细菌活性检测方法CCK-8

CCK-8细菌活性检测试剂盒

产品组成：

产品编号BB-4221-1 BB-4221-2 BB-4221-3

规格250T 500T 1000T

CCK-8细菌检测试剂 2.5ml 5ml 10ml

产品简介：

贝博细菌活性检测试剂盒(CCK-8法) 是应用新型的水溶性四唑盐2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐快速高灵敏度检测细菌活性的比色检测产品。

本四唑盐在电子载体存在的情况下能够被细菌的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的Formazan，生成的Formazan量与细菌的活性成正比。细菌活性越强，则颜色越深；细菌活性越弱，则颜色越浅。对于同样的细菌，颜色的深浅和细菌活性呈线性关系。

CCK-8溶液可以直接加入到细菌样品中，不需要预配各种成分，CCK-8溶液很稳定，对细菌没有毒性，可以长时间培养细菌。

图一：CCK-8细菌活性检测原理

使用方法：

1. 制备适当浓度微生物细胞的悬液，在96孔板内每孔接种190μl悬液。

2. 每孔加入10μl的染色溶液。

3. 将培养板在培养箱中培养（37℃或合适的温度）。

4. 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

细胞活力计算：

各重复孔的OD值取平均数。

细胞活力% =（测试孔OD-空白OD/对照孔OD-空白OD）×100

相关产品：

产品 产品号 产品 产品号 Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒 BB-4101 细胞周期检测试剂盒 BB-4104 Annexin V-EGFP/PI凋亡试剂盒 BB-4102 JC-1线粒体膜电位试剂盒 BB-4105 MTT细胞增殖及毒性检测试剂盒 BB-4201 Caspase 3 活性检测试剂盒 BB-4106 CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒 BB-4202 Caspase 8 活性检测试剂盒 BB-4107 WST-1细胞增殖毒性检测试剂盒 BB-4203 Caspase 9 活性检测试剂盒 BB-4108 MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒 BB-4204 Caspase 10 活性检测试剂盒 BB-4112 Hoechst33342/PI双染试剂盒 BB-4131 细胞凋亡形态学检测试剂盒 BB-4123 DAPI染色试剂盒 BB-4133 Rhodamine 123染色试剂盒 BB-4137 细胞存活率检测试剂盒 BB-4122 AO/EB双染试剂盒 BB-4132

细菌总数测定操作规程

细菌总数检测操作规程 1 原理 试样经过处理，稀释至适当浓度，在一定条件（如使用特定的培养基，在温度30℃±1℃培养72h±3h等）下培养后，所得1g（mL）试样中所含细菌总数。 2 试剂与仪器 2.1 所用器具 三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针、移液器 2.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅 2.3 所用试剂和培养基 营养琼脂 取营养琼脂32.0g，加入蒸馏水1L，搅拌加热至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，备用。 3、操作步骤 3.1配制0.85%生理盐水。 称取氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中。 3.2三角烧瓶加入生理盐水90mL和玻璃珠，试管中加入生理盐水9mL，121℃灭菌30min。（三角烧瓶个数与样品数量一致，试管数量与稀释次数相关） 3.3将1000μL枪头、培养皿、5mL枪头、称量勺，121℃灭菌30min。（注意计算数量）3.4将枪头、培养皿置于烘箱103℃烘干。（1-3步需提前一天完成） 3.5对称量房间进行紫外灭菌30分钟，关灯静置60 min。以无菌操作取样品10g于含90mL 生理盐水三角烧瓶中，于振荡器上振荡30min，制成1:10的均匀稀释液。 3.6用1000μL枪头吸取1:10稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有灭菌生理盐水9mL的试管中，于振荡器上混合均匀，制成1:100的均匀稀释液。 3.7另去一只1mL灭菌吸管，按照上述操作方法，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即更换一支灭菌吸头。 3.8选择2个~3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个培养皿。 3.9稀释液移入培养皿后，及时将凉至46℃±1℃的培养基（可放置46℃±1℃水浴锅内保温）注入培养皿约15mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混匀（从稀释试样到倾注培.

细菌鉴定及检测方法

细菌鉴定及检测方法 一、启动条件 1、目的样出现坏包，若批次相同，取表现性状相同的任意一包进行细菌初步鉴 定。若批次不同则分别进行细菌初步鉴定。 2、随机样出现坏包，必须进行细菌初步鉴定。 二、胀包 1、记录批次。 2、及时用72%的酒精对样品的外表进行消毒，尽量不损坏封合待以后检查。在 超净台内以无菌操作剪开包装，再避开横竖封处剪开一个圆形或三角形。3、对样品进行微生物划线培养。 3.1采用普通营养琼脂培养基做细菌的划线培养36±1℃、48小时。 3.2分别吸取10毫升样品到两个无菌的小试管中，，分别在80和100℃的水 浴中加热10分钟，冷却用营养琼脂分别做芽孢（36±1℃、72小时） 和耐热芽孢（55±1℃、72小时）的划线培养。 3.3采用普通营养琼脂培养基或快速检测培养基做嗜冷菌/低温菌的划线培 养（4—6℃ 10天或21±0.5℃ 25小时）。 3.4 必须用高盐察氏或虎红琼脂培养基做霉菌和酵母菌的划线培养 （25—28℃ 5--7天） 4、对样品做感官检测。 5、用PH计检测样品的PH值。 6、将样品倒掉，进行包装密封性检查，并进行记录。 7、记录菌落特征。 8、选区不同形态的单一菌落进行坚定。 8.1 革兰氏阴性菌和阳性菌的鉴定： 8.1.1涂片、革兰氏染色、镜检。或结晶紫染色、镜检、氢氧化钾拉 丝试验。 8.1.2革兰氏染色、结晶紫染色方法见《微生物检测》 8.1.3氢氧化钾拉丝试验 在微生物载物片上滴一滴3%氢氧化钾，用接种针从培养皿上的

菌落中挑取微生物，放在氢氧化钾溶液中用力搅拌。7—10秒后，抬 起针头，观察针头和玻片之间是否有丝状物，如果15—20 秒后二者 之间无丝状物，停止搅拌。 判定：无丝状物阳性；有丝状物阴性。 8.2 过氧化氢酶试验（或过氧化氢酶试纸）（产气试验）： 试剂：10%过氧化氢溶液 步骤：在微生物载物片上滴一滴10%过氧化氢，用接种针从培养皿上的菌落中挑取微生物，放在过氧化氢溶液中看是否有气体产生。 判定：产气阳性；不产气阴性。 8.3氧化酶试验 试剂：含1%四甲基双噻二胺和99%的乙醇溶液。 步骤：用上述试剂将一张滤纸浸透（或直接采用氧化酶试纸条），然后进行细菌培养物的涂片试验。 判定：30秒内使显色物质变为深蓝色阳性，不变色阴性。 三、酸包 1、发现酸包后，及时将料液快速转入无菌瓶中。 2、记录批次 3、其它项目检测同胀包。

16S_rDNA鉴定细菌的方法

16S rDNA鉴定细菌的方法 细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分： 1.提取细菌基因组DNA, 2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5.目的片段测序。 6.BLAST比对获取相似片段。 7.构建系统进化树 试剂： 1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。 1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高压灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。 1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。 1.410×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。 1.5 10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。 6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。 8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。 10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。 12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。 13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等） 14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。 15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避

细菌总数的测定

细菌总数的测定 水与人类的生产活动和日常生活息息相关。经济建设的高速发展，往往会使生活用水的水源水受到水中有害有毒物质的污染；而生活污水、人、畜粪便会使甚或用水的水源水受到腐生性微生物的污染。被污染的水都不宜饮用。当水体中含大量的病原问生物是往往会引起传染病的发生，人体和动物体的肠道中大约有400多种细菌，虽然，其中的腐生菌进入水体不会引发人类的疾病，但随着粪便一起排除的致病菌，如霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、阿米巴虫、脊髓灰质炎病毒和传染性感染病毒等致病性微生物，则会引发人体的肠道传染病。为保护人体健康，防止因水源水污染而造成的疾病发生和流行，必须对生活用水及其水源水进行严格的水中细菌学检查。 测定水样是否合乎引用标准，一般包括：水中细菌总数测定和大肠菌群测定。本实验以自来水和天然水为水样进行细菌总数的测定 一、实验目的 （1）学习水样的采取和水样中细菌总数测定的方法 （2）了解和掌握平板菌落计数的原则 二、试验原理 水中的细菌数可反映出水体被有机物污染的程度。细菌总数越多，说明水中有机物的含量就越高，本试验应用平板菌落计数来测定水样中的细菌总数。由于水中细菌的种属不一，它们对营养成分和生长条件的要求差别很大，不可能设计出一种培养基在同一固定的条件下，能满足水中所有细菌的营养要求使其都能生长繁殖，形成菌落。然而，肠道中的绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养基上进行生长，出现肉眼可见的菌落，虽然这样设计出来的水中细菌的总数实际上是一种近似值，但它基本上能代表水样中细菌的数量。故而水中的细菌总数的测定和计算是指：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，1ml水样，经37℃，24h培养后所生出来的总菌数（包括腐生和致病细菌），我国饮用水的 卫生学指标规定：在1ml自来水中细菌总数不得超过100个（1×102）。 三、试验材料和用具 （1）培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 （2）用具灭菌三角烧杯（体积为50ml或100ml），具玻塞的试剂瓶（体 积为250ml，需灭菌），灭菌培养基（Ф=9cm ），灭菌吸管或灭菌的 塑料吸嘴，稀释水样用无菌水（在Ф16mm×160mm试管中加9ml 蒸馏水，灭菌），酒精 四、试验方法 （1）以无菌操作、用10倍稀释法稀释水样。 （2）用平皿倾注制备待测水样平皿。 五、实验内容 1、水样的采取 （1）自来水先将自来水龙头用火焰（酒精灯火用长柄镊子夹酒精棉球）灼烧2-3min灭菌，再开启水龙头水水流出5min。以灭菌三角烧杯接取水样，待测（为节约用水，自来水龙头一次灭菌后，试验者依次采取水样）。 （2）池塘水、河水或湖水应取距水面10-15cm的深层水样。先将已灭菌具玻

医院感染监控中常用的检测方法

医院感染监控中常用的检测方法 采样及检查原则：采样后必须尽快对标本进行相应指标的检测，送检时间不得超过6 h；若标本4 ℃保存时，送检时间可延长，但不得超过24 h。 1．医务人员手的微生物学监测 （1）采样时间：在接触患者或从事医疗活动前进行采样。 （2）采样面积及方法：被检人五指并拢，将浸有无菌9g/L氯化钠溶液的棉拭子一支在双手曲面从指根到指端来回涂擦各两次（一只手涂擦面积约30cm2），并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子放入装有10ml采样液的试管内送检。采样面积按平方厘米cm2) 计算。 （3）细菌菌落总数检查：1ml采样液放入灭菌平皿内，用普通营养琼脂作倾注培养，放35℃温箱内培养24~48 h计数菌落。 手细菌菌落总数（cfu/ cm2）= 平板上菌落数×采样液稀释倍数30×2 （4）判断标准：见表6-3-1。 2．物体表面的微生物学监测 （1）采样时间：消毒处理后4 h内采样。 （2）采样面积：被采表面<100 cm2，取全部表面；被采表面≥100 cm2，取100 cm2。 （3）采样方法：用5cm×5 cm的标准灭菌规格板，放在被检物体表面，用浸有灭菌9g/L氯化钠溶液的棉拭子1支，在规格板内横竖

往返各涂抹5次，并随之转动棉拭子，连续采样式1～4个规格板面积，剪去手接触部分，将棉拭子入装10ml采样液的试管内送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体的方法采样。 （4）细菌菌落总数检查：1ml采样液放入灭菌平皿内，用普通营养琼脂作倾注培养，放35℃温箱内培养24~48 h计数菌落。 物体表面细菌菌落总数（cfu/ cm2）= 平板上菌落数×采样液稀释倍数 采样面积（cm2） （5）判断标准：见表6-3-1。 3．空气的微生物学监测 （1）采样时间：选择消毒处理后与进行医疗活动之前期间采样。（2）采样高度：与地面垂直高度80～150 cm。 （3）布点方法：室内面积≤30 m2，设一条对角线上取3点，即中心一点、两端各距墙1m处取一点；室内面积>30 m2，设东、西、南、北、中5点，其中东、西、南、北点均距墙1m。 （4）采样方法：用90mm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露5~30 min后送检培养。 （5）细菌菌落总数检查：将平板置37℃温箱内培养24 h计数菌落。空气细菌菌落总数（cfu/ m3）= 50000NAT 式中：A—平板面积（cm2） T—平板暴露时间（min） N—平均菌落数（cfu/平板）

菌落总数、大肠菌群测定方法

菌落总数和大肠菌群测定（固体样品） 药品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃 棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定 将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加 200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。

3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸 或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌 1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。 2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。 4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作 进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等

细菌数量的测定方法

细菌数量的测定方法 1、计数器测定法： 即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。 本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。 2、电子计数器计数法: 电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。 3、活细胞计数法 常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。 广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。 4、比浊法 比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。 此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。 5、测定细胞重量法 此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重

细菌的各种计数法

1、计数器测定法： 即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。 本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。 2、电子计数器计数法: 电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。 3、活细胞计数法 常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。 广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。 4、比浊法 比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。 此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。 5、测定细胞重量法 此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。 此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。 6、测定细胞总氮量或总碳量 氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。 7、颜色改变单位法（colour change unit,简称CCU） 这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例，简单介绍其操作： （1）.取12只无菌试管，每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。 （2）.在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2ml加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管 （3）.于37度培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml. 一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特殊的微生物，用CCU法比较合适。

纯化水中需氧菌总数检测方法

纯化水微生物限度检测 计数方法适用性试验 1.供试液制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均勻加热，且温度不应超过45#C。供试液从制备至加人检验用培养基，不得超过1小时。 常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。 (1)水溶性供试品取供试品，用PH7.0无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液，或PH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。若需要，调节供试液pH值至6?8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步1 0倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.接种和稀释 按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。 (1)试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混勻，使每lm l供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。 (2 )供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。 (3)菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加人试验菌液并进行微生物回收试验。若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试%液进行进一步的处理。如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加人试验菌悬液进行方法适用性试验。 供试品检查

检验量即一次试验所用的供试品量(g、m l或cm2)。 一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。 供试品的检査 按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。 阴性对照试验以稀释液代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长，如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调査。 1.平皿法 平皿法包括倾注法和涂布法。除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2个平板。 培养和计数除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30?35°C培养3?5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20?25°C培养5?7天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。 菌数报告规则需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于lOOcfu的稀释级，作为菌数报告的依据。取最髙的平均菌落数，ij*算lg 、lm l或10cm2供试品中所含的微生物数，取两位4效数字报告。

普通手术室常用细菌学监测方法

空气培养是通过空气菌落测定实现的，空气菌落测定可作为一种环境清洁的指标。 1人员着装要求： 检测者需要洗手戴口罩和帽子 2空气培养目的 检测手术部空气在静态下是否达到空气卫生学标准。 3采样时间 每月监测一次，在消毒处理后关好门窗，在无人走动的情况下，静止10min 进行采样。 4采样方法 检测者需要洗手带口罩和帽子，根据采样原理采用平板暴露法：在消毒处理后，操作前进行，室内面积≤30m2对角线内、中、外处设3点，内外点布位距墙壁1m处，室内面积＞30m2设4角及中央5点，4角的布点部位距墙壁1m处。空气中细菌等微生物可随尘粒一起下降，在室内各采样点处放好营养琼脂平板，采样高度距地面0.8～1.5m，采样时，将平板盖打开搭在平皿边缘上，暴露5min，盖好平皿盖。 5注意事项 （1）布点位置要正确，严格按照房间面积、布点要求及采样方法进行操作。（2）采样后及时送检，48小时出结果。（可请护理服务中心送检，内线电话：542） （3）培养采样者应及时将结果取回，结果取回后如无异常应将检验报告单依次粘贴在A4纸上，并注明培养房间和培养日期做好完整记录，如有超标应及时通知护士长，并查找原因，复检。 6检测结果判断 空气培养标准值小于或等于200cfu/m3

1人员着装要求：检测者需要洗手戴口罩和帽子 2检测内容 （1）手术间的物体表面及可能有可能与患者接触的物体表面： 每月培养一次。包括治疗车、治疗台、无菌灯、输液架、手术间门把手、无菌器械台、麻醉机、吸引器瓶、麻醉床、手术间墙壁等。 （2）手卫生培养： 每月培养检测一次以同一台手术至少五人为一组，包括器械护士、手术医师，若一台手术人员不足五人，可两台手术合并5-6人做手培养。 （3）腔镜器械： 每月培养检测一次，培养项目3-5个，镜头、腔镜管道为每月必做项目，其余手术器械随机抽查 （4）无菌物品： 每月培养检测一次。包括一次性无菌物品及高压灭菌后的无菌物品。一次性无菌物品及高压灭菌后的无菌物品每月随机抽取至少3例，不得检出任何微生物。（5）植入性器械： 每月抽查一次骨科外来植入性器械包括钉子和钢板及专用器械。 2采样方法： （1）物体表面主要采用棉式子涂抹法。采用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液的棉拭子，取出棉拭子，先在酒精灯外焰进行烧灼后，直接在物体表面按一定顺序滚动式涂抹，后将棉拭子入装有含相应中和剂的无菌洗脱液试管内，立即送检。（2）手部培养方法，被检测者须五指并拢，取出棉拭纸先在酒精灯外焰进行烧灼后以手掌到手指尖为平面S型滚动式涂抹，涂抹后将棉拭子入装有含相应中和剂的无菌洗脱液试管内，立即送检。 3注意事项： （1）培养不得检测出任何微生物。 （2）采样后及时送检，48小时出结果。 （3）结果出来后将检验报告单依次粘贴在A4纸上，并注明培养房间和培养日期做好完整记录。

细菌总数的测定法

细菌总数的测定法 一、细菌数测定的基本概念 药品细菌数测定是微生物的定量检查，是用来判断药品被细菌污染程度和卫生质量评价的重要指标，也是检测药品质量的重要指标之一。细菌计数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH 位、培养温度和时间等）每1g、lml、l0cm2供试品液经培养后所生长的菌落数。所谓一定条件是按我国药典规定，在需氧条件下，30～35℃，一般培养48h,在营养琼脂培养基平板上生长的细菌菌落数。细菌数的测定方法有多种：平板法、薄膜过滤法、涂抹法。 药品细菌数测定是活菌计数，最常用的平板法是以平板菌落计数为依据，即每个菌落代表个菌细胞，但有的菌落也可能是多个菌细胞形成，如双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等，很可能是多个菌细胞在一起。故准确地说，细菌数测定值实际上是菌落形成单位数( CFU)。 平板法菌落计数法，是受一定条件的限制：如供试液是否均质，供试液中的细菌是否充分分散；培养基的质量、培养温度及培养时间的影响；有繁殖能力的菌细胞才能形成菌落，死菌及某此受损伤的细菌或营养要求苛刻的细菌在规定的培养基上不能生长，因而不被计数。在试验操作中应考虑到这此问题。 二、设施、设备、仪器及器皿 1、设施 细菌数测定全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁净净度l0000级和局部洁净度100 级单向流空气区域内进行，以防止再污染。 2、设备、仪器 恒温培养箱（30～35℃）、微波炉、匀浆仪（4000～10000r / min ）、康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（250～300℃）、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果验证并应定期请有关部门检定） 菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平（感量0.1g）、pH 值系列比色计、全封闭可拆卸或开放式的薄膜过滤器。 3、器皿 锥形瓶（250～300ml ）、培养皿（∮9cm）、量筒（100ml）、试管（18×18mm）、刻度吸管（l ml , 10ml）、载玻片、玻璃或搪瓷、不锈钢消毒缸（带盖）。 玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管上端距0 .5 cm 处塞入约2 cm 左右的适当疏松棉花，装入吸管筒内或牛皮纸口袋中。锥形瓶、量筒、试管塞（硅氟塑料塞），再用牛皮纸包扎。使用的器皿应采用经验证合格的方法进行灭菌。 4、用具 大、小橡皮乳头（置干净带盖的容器中并应定期用5%来苏尔溶液浸泡），无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后用布袋或牛皮纸包严）灭菌，备用。也可使用一次性无菌衣、帽、口罩。接种环(白依金或镍铬合金）、乙醇（酒精）灯、乙醇棉球或碘伏锦球、灭菌剪刀、镊子或灭菌的手术刀、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔等。 二、培养基、稀释剂 除另有规定外一般使用营养肉汤琼脂培养基, 可按处方配制亦可采用干燥脱水培养基。 主要稀释剂有0. 9％无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液（供试品稀释用），0.9%无菌氯化钠溶液（对照菌稀释用）。 三、检验方法 1、试验前的准备 1）、将试验用灭菌的器皿、稀释剂及供试品外包装去掉，内包装消毒后移至无菌室内。每

水 中 细 菌 总 数 的 检 测

水中细菌总数的检测 一、实验的目的要求 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 二、实验原理 细菌总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标。我国现行的生活饮用水标准检验方法GB5750—85规定水样中细菌总数测定是1ml水样在普通营养琼脂培养基中37℃经24小时培养所生长的细菌菌落的总数。所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染，但不能说明污染的来源。因此必须结合总大肠菌群数来判断水污染的来源和安全程度。 本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。 平板菌落计数法的优点： 能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品和生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。 缺点：手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。 生活饮用水细菌卫生标准 我国饮用水卫生标准： ≤3个大肠菌群/1L饮水，≤100个细菌总数/1ml饮水

三、实验仪器和材料 1、高压蒸汽灭菌锅、恒温箱、冰箱、无菌接种间。 2、消毒酒精、消毒水。 3、试管、三角瓶、平皿、刻度吸管、涂布器等（实验前包扎灭菌处理好备用） 4、培养基 蛋白胨10g 牛肉膏3g 氯化钠5g 琼脂10~20g 蒸馏水1000ml 制备方法： 按照实际的需要量，按上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH 为7.4~7.6，，分装于玻璃容器中，用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min，倒制成平板后储存于冷处备用。 5、水样：自来水、中水。 四、实验内容： （一）、培养基的制备： 实验前事先准备好培养基平板（方法见上），每小组2-4个平板。（二）、取水样： 1、自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌， 打开龙头放水1-2分钟，用无菌空三角瓶接取水样200毫升。 2、纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用

细菌耐药性检测方法

细菌耐药性检测方法 1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。也可通过以下方法进行检测： （1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。 （2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。 （3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶 （4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。 2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。 3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA 基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA 测序 4．特殊耐药菌检测 （1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml 的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。对MRS不论其体外药敏试验结果，所有的β-内酰胺类药物和β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂均显示临床无效；绝大多数的MRS 常为多重耐药，耐药范围包括氨基糖甙类、大环内酯类、四环素类等。 （2）耐青霉素肺炎链球菌检测：当对1цg苯唑西林纸片抑菌圈直径〈20㎜或MIC〉0.06цg/ml均应视为耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）。临床治疗显示 PRSP对氨卞西林、氨卞西林/舒巴坦、头胞克肟、头胞唑肟，临床治疗疗效很差，但应检测对头胞曲松、头胞噻肟和美洛培南等的MIC以判断是否对这些抗生素敏感。 （3）耐万古霉素肠球菌检测：肠球菌对30цg万古霉素纸片抑菌圈直径≤14㎜或MIC≥32цg/ml被称为耐万古霉素肠球菌（VRE）。针对多重万古霉素药物目前尚无有效治疗方法，但对青霉素敏感的VRE可用青霉素和庆大霉素联合治疗，若对青霉素耐药而不是高水平耐氨基糖甙类可用壁霉素+庆大霉素。 （4）产超广谱β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌检测：超广谱β-内酰胺酶是一种能水解青霉素、

细菌鉴定和耐药性检测方法的发展

细菌鉴定和耐药性检测对于指导临床精确用药和及时治疗患者具有重要意义。目前临床上进行细菌鉴定和耐药检测仍以表型检测方法为主，主要包括：传统手工鉴定与药敏实验方法、自动化药敏鉴定系统。传统方法虽然能够满足临床的部分需要，但这些方法仍然存在一些缺点，例如检测时间较长和检测结果不够准确等。因此，随着分子生物学技术在临床检验领域的应用，近年来发展了一系列快速细菌鉴定和（或）耐药检测技术，例如基于ＰＣＲ技术和ＤＮＡ探针杂交以及生物芯片技术等，这类方法的特点是快速而准确，一般在几个小时之内就可以得到检测结果。 １传统方法在细菌鉴定和耐药性检测中的应用临床手工细菌鉴定和细菌药敏实验，是临床上尤其在中小医院应用最广泛的方法。细菌鉴定主要是根据细菌对生化物质的代谢特点进行，药敏方法包括纸片扩散法（常规实验室使用较普遍）和抗生素稀释法（ＭＩＣ法）等。这些方法的特点是方便、易操作，成本低，而且灵活性强，测定的细菌和药物可灵活选择。其缺点是操作烦琐、经验依赖性强、报告结果慢，不能完全适应临床治疗的需要。 使用自动化药敏和鉴定系统，是临床微生物学实验包括体外药物敏感实验的发展方向。最有代表性的是ＶＩＴＥＫ－ＡＭＳ微生物自动分析系统，可同时完成细菌鉴定和药敏实验。该套系统的检测卡片分为１４种，每一种鉴定卡片含有２５种以上的生化反应指标，基本与常规检测鉴定相同。此方法的优点是简便、快速、鉴定范围广，受人为的影响小，可靠性高。但它仍需要细菌培养的步骤，准确性也受到一定限制，同时其耗材价格较为昂贵。使用这类仪器的主要是三级甲等以上的大型医院。在细菌快速鉴定方面最有代表性的是ｍｉｎｉ－Ｖｉｄａｓ全自动免疫分析仪，其原理是应用细菌的特异性抗体对细菌进行鉴定，以荧光为标记，进行自动化检测。其最大优点是速度快，可以在４０ｍｉｎ内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。但检测指标过少，主要限于这几种菌，而且也不能进行药敏实验。 目前，微生物鉴定技术中除了少数医院使用半自动、全自动的细菌鉴定仪外，大多数医院主要还是使用常规鉴定技术进行细菌菌种的鉴定。 ２分子生物学技术在细菌种属鉴定中的应用采用与系统发育学相关的基因实现对细菌血清型的分型，越来越成为一种趋势。目前，利用基因检测方法对细菌进行种属鉴定所涉及的基因包括细菌１６ｓｒＲＮＡ基因或５ＳｒＲＮＡ序列、ＨＳＰ基因家族、ｇｙｒＢ基因以及细菌特异基因等。 ２．１利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类依据的原因利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列对细菌进行菌种鉴定在目前应用较多，也越来越被临床所接受。在细菌分类学著作中，如《伯杰氏系统细菌学手册》，越来越倾向于选择１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类的依据。主要原因有下面几点： ２．１．１ｒＲＮＡ存在于所有生物中，在生物进化过程中其功能保持不变。１６ＳｒＲＮＡ基因普遍存在于原核生物中，在真核生物中其同源分子是１８ＳｒＲＮＡ。２．１．２１６ＳｒＲＮＡ最能反映细菌间的亲缘关系。在１６ＳｒＲＮＡ分子中，既含有高度保守的序列，又含 细菌鉴定和耐药性检测方法的发展文章编号：１６７２－３３８４（２００６）－０４－００３９－０６ 【作者】杨华为蒋迪王璨赵传赞高华方 生物芯片北京国家工程研究中心（北京１０２２０６） 【中图分类号】Ｒ９１５【文献标识码】Ｂ

水中细菌总数的检测

水中细菌总数的检测 1. 实验目的 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 2. 菌落总数standard plate-count bacteria 水样在营养琼脂上、有氧条件下37°C培养48 h后，所得1 mL水样所含菌落的总数。细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标，所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染。由于结果不能说明污染的来源，因此必须结合总大肠菌群数来判断污染源和安全程度。 3. 培养基与试剂 2.1 营养琼脂成分 2.2 制法：根据实际需要量，按照上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4~7.6，分装于玻璃容器中（如用含有较多杂质的琼脂，应先过滤。），经10 3.43 kPa（121°C,15 lb）湿热灭菌20 min，储存于冷暗处备用。 4. 仪器和材料 仪器：高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、水热恒温培养箱、电炉、天平、冰箱。材料：灭菌平皿（直径9 cm）、灭菌试管、刻度吸管、三角烧瓶、采样瓶、酒精灯、消毒水、镊子、试管架等。放大镜或菌落计数器、pH计或精密pH试纸、火柴或打火机。 5. 样品采集 自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌，打开龙头放水3-5 min，用无菌空三角瓶接取水样200 ml。 纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用无菌空三角瓶接取水样200毫升。 地表水的取样：应取距水面10—15 cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。 6. 检验步骤 生活饮用水（自来水、纯净水）：以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1 mL充分混匀的水样，注入灭菌培养皿中，倾注约15 ml已融化并冷却到45°C左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注培养基作为空白对照。 待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36°C±1°C条件下连续培养48 h，进行菌落计数，即为1 ml水样中的菌落总数。 水源水：以无菌操作方法吸取1 ml充分混匀的水样，注入盛有9 ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈1:10稀释液。 吸取1:10稀释液1 ml，注入盛有9 ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈1:100稀释液。按同法依次稀释成1:1000、1:10000稀释液备用。如此递增稀释一次，必须更换一支刻度吸管。用灭菌吸管吸取1 ml未稀释的水样和2~3个适宜稀释度的水样，分别注入灭菌培养皿内，

细菌感染的诊断

细菌感染的诊断——2012年中西医执业医师考试 细菌感染的诊断是2012年临床执业医师考试解剖学中涉及重要内容，新阳光教育整理相关内容如下： 一、检测细菌或其抗原 （一）直接涂片显微镜检查 自病人标本直接涂片作染色镜检是简便而快速的方法之一。自一定部位采集标本作直接检查需考虑细菌的形态特征与可能存在的细菌数量。脑膜炎患者的脑脊液和瘀斑刺破涂片，常可显示在细胞内的革兰氏阴性肾形双球菌，有诊断价值。白喉患者咽部假膜涂片中可见典型的杆菌有时可有异染颗粒，也有参考诊断价值。结核患者痰直接或浓集后，涂片抗酸染色检出结核杆菌有诊断价值。在少数情况下，也有利用免疫荧光或酶标记抗体染色镜检方法进行快速诊断，如粪例中的霍乱弧菌、痢疾杆菌等，可用这种技术检出。 （二）培养 大多数病菌的形态与染色并无特征，因此需用培养方法来分离与鉴定细菌。虽然这一方法需要的时间较长，但比较可靠。此外，只有通过这一方法才能获得细菌的纯培养，可用于做药敏试验或毒力试验。应根据不同细菌需要的营养、生长条件（如厌氧或CO2）、菌落生长特征来初步识别细菌。如溶血性链球菌需在血琼脂平板上生长，菌落小而透明，菌落周围有完全溶血圈，可资鉴别。多数细菌欲确定为何种病原菌尚需进一步获得纯培养及接种各种特殊培养基进行生化反应试验或确定其抗原性与致病力等。 （三）生化反应 细菌的合成与分解代谢过程中，能通过酶利用一些物质或分解一些物质。不同的细菌具有不同的酶，因此各种细菌能够利用与分解的物质也各不相同。利用各种细菌的不同生化反应帮助鉴别细菌在某些细菌如肠道杆菌中是很重要的步骤。例如肠道杆菌均为革兰氏阴性杆菌。菌落形态亦相似，但对于糖的发酵结果不同，因此可利用不同种糖作为培养基质进行生化反应予以区别。