA，dsＲNA）分子在mＲNA水平上诱发的序列特异性的转录后基因表达沉默［15］。dsＲNA在Dicer酶的作用下可产生一系列长度为21 22nt的siＲNA（small in-terferenceＲNA），siＲNA分子、核酸酶以及螺旋酶等结合形成ＲNA诱导沉默复合物（ＲNA－induced silencing complex，ＲISC），ＲISC以ATP依赖的方式催化双链siＲNA解旋，利用ＲISC内部的单链siＲNA，通过碱基配对识别与之互补的靶ＲNA，切割靶ＲNA，并由ＲNA酶降解，从而导致目的基因的沉默。因此，通过将dsＲNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其同源的mＲNA，封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现基因的敲除。

ＲNAi广泛存在于真菌、植物和动物中，可抑制单个基因、基因家族和整个基因组基因表达，并且可用于试验上较难研究的系统。ＲNAi具有特异性强、效率高、穿透性强等特点［16］。但ＲNAi不能作用于所有基因和某些细胞类型（如神经元），但存在位置效应，临时性和不完全敲除的弊端。因此，ＲNAi不能完全取代传统的基因敲除技术［17］。

2．2锌指核酸酶基因打靶技术锌指核酸酶基因打靶技术（Zinc finger nucleases，ZFNs）的核心设计思想是将2个有特定功能的结构域，即特异性识别模块和功能模块融合，形成具有特定功能的蛋白［18］。单个ZFN的DNA结合结构域一般包含3 6个Cys2－His2锌指蛋白重复单位，能特异性识别1个三联体碱基。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当2个识别位点相距6 8bp距离时，2个单体ZFN相互作用产生酶切功能［19］。在此特异位点产生1个DNA双链切口（Double strands breaks，DSB），然后利用细胞固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修复，从而达到精确定点修饰的目的［20］。近5年来，研究者已经在果蝇、线虫、植物、两栖类以及培养的人类干细胞中陆续报道了利用ZFNs人为造成特定基因位点的DSB，从而实现高效率的基因定点修饰。ZFN介导的基因敲除技术，可以精确地修饰基因或其周围的调控元件，可为研究人类疾病构建良好的动物模型，通过原核注射或胞质注射获得的基因敲除大鼠、基因敲除兔［21－22］。存在同源区的外源DNA时，发生同源重组修复，能实现外源基因的定点敲入

。

图1ZFN结构示意图片［23］

2．3利用TALEN切割特定的核苷酸靶序列引起的基因敲除TALENs（Transcription Activator-like（TAL）Effector Nu-cleases）靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，被认为是基因敲除技术发展的里程碑。TALENs的设计和构建是基于植物病原体黄单胞菌（Xanthomonas）分泌的一种转录激活子样效应因子（Transcription activator-like effector，TALE）可以识别DNA序列的原理。TALE蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核苷酸序列有恒定的对应关系，由34个氨基酸重复序列组成一个单元，重复17 18次，34个氨基酸中的第12和13个氨基酸（Ｒepeat Variant Di－residue，ＲVD）对应识别1个目标碱基。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块蛋白。TALE蛋白中的DNA结合域与FokI核酸内切酶的切割域融合，在特异的位点打断目标基因，进而在该位点进行DNA操作，如敲入（Knock－in）、敲出（Knock－out）或点突变［24］。

TALEN能够对动植物细胞的基因组进行高度特异的和高效的修饰。近2年来已现已成功应用于动物（人类，鼠，斑马鱼，爪蟾，家蚕，家畜）、植物（烟草、水稻、拟南芥）以及微生物（酵母、病毒）等［25］。TALENs成功解决了常规的ZENs方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有与ZENs相等或更好的活性，无基因序列、细胞、物种限制，试验设计简单准确，成本低，成功率几乎可达100%，毒性低，脱靶情况少，使基因操作变得更加简单、方便。

2．4Cas9基因敲除技术2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CＲISPＲ）/CＲISPＲ－associated（Cas）9出现，主要由细菌和古细菌通过一种不断进化适应的免疫防御系统改造而成，II 型CＲISPＲ/Cas9免疫系统依赖Cas9内切酶家族靶向和剪切外源DNA。其特点是制作简单，成本低，作用高效［27］。Zhang等首次报道利用CＲISPＲ/Cas9系统对人293T细胞的EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞的Th基因实现

60611安徽农业科学2013年

图2

TALEN 原理示意图片

［26］

了定点突变

［28］

；Mali 等将改造的CＲISPＲ/Cas9系统在人

293T 细胞和K652细胞基因的靶位点形成双链或是单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制（包括非同源重组的末端链接修复和精确的同源重组机制），高效地介导外源基因的定点插入

［29］

。这些工作将进一步靶向基因操纵推向高

潮，使得多个基因敲除、敲入变得更为简单、高效。作为一种新的基因编辑技术，

CＲISPＲ/Cas9有靶向精确性高、试验周期短、

无物种限制、具有好的活性等特点和优势。不仅如此，CＲISPＲ/Cas 系统还可以同时针对同一细胞（ES ）中的多个位点能实现多靶点同时酶切，人们运用该技术成功获得斑马鱼等模式动物基因敲除模型，

使得多个基因敲除、敲入成为可能。虽然目前对该技术的特异性及免疫原性了解甚少，但随着研究的不断深入，一定会有很大的改善。在未来的2 3年，动植物育种、干细胞定向分化、遗传疾定点修复等都将得到迅猛的发展

。

图3

Cas9原理示意图片［30］

3基因敲除技术的应用3．1

基因敲除技术与动物模型

通过改变与特定疾病相关

的基因，可建立疾病模式动物。利用这些疾病模式动物，研究者可以对疾病的发生、发展以及各种遗传学与化学干预措施对疾病的影响进行研究。ZFN 已经成功应用于黑长尾猴、大鼠、小鼠、中国仓鼠、斑马鱼、果蝇、海胆、家蚕、拟南芥、烟

草、玉米、猪、牛及人类iPS 细胞中［31］

。2010年，首次报道

TALEN 蛋白在酵母中应用成功［32］；之后，在植物、人类细胞、小鼠、斑马鱼、猪、牛中得到迅速的应用

［25］

。CＲISPＲ/Cas 技

术模式动物构建的革命。Ｒudolf Jaenisch 教授采用CＲISPＲ/Cas 技术成功构建了同时携带多个基因突变的小鼠［33］。并采用CＲISPＲ/Cas 技术绕过了胚胎干细胞操作过程，快速而有效地建立了携带多个基因突变的小鼠。这是CＲISPＲ/Cas 技术首次被用于多细胞生物的基因操作。CＲISPＲ/Cas 技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，现在可以在3 4个星期内生产1只携带5个突变基因的小鼠，而传统的技术要达到这一目标需要花费3 4年。并且这一技术相当简单，甚至可能比传统方法还要简便。且可绕开胚胎干细胞操作过程。该技术将重新定义模式动物。将再一次革新基因修饰模式

动物的生产技术，甚至有可能重新定义哪些物种可以作为模式物种。同时研究者也指出，对于利用CＲISPＲ/Cas 技术构建模式动物还需要开展更进一步的研究，看是否存在预期外的效果，是否会对基因组产生设计外的改变。3．2

基因敲除技术与基因治疗

基因治疗是随着DNA 重

组技术的成熟而发展起来的，是将人的正常基因或有治疗作用的基因，

通过一定方式导入人体靶细胞，以纠正基因缺陷或发挥治疗作用，从而达到疾病治疗目的的生物医学技术。由同源互换的原理使得细胞自行修正错误的DNA 序列是基因治疗最基本的原则。对于多基因疾病，例如肿瘤等，针对单个基因的基因治疗效果一般不好。利用ＲNAi 可以构建针对信号通路的多个基因或者基因族的共同序列来同时抑制多个基因的表达，从能够更有效地抑制肿瘤生长。Zhang 等利用合成VEGF 的siＲNA 特异性地封闭了大分子量VEGF 的表达，有效抑制了肿瘤细胞的生长，达到了很好的抗肿瘤生长及抗肿瘤转移的目的

［34］

。Holt 等利用ZFN 打靶修饰获

得了具有HIV 抗性的人体干细胞［35］

。用于治疗HIV 的ZFN

（破坏人CCＲ基因表达）药物进入二期临床试验［36］。Urnov 等利用ZFN 介导的同源重组修复技术实现了人类细胞IL2Ｒγ基因的高效修复，表明将ZFN 用于疾病基因治疗是可行的

［37］

。

研究人员利用TALEN 技术对来源β-地中海贫血病人的非整合型iPSCs 进行珠蛋白基因（HBB ）修复，

证实这些修复好的iPSCs 具有多能性及正常核型并且在修复过程中没有产生TALEN 引发的脱靶突变，表明这种方法可作为一种治疗地中海贫血疾病的有效途径

［38］

。相对ZFNs 和TALENs ，

CＲISＲP /Cas9可改造成为切口酶，在DNA 的特定位置制造

单链切口，这样基本不会引起非同源末端连接（NHEJ ），但可以激活细胞的同源重组（HＲ）机制。因此，利用Cas9作为切口酶可以高效地介导基因定点敲入或是对基因组的点突变，大大降低了NHEJ 风险和脱靶事件导致的基因组其他位置产生未知的突变。研究表明，在人iPS 细胞中，利用CＲISPＲ/Cas9可获得高效的定点突变。利用iPS 细胞和CＲISPＲ/Cas9在治疗一些人类的遗传疾病方面很有前景。作为一种新的治疗手段，基因治疗目前还存在着很多问题需进一步的研究和验证，如基因效应时间，基因导入系统靶向性，效率可

7

061141卷29期陶果等基因敲除技术最新研究进展及其应用

控性以安全性问题等。

3．3基因敲除与基因功能研究多个物种的基因组序列测定工作已完成，获得了许多新基因（novel genes，与已知基因同源）和功能未知基因（unknown genes，与已知基因没有同源性）。例如拟南芥是第1个完成基因组测序的开花植物，但其中90%以上基因的功能仍未研究［39］。在基因功能研究中，对特定基因进行定点修饰或剔除是最为直观，最具说服力的方法，也是反向遗传学的主要技术，是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。早期细胞基础ＲNAi高通量研究中，进行了大量筛选用以鉴定与细胞扩增，存活相关的基因［40］。而后来的研究已筛选出多种与哺乳动物细胞生存和扩增相关的基本因子，特别是癌症细胞的基本因子［41］。Woong et al利用人工合成的sgＲNAs指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因tia1l、gsk3bj、drd3等基因进行修饰，获得了与ZFNs、TALENs相似的效率［42］。

3．4基因敲除与培育新品种基因敲除为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。高效率基因编辑工具的出现将改变品种培育策略。使用TALEN技术对水稻进行了改造，剔除了水稻基因组中对枯萎病病菌易感的基因，打造出了抗病水稻，利用TALEN技术可将高产优质但感病的水稻品种（材料）转变为高产优质兼广谱抗病的水稻品种［43］。对动物生殖细胞或早期胚胎细胞的基因修饰改造，可产生一些人类需要的动物新品种，如Myostatin基因外显子3碱基突变可造成的双肌牛，Myostatin基因敲除小鼠比野生型小鼠也具有明显多的骨骼肌，因而在绵羊或猪上敲除Myo-statin基因将可产生骨骼肌明显增大的品种，这具有很高的经济价值［44］。

4展望

尽管利用人工核酸酶ZFN、TALENs和细菌获得性免疫系统CＲISPＲ目前还处于研究的初期阶段，其在基因敲除方面已表现出巨大的潜力和广阔的应用前景，被认为是靶向基因修饰的革新技术。但这些新技术依然还有许多未知因素并没有研究透彻，如细胞毒性，免疫原性，以及是否存在预期外的效果，是否会对基因组产生设计外的改变等等。这些有待于进一步研究。

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（下转第11644页）

异。在添加动物氮源的①号培养基，菌丝生物量明显大于添加植物氮源的②号培养基和不加氮源的对照组（表2）。氮源是培养基优化中一个重要因素，由于每一种氮源成分组成不同，对冬虫夏草菌生长有不同影响，因此筛选出合适的氮源对提高菌丝生物量有很大的意义。

表2冬虫夏草菌丝体干重检测结果

氮源菌株样本数

瓶

最低得率

%

最高的率

%

平均得率

%

①号培养基HL304．304．904．62

YSH304．104．854．38

②号培养基HL301．802．602．27

YSH301．752．402．05

对照组（CK）HL300．701．060．87

YSH300．651．000．80

3结论与讨论

由于冬虫夏草的产地、种类、培养方式、提取和测定方法的不同，对于其含量报道也有差异。试验证实了HL、YSH 这2株冬虫夏草菌在不同氮源的培养基上均能生长，在动物类氮源上的长势优于植物类氮源。无论从菌丝活性成分含量或菌丝生物量来看，其成分及生物量均高于或等于天然虫草和以植物氮源为主的菌丝体。氮源是虫草菌生长所必需的营养元素，由于虫草菌在原寄主蝙蝠蛾幼虫体内长期寄生，已适应对动物类蛋白的吸收利用，而对植物类蛋白吸收较差，导致其有效成分的含量及生物量低于动物氮源，与文献报道也一致。李昊等报道冬虫夏草菌对无机氮的利用较差，对有机氮源，尤其是动物蛋白源的利用较好［21］。目前，国内对冬虫夏草菌液体发酵工艺的研究多以动物蛋白为主要氮源的培养基，以及液体深层发酵培养条件为主，来获得大量菌丝体，以植物蛋白为主要氮源培养基的研究鲜有报道。在实际生产过程中动物氮源成本较高，来源有限，而植物氮源取材方便，成本低。在菌丝发酵中，氮源起着决定性作用，因此，寻找最佳氮源也是今后仍需研究的内容。另外，冬虫夏草菌对不同氮源利用的差异也需要进一步探讨。

真正的人工发酵冬虫夏草菌丝体，主要来源于天然冬虫夏草中提取分离得到的真菌成分。其发酵产物的有效成分作为质量控制指标是很重要的。因此，要提供一个最适合冬虫夏草菌产生有效成分的发酵工艺也是今后的研究热点。实验室培养的2株冬虫夏草菌、培养基配方及发酵工艺产出的发酵菌丝体的主要有效成分、含量与野生型的大致相同，有些成分甚至大于野生虫草。

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（上接第11608页）

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基因敲除技术研究新进展2011

基因敲除技术研究新进展 黄薇,严放北京大学医学部心血管研究所 gene knockout）技术是20世纪80年代发展起来的一门新技术。应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚em cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。该细胞参与胚胎发育形成可得到纯合基因敲除小鼠。基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学进展。基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人chi）、82岁的美国人奥利弗?史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁?埃文斯（Martin Evans）分享了2 80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织于1993年。Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除oxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。 imizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统re的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制，避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。 实验室Cui[3]等又报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白质敲除技术，用这一技术构建的模式动物可在定蛋白质的功能，从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性，达到空前的时间精度，成组研究最先进的工具之一。 以来上述基因敲除技术只能在小鼠上完成，因为只有小鼠的ES细胞能在体外培养中无限增殖并同时保持多分化潜能以及猴等大动物模型在疾病研究中更接近于人类，大动物更有益于某些繁琐的手术操作，同时血浆及组织样本量较大家介绍近两年来基因敲除技术在大动物模型上的突破及进展。 一、大鼠ES细胞基因打靶技术 ，大鼠的生理和药理特性与人类更相近，是研究人类疾病的一种重要动物模型，在心血管疾病和糖尿病等领域的作S细胞在体外难以长期维持自我更新，用传统培养方法无法获得具有生殖传代能力的大鼠ES细胞[5]。因此在过去二物模型远不及小鼠发展迅速。2010年Tong等[6]于《Nature》报道了p53基因敲除大鼠，这在基因敲除技术上又是

基因敲除技术研究进展

兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述 题目：基因敲除技术研究进展 作者：王振宇 学号：201207744 指导教师：谢放 完成日期：2014-7-16

基因敲除技术研究进展 摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除 RNA i生物模型基因置换基因打靶同源重组1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、

基因敲除技术

第23卷武 夷 科 学V o.l23 2007年12月WUY I SCIENCE J OURNA L D ec.2007 文章编号:1001 4276 (2007)01 0187 04 几种常用的基因敲除技术 李今煜,陈健铭,彭振坤 (福建农林大学生命科学学院,福建福州350002) 摘要: 摘要:随着功能基因组学研究的深入发展,基因敲除技术逐渐成为基因功能研究的重要手段,本文就常用的三种基因敲除技术,即同源重组、插入突变、RNA干扰各自的原理、适用的范围和优缺点作简要介绍。关键词: 基因敲除;同源重组;插入突变;RNA干扰 中图分类号: Q343.1 文献标识码: A 随着越来越多生物的全基因组被测序,功能基因组学成为时下研究的热点。研究基因功能的方法主要有两种思路,一是通过增强其表达,取得表达产物进行研究,二是减弱或者终止其表达,观察整体功能的变化,进而推测相应的基因功能。前者因为不能反映基因产物的真实表达情况,而逐渐被抛弃。后者将基因与生物的整体功能联系起来考察,并能为基因的功能提供直接证据,因而其技术不断得到发展和完善,其中最常用的就是基因敲除(gene knockou t)技术。 基因敲除技术除最早的同源重组技术外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和RNA,i它们同样可以达到基因敲除的目的。下面就这几种基因敲除技术简要进行介绍。 1 利用同源重组进行基因敲除 基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞(e mbryon i c ste m cel,l ES细胞)技术的基础上逐步完善发展起来,主要是利用DNA转化技术,将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基因整合入内源基因组内,使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变,达到研究基因功能的目的[1]。 基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段,现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除;而条件基因敲除则是将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段,即通过位点特异的重组系统实现特定基因敲除[2],现阶段以噬菌体的C re/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统应用得最为广泛[3]。 虽然基因敲除技术的广泛使用使其成为研究基因功能重要的技术手段,但目前仍然存在 收稿日期:2007-09-26 基金项目:福建省自然科学基金计划资助项目(项目编号:2006J0052)。 作者简介:李金煜(1976-),女,硕士,研究方向:主要从事生物化学与分子生物学领域的研究。

CRISPR cas9基因敲除原理及其应用

CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用 CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。 目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。 由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。 通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。

目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：Cas9质粒构建 设计2条单链oligo序列； 退火形成双链DNA pGK1.1 将双链DNA连接到载体 中 转化G10competent cell 筛选阳性克隆；测序验证 序列；质粒大提；电转染 靶细胞 在细胞内crRNA识别靶 位点，Cas9对靶位点进行 随机剪切 Cruiser TM酶切细胞池，计 算突变率；Cruiser TM酶切 初筛阳性克隆；将阳性克 隆测序验证；做敲除序列 比对分析。

分子生物学综述论文(基因敲除技术)

现代分子生物学 课程论文 题目基因敲除技术 班别生物技术10-2学号 10114040220 姓名陈嘉杰 成绩

基因敲除技术的研究进展 要摘基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。此后经历了近20年的推广和应用，直到2007年10月8日，美国科学家马里奥?卡佩奇（Mario Capecchi）和奥利弗?史密西斯（Oliver Smithies）、英国科学家马丁?埃文斯（Martin Evans）因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。基因敲除技术从此得到关注和肯定，并对医学生物学研究做出了重大贡献。本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组 前言 基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改制，具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠，再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱导Cre的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制，避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。2004年该实验室Cui等又报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白质敲除技术，用这一技术构建的模式动物可在几分钟内反转性地激活或敲除特定蛋白质的功能，从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性，达到空前的时间精度，成为目前功能基因组和功能蛋白质组研究最先进的工具之一。 1. 基因敲除技术简介 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.1 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES 细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了

基因敲除技术的最新进展doc - 丁香园

基因敲除技术的最新进展　 yunfenglin 干细胞与组织工程讨论版　 【摘要】　自从上世纪80年代初的胚胎干细胞技术的成熟，在短短的20年里，关于基因敲除动物模型的报道呈几何数增长。现在的技术已经可以产生在时间和空间上都可以人为控制的，从点突变到染色体组大片段的删除和重排的各种基因突变小鼠，这样就可以让研究每个基因的具体功能成为可能。本文将首先简介基因敲除技术的技术背景、基本原理、基本步骤；然后将重点介绍现在基因敲除的常用策略及其利弊；接着将探讨基因打靶结果不理想的常见因素，包括基因背景、基因重复、基因补偿、和基因补充；最后介绍基因打靶技术的技术热点，包括组织特异性打靶、诱导性打靶。并探讨基因打靶技术在颌面外科的应用前景。 【关键词】基因敲除、条件性基因打靶、组织特异性基因打靶、诱导性基因打靶 技术背景 基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的[1]，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。所谓胚胎干细胞(Embryonic Stem cell，ES)是从着床前胚胎(孕3—5天)分离出的内细胞团(Inner cell mass，ICM)细胞[2]，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性。在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠胚胎，它能发育成胚胎的各种组织。而基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能，这种重组称为同源重组。[3] 基因打靶就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术[4]。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。现在基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。２０００年初的敲除了决定表面抗原的猪的模型的成功建立更是为异种器官移植排除了一道重要的障碍，展示了基因敲除技术的美好前景。 基本步骤 利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为： ａ．ES细胞的获得：现在基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最近来自于C57BL/6×CBN/JNCrj F1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。c57BL／6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学领域，并以此为背景建立了许多成功的转基因模型。[5,9,11] ｂ．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，此重组载体即为打靶载体。因基因打靶的目的不同，此载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体[6,7]。如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上，这种情况下应设计的插入型载体要包括外源

基因敲除小鼠的制作方法

.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.

基因敲除技术的原理、方法和应用

基因敲除技术的原理、方法和应用 2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验浏览次数：6302 网友评论 0 条 1．基因敲除概述 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2利用随机插入突变进行基因敲 除。 2.3.RNAi引起的基因敲除。 3．基因敲除技术的应用及前景 4．基因敲除技术的缺陷 关键词：基因敲除 1．基因敲除概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。

基因敲除技术

基因敲除技术 顾欣徐夕陈文舒贾琳莹 基因敲除技术是一种定向改变细胞或生物个体遗传信息的实验手段。通过对生物体遗传信息的定向修饰----外源基因定位引入，并使修饰后的遗传信息在生物体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗,新药筛选评价模型等。基因敲除技术的发展已使得对特定细胞，组织或动物个体的遗传物质进行修饰成为可能。它的产生和发展建立在胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES细胞）技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。 方法 走进21世纪，生命科学已经进入了后基因组时代。大规模的基因功能研究正式成为生命科学研究的热点。宏伟的人类基因组计划的顺利实施，完成了人类基因组及多种模式生物基因组的序列测定。基因敲除技术综合应用现代生物医学各个研究领域的高新技术及最新研究成果，提供一个研究系统使得研究者可以在生物整体水平，组织水平，细胞水平，分子水平各个层次上全面系统地研究基因的功能。在基因功能研究方面，它具有地方所难以比拟的直接性和有效性，是后基因组时代进行功能基因组学研究的重要平台技术。从第一例成功的基因敲除报道至今，在包括美国，日本和欧洲各国在内的发达国家中，基因敲除技术已成为常规性的重要生物医学研究手段。利用基因敲除技术得到特定靶基因功能获得或者缺失的小鼠突变体并进行相关表型的研究将最终有利于绘制人类基因在各种生理和病理过程中功能的立体图卷。对基因功能的深入研究和了解将有助于发现新的具有应用价值的基因和蛋白，因此，通过基因敲除进行的基因功能研究将成为今后医药产业的基础。 基因敲除技术的发展使得它可以满足大规模基因功能研究的需要。基因敲除研究结合随机化学物质（如ENU）诱变的研究也正在世界上多个小鼠基因组中心进行。除了基因完全失活的小鼠模型，携带基因功能获得或者部分基因功能丧失突变的小鼠模型将会有助于对基因功能更全面和更深入的了解。 由于人类作为研究对象的局限性，发展相应的人类疾病动物模型，对于研究人类疾病的分子机制以及研制相应的诊断，治疗药物均具有非常重要的意义。通过基因敲除研制的人类疾病小鼠已有数百种，这些模型的建立极大地丰富了人类对这些疾病相关基因功能的了解。

基因敲除技术样本

基因敲除技术 点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢 绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的 使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):

图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子 都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]

基因敲除小鼠技术共9页word资料

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项 高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。

二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程 图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建

基因敲除技术现状及应用

医学分子生物学杂志,2007,4(1):862 90　J Med Mol B i ol,2007,4(1):86290 通讯作者:汤华(电话:022*********,E 2mail:htang2002@yahoo 1 co m ) Corres ponding author:T ANG Hua (Tel:86222223542603, E 2mail: htang2002@yahoo 1co m ) 基因敲除技术现状及应用 万海英　综述 汤华　审阅 天津医科大学天津市生命科学中心实验室　天津市,300070 【摘要】　功能基因组学的研究进展使基因敲除技术显得尤为重要。基因敲除技术从载体构建到细胞的筛选到动物模型的建立各方面都得到了发展。其中C re 2LoxP 系统可以有效的控制打靶的发育阶段和组织类型,实现特定基因在特定时间和(或)空间的功能研究;转座子系统易于操作,所需时间短,具有高通量的特点,可以携带多种抗性标记,方便了同时进行多基因功能研究;基因捕获技术提供了获得基因敲除小鼠的高效方法,方便了进行小鼠基因组文库的研究。此外,进退策略、双置换法、标记和交换法、重组酶介导的盒子交换法也从不同方向发展了基因敲除技术。 【关键词】　基因敲除;C re 2LoxP 系统;转座子;基因捕获【中图分类号】　R34918 St a tus Quo and Appli ca ti on of Gene Knockout WAN Haiying,T ANG Hua Tianjin M edical U niversity,Tianjin L ife Science Center ,Tianjin,300070,China 【Abstract 】　Gene knockout is i m portant f or functi onal genom ics 1Great p r ogress has been made in the vect or constructi on of gene knockout,screening of ai m ed cells and ani m al models and the devel op 2ments in these fields hel p t o s olve the p r oble m s in the study of genom ic functi ons 1Cre 2LoxP syste m can effectively contr ol the devel opment stage and hist ol ogy of gene knockout,thereby making it possi 2ble t o study gene functi on in a given ti m e and /or s pace 1Trans pos on syste m is easy t o mani pulate,quick and can achieve high thr oughput,carry multi p le resistance marker gene,which makes si m ulta 2neous study of multi p le genes possible 1Gene trapp ing p r ovides a highly efficient method of obtain knockout m ice and can facilitate the research of m ice geno m ic library 1I n additi on,the techniques such as “hit and run ”,“double rep lace ment ”,“tag and exchange ”and “recombinase 2mediated cas 2sette exchange ”all contribute t o the devel opment of gene knockout technol ogy 1【Key words 】　gene knockout,Cre 2LoxP syste m,trans pos on;gene trapp ing 基因敲除又称为基因打靶,是指从分子水平上将一个基因去除或替代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法。基因敲除技术是功能基因组学研究的重要研究工具。 基因敲除技术是在20世纪80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。胚胎干细胞(e m 2bry onic ste m cell ,ES 细胞)分离和体外培养的成功及哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除 的技术基础和理论基础[1] 。基因敲除主要包括下列技术:①构建重组载体;②重组DNA 转入受体细 胞核内;③筛选目的细胞;④转基因动物。 基因敲除传统的重组载体主要有插入性载体系统和替换性载体系统。插入性载体系统构建载体时主要包括要插入的基因片段(目的基因)、同源序列片段、标志基因片段等成分,替换性载体系统主要包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因等成分。基于正负双向筛选(positive and negative selecti on,P NS )策略的传统方法的基因敲除需要满足:对基因组提取处理用于构建载体;需要位于打靶区两翼的具有特异性和足够长度的同源片段,并便于用其作为探针用Southern 印迹证实;neo 基因(新霉素磷酸转移酶基因)的整合;同源重组区域外侧tk 基因(胸苷激酶基因)在随机重组时的活性;打靶结构外特异的基因探针;合适的酶切位点,

基因敲除技术

基因敲除技术 1．概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1． 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2，3] ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重

基因敲除技术的发现及应用

个人自主学习研究报告 本次研讨方向：掌握基因概念的本质与演变过程 本人承担的具体学习研讨主题：80年代基因敲除技术的突破 基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。此技术是由马里奥·卡佩奇、马丁·埃文斯与奥利弗·史密斯所开发，最初是以基因敲除小鼠（knockout mouse，昵称：KO mouse）完成实验，三人并因此获得2007诺贝尔医学奖。 1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏，使特定基因失活，以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分，以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。 2. 80年代实现基因敲除的原理和方法： 通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，基因敲除技术有很多，如同源重组法、插入突变法、RNAI法。然而，在80年代，基因敲除是应用DNA同源重组原理发展起来的。该方法通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 3. 基因敲除技术的前景 基因敲除技术现在以广泛的应用于各个领域并取得了快速的发展，应用此技术可以建立生物模型、培育新的生物品种、还可以用于疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗等。80年代，基因工程技术是该世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则是另一重大飞跃。它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。

基因敲除技术

基因敲除技术研究进展综述 摘要：基因敲除在20世纪80年代发展起来后已经应用到许多领域, 如建立人类疾病的转基因动物模型(糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等)。这些疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究: 研究发育过程中各个基因的功能, 研究治疗人类遗传性疾病的途径。 关键字：基因敲除；Cre/LoxP系统；基因载体；生物模型 1．概述： 基因敲除又称为基因打靶, 是指从分子水平上将一个基因去除或替代, 然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法，是功能基因组学研究的重要研究工具。是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。 通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿, 并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响, 成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和实践意义。 基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人马里奥?卡佩奇（Mario Capecchi）、82岁的美国人奥利弗?史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁?埃文斯（Martin Evans）分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。 2.基因敲出技术发展历史 80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。 2000年Shimizu等[于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的

基因敲除技术及其进展

基因敲除技术研究进展及其在代谢工程 上的应用 The Current Status of Gene Knockout and its Application in Metabolic Engineering 天津大学化工学院 二零壹六年六月

摘要 基因敲除技术是20世纪80年代发展起来一项重要的分子生物学技术，在微生物代谢工程，动植物改造以及功能基因研究方面具有广泛的应用。本文介绍了基因敲除的策略和在代谢工程中的作用，着重介绍了四种新兴的基因敲除策略：RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火热的CRISPR/Cas9。并在最后展望了基因敲除技术尤其是新兴技术在相关领域的发展趋势，为基因敲除技术的进一步发展提供了参考。 关键词：基因敲除代谢工程同源重组CRISPR/Cas9

ABSTRACT Gene Knockout is an important molecular biotechnology which has developed sine 1980. It has been proved efficient in microbial metabolic engineering, transform of nimals and plants and functional genomics. In this review, we mainly introduced the strategies of gene knockout and its application in metabolic engineering.And four new strategies RNAi, ZFN, TALENs and CRISPR/Cas9 were highlighted in detail. At last, developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed. KEY WORDS：gene knockout,metabolic engineering,homologous recombination,CRISPR/Cas9

基因敲除三大技术对比

基因敲除三大技术对比 技术名称优势局限性可提供服务类型 基于胚胎干细胞的同源重组技术成熟、可靠、精细是目前 为止唯一一个可以满足所 有要求的打靶技术 1）需要ES细胞，目前只有 小鼠有高效的ES细胞，其它 模式动物的ESC还不能实现 大规模应用。 2）周期长、工作量大、费用 相对比较高 1）全基因敲除模式小鼠 2）条件性基因敲除模式小鼠 3）先全敲除再条件性敲除模 式小鼠 4）基因敲入模式小鼠 5）ROSA位点定点转基因 TALEN技术基因敲除效率高，速度快， 可实现多物种基因敲除基因敲入效率较低，多基因敲 除困难，系统构建相对复杂， 存在脱靶风险 1）全基因敲除大/小鼠 2）全基因敲除细胞系 EGE系统基因敲除/敲入效率高，速 度快，可实现多基因、多 物种基因敲除/敲入，系统 构建简单存在脱靶风险，但通过选择合 适的sgRNA可以有效降低脱 靶率，In vivo脱靶可通过传 代去除 1）全基因/条件性基因敲除大 /小鼠 2）全基因/条件性报告基因敲 除/敲入大/小鼠 3）CRISPR/Cas9粒构建 4）细胞系敲除/敲入

免疫类 B-NSG小鼠：Biocytogen-NOD-SCID-IL2rg B-NSG小鼠是NOD遗传背景，Prkdc和IL2rg双基因敲除的小鼠，是目前国际公认的免疫缺陷程度最高、最适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。 基本特征 ?NOD（non-obese diabetes）遗传背景：自发I型糖尿病；其巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱；先天免疫系统，如补体系统和树突状细胞功能降低。 ?Prkdcscid ：Prkdc（protein kinase DNA-activated catalytic）基因突变，小鼠的功能性T 和B细胞缺失，淋巴细胞减少，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷（severe combined immune deficiency, scid）。 ?Il2rgnull：Interleukin-2受体的gamma链（IL-2R γc，又称CD132）位于小鼠X染色体上，是具有重要免疫功能的细胞因子Il2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21的共同受体亚基，该基因敲除后的小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧失。 B-NSG小鼠：综合了NOD-SCID-IL2rg背景特征，具有重度免疫缺陷表型，无成熟T细胞、B 细胞和功能性NK细胞，细胞因子信号传递能力缺失等。非常适合人造血干细胞及外周血单核细胞的移植和生长。 优点 ?迄今世界上免疫缺陷程度最高的工具小鼠； ?与NOD-scid小鼠相比寿命更长，平均长达1.5年； ?对人源细胞和组织几乎没有排斥反应； ?少量细胞即可成瘤，依赖于细胞系或细胞类型； ?无B淋巴细胞泄漏。