不同蛋白酶酶解产物活性大豆肽分子量分布状态的研究

第32卷第7期 西南大学学报(自然科学版) 2010年7月Vol 32 No 7Journal of Southw est U niv ersity(N atural Science Edition)Jul 2010

文章编号:1673 9868(2010)07 0001 07

不同蛋白酶酶解产物活性大豆肽

分子量分布状态的研究

陈 星, 李晓磊, 吴 琼

长春大学农产品深加工吉林省重点实验室,长春130022

摘要:研究不同蛋白酶的酶解产物活性大豆肽的分子量分布状态.用6种单一酶和6种复合酶对大豆分离蛋白进行酶解,采用高效液相色谱分析,计算分子量,界定出分子量分布范围.据此考核大豆肽含量及分子量分布状态,判定不同蛋白酶的水解效果.结果表明,6种单一蛋白酶水解生成的蛋白和肽分子量范围差异很大,大豆蛋白改性酶水解效果最好,酶解后分子量分布范围在6441~144Dalton之间,M W 1000Dalt on的组分占97 42%,符合肽的标准.6种复合蛋白酶水解生成的蛋白和肽分子量范围差异也很大,以大豆蛋白改性酶与蛋白液化剂组合最好,其分子量范围在4560~141Dalt on之间,M W 1000Dalt on的组分占99 52%.

关 键 词:蛋白酶;活性大豆肽;分子量分布状态

中图分类号:TS201 2文献标识码:A

生物活性肽指的是一类分子量小于6000Dalton,具有多种生物学功能的多肽[1].这些活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能,易消化吸收,有促进免疫抗疲劳、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用,食用安全性极高,是当前国际食品界极具发展前景的功能因子[2].当前对肽的吸收与生理作用已有较深入的研究.目前的研究认为,二、三肽能被完整吸收,大于三肽的寡肽能否被完整吸收还不确定,但也有研究发现四肽、五肽甚至六肽都能被动物直接吸收.具有活性的大豆肽以3~6个氨基酸组成的小分子肽为主,分子质量在1000Dalton以下.补充活性肽可增加大鼠小肠粘膜蛋白质含量、氨基肽酶的活性,同时显著提高机体对氮的表观消化率和氮储存率[3].大豆多肽的这些生理活性取决于多肽的相对分子质量大小和氨基酸序列,而多肽的相对分子质量大小和氨基酸序列又与蛋白质水解所用的蛋白酶种类和控制的水解度大小有关系[4].目前,在应用蛋白酶水解大豆蛋白的研究方面,大多考察蛋白酶对大豆蛋白的水解产物的得率多少,而对水解产物的分子量分布状态考察较少[5 6].具有活性的大豆肽对人体健康才有益,因此,考察酶解大豆肽的分子量分布状态对活性大豆肽的应用有十分重要的意义.

1 材料与方法

1 1 试验材料

1 1 1 原材料

大豆分离蛋白:吉林省通榆蛋白质厂

1 1

2 主要仪器

高效液相色谱仪(美国戴安Dionex Summ it)、小型喷雾干燥机(山东天力)

*收稿日期:2009 10 13

基金项目:长春市应用技术研究计划资助项目(08YJ18).

作者简介:陈 星(1953 ),男,吉林长春人,研究员,主要从事大豆、玉米深加工、生物有效物质的分离提取研究.

2西南大学学报(自然科学版) 投稿网址http://x bg jxt sw u cn 第32卷

1 1 3 试 剂

木瓜蛋白酶、大豆蛋白改性酶(南宁庞博生物工程有限公司)、碱性蛋白酶、中性蛋白酶(无锡酶制剂厂)、蛋白液化剂(福谷生物工程有限公司)、风味蛋白酶(丹麦诺维信(中国)生物技术有限公司)蛋白质分子量标准品:核糖核酸酶A,相对分子质量为13000~13700;细胞色素C,相对分子质量为12400;全转铁蛋白,相对分子质量为77000;脱辅基红蛋白,分子质量为16951

肽分子量标准品:;甘氨酸 酪氨酸,相对分子质量为239 2;缬氨酸 酪氨酸 缬氨酸,相对分子质量为379 5;蛋氨酸脑啡肽,相对分子质量为573 23;亮氨酸脑啡肽,相对分子质量为555 63~569 65;血管紧张素,相对分子质量为1296

标准品均购自美国Sigm a公司;

1 2 分析方法

参照Q B/T22492 2008方法[7],高效液相色谱仪分析,测定条件:色谱柱为T SKgelG2000SWXL (300m m!7 8m m,日本东洋曹达)凝胶柱;流动相为V乙腈?V水?V三氟乙酸=10?90?0 1;紫外检测器的波长设为220nm;泵流速设为0 5mL/m in;柱温设为30#;进样体积为10 L.

分别用流动相制成质量分数为0 1%的上述不同分子量肽标准品溶液,用孔径0 45 m聚四氟乙烯膜过滤后进样,得到系列标准品的色谱图.以分子量的对数(lgM W)对保留时间作图或作线性回归得到分子校正曲线方程.

分别称取大豆肽粉20 0mg于10mL容量瓶中,用流动相定容至刻度,超声振荡10min,使样品充分溶解混匀,再用孔径0 45 m聚四氟乙烯过滤膜过滤后,上机进样.

1 3 实验方法

1 3 1 酶解工艺

大豆分离蛋白?调浆?酶解?酸沉离心分离?上清液喷雾制粉

取大豆分离蛋白10g,加500mL蒸馏水,搅拌调浆,加酶酶解,最适温度,最适pH,水浴保温搅拌水解3h,80#灭酶10min,调pH4 5~5 0沉淀未水解蛋白质,离心分离,上清液喷雾制粉.

1 3

2 酶解条件

各种蛋白酶在推荐的最适条件下,根据各种酶的酶活力换算酶解浓度(E/[S]),使各种酶水解水平一致,并保持在最佳条件下进行.

表1 各种蛋白酶的酶活力及最适温度和pH

酶种类酶活力/(u%g-1)最适温度/#最适pH换算浓度/%木瓜蛋白酶350万556 50 07大豆蛋白改性酶25万507 01 00碱性蛋白酶10万508 02 50

中性蛋白酶5万507 05 00

蛋白液化剂20万507 01 25

风味蛋白酶1 84万556 013 58

*以中性蛋白酶酶活力为基数,酶浓度5%,以此换算其它酶的酶解浓度.

表2 单一蛋白酶水解条件

酶种类酶浓度/%反应时间/h温度/#pH 木瓜蛋白酶0 073556 5大豆蛋白改性酶1 003507 0碱性蛋白酶2 503508 0

中性蛋白酶5 003507 0

蛋白液化剂1 253507 0

风味蛋白酶13 583556 0

表3 复合蛋白酶水解条件

酶种类

酶浓度/%反应时间/h

温度/#pH 木瓜蛋白酶+碱性蛋白酶1 283527 3木瓜蛋白酶+蛋白液化剂0 663526 8大豆蛋白改性酶+蛋白液化剂1 1253507 0大豆蛋白改性酶+碱性蛋白酶1 753507 5风味蛋白酶+碱性蛋白酶8 043527 0风味蛋白酶+中性蛋白酶

9 29

3

50

7 0

*复合酶酶解浓度、温度、pH 取两单一酶推荐数据平均值确定.

1 4 大豆肽分子量分布状态分析依据

依据QB/T 22492 2008规定分子量 5000Dalto n 为大豆肽;一级品M W 2000Dalton,二级品M W 5000Dalton,肽含量&80%.据资料报导生物活性肽是一类分子量小于6000Dalto n,具有多种生物学功能的多肽;具有活性的大豆肽是多肽混合物,以3~6个氨基酸组成的小分子肽为主,分子质量在1000Dalton 以下;氨基酸残基的平均分子量128,肽链平均长度为每个组分峰位置的分子量/128;色谱峰面积超过20%的组分,计算分子量,界定出分子量分布范围.据此考核不同酶解的蛋白分子中大豆肽含量,判定不同蛋白酶水解生成具有活性的大豆肽的效果.

2 结果与讨论

2 1 标准蛋白质、肽的高效液相色谱及标准曲线

通过高效液相色谱确定标准蛋白质、肽的出峰时间、面积,得到系列标准品的色谱图.以分子量的对数(lgM W)对保留时间作图或作线性回归得到分子校正曲线方程

.图1 标准蛋白质、肽分子量曲线

2 2 大豆肽分子量分布状态分析2 2 1 不同分子量范围分析

通过高效液相色谱结果计算分析,6种单一蛋白酶水解生成的蛋白和肽分子量范围差异很大(表4),从分子量范围比较中可以看出,大豆蛋白改性酶和风味蛋白酶水解效果最好,大豆分离蛋白酶解后分子量分布范围分别在6441~144Dalto n 和9462~139Dalton 之间,均符合肽的标准.从各组分百分比可以看出,大豆蛋白改性酶M W 5000Dalton 的组分占97 42%,M W 1000Dalton 的组分占97 42%.风味蛋白酶M W 5000Dalto n 的组

分占94 60%,MW 1000Dalton 的组分占94 00%.说明这两种酶水解的活性短肽含量高.6种复合蛋白酶水解生成的蛋白和肽分子量范围差异也很大,相比之下,以大豆蛋白改性酶与蛋白液化剂组合最好,其分子量范围在4560~141Dalton 之间,M W 1000Dalton 的组分占99 52%;风味蛋白酶与碱性蛋白酶组合次之,其分子量范围在6006~1711Dalton 之间,MW 1000Dalton 的组分占95 17%.2 2 2 峰面积&20%的组分分析

峰面积&20%的组分分析结果表明,单一酶综合各项指标分析,以大豆蛋白改性酶和风味蛋白酶水解效果好,其主峰顶端MW 分别为836和766;肽链平均长度6 6和5 9;峰面积86 39%和84 24%;分子量范围3288~306Dalton 和4365~139Dalton.复合酶综合各项指标分析,以大豆蛋白改性酶+蛋白液化剂组合与大豆蛋白改性酶+碱性蛋白酶组合最好,其主峰顶端MW 分别为946和857;肽链平均长度7 3和6 6;峰面积87 59和84 09%;分子量范围4560~289和3664~332Dalton.

3

第7期 陈 星,等:不同蛋白酶酶解产物活性大豆肽分子量分布状态的研究

表4 不同分子量范围中蛋白和肽含量

酶类型分子量范围Dalton M W 5000/%

M W 1000/%

木瓜蛋白酶33000-13091 4827 53碱性蛋白酶22880-13096 758 87中性蛋白酶32968-13692 5389 54蛋白液化剂31477-13498 7610 22大豆蛋白改性酶6441-14497 4297 42风味蛋白酶

9462-13994 6094 00木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶

26810-16298 059 91木瓜蛋白酶与蛋白液化剂

29505-13897 6756 72大豆蛋白改性酶与蛋白液化剂4560-14199 5299 52大豆蛋白改性酶与碱性蛋白酶8373-14693 6092 61风味蛋白酶与碱性蛋白6006-17196 6095 17风味蛋白酶与中性蛋白酶

3862-162

99 90

25 20

表5 峰面积&20%的组分分析

酶类型峰面积&20%的组分

峰号M W 肽链平均长度

峰面积%

分子量范围Da lton

木瓜蛋白酶7340826 6

25 345333-1563

8156312 221 823408-542碱性蛋白酶1310908 586 424879-309中性蛋白酶98536 682 473782-136蛋白液化剂7325625 430 5131477-1027大豆蛋白改性酶148366 586 393288-306风味蛋白酶137665 984 244365-139木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶711739 1688 1411117-369木瓜蛋白酶与蛋白液化剂3317124 740 5110280-221359867 742 332213-528大豆蛋白改性酶与蛋白液化剂39467 387 594560-289大豆蛋白改性酶与碱性蛋白酶88576 684 093664-332风味蛋白酶与碱性蛋白酶97485 871 733685-300111711 321 66300-83风味蛋白酶与中性蛋白酶

810898 571 403862-29510

162

1 2

23 33

295-21

2 2 3

部分高效液相图谱

图2 碱性蛋白酶酶解生成蛋白质和肽的分子量分布

4西南大学学报(自然科学版) 投稿网址http://x bg jxt sw u cn 第32卷

图3

蛋白液化剂酶解生成蛋白质和肽的分子量分布

图4

大豆蛋白改性酶酶解生成蛋白质和肽的分子量分布

图5

风味蛋白酶酶解生成蛋白质和肽的分子量分布

图6 木瓜蛋白酶与蛋白液化剂酶解生成蛋白质和肽的分子量分布

5

第7期 陈 星,等:不同蛋白酶酶解产物活性大豆肽分子量分布状态的研究

图7

大豆蛋白改性酶与蛋白液化剂酶解生成蛋白质和肽的分子量分布

图8

大豆蛋白改性酶与碱性蛋白酶酶解生成蛋白质和肽的分子量分布

图9 风味蛋白酶与碱性蛋白酶酶解生成蛋白质和肽的分子量分布

3 结 论

通过研究不同蛋白酶对大豆分离蛋白的酶解产物活性大豆肽的分子量分布状态.筛选出水解效果最好

蛋白酶.综合不同分子量范围分析与峰面积&20%的组分分析,结果表明,6种单一蛋白酶水解生成的蛋白和肽分子量范围差异很大,大豆蛋白改性酶水解效果最好,酶解后分子量分布范围在6441~144Dalton 之间,均符合肽的标准.从各组分百分比可以看出,大豆蛋白改性酶MW 1000Dalto n 的组分占

6西南大学学报(自然科学版) 投稿网址http://x bg jxt sw u cn 第32卷

97 42%.6种复合蛋白酶水解生成的蛋白和肽分子量范围差异也很大,相比之下,以大豆蛋白改性酶与蛋白液化剂组合最好,其分子量范围在4560~141Dalto n 之间,M W 1000Dalton 的组分占99 52%.

具有活性的大豆肽对人体健康才有益,因此,考察酶解大豆肽的分子量分布状态对活性大豆肽的应用有十分重要的意义.本研究结果可作为活性大豆肽制备中选择蛋白酶的参考指标,此外对活性大豆肽的研究还需要从原料蛋白、酶、酶解物的分子组成及氨基酸结构、蛋白肽的功能性等相关方面进行深入研究.参考文献:

[1]

郑建仙.功能性食品学[M ].北京:中国轻工业出版社,2003,37 39.

[2] 李世成,王启荣.活性肽在大鼠小肠吸收特点的实验研究[J].中国运动医学杂志,2004,23(3):271 276.[3] 闫 萍,李茂辉,郭 红,等.大豆小分子肽抗疲劳效果评价[J].中国公共卫生,2008,24(2):217 218.[4] 刘健敏,钟 芳,麻建国.大豆生理活性肽的研究(工)[J].无锡轻工大学学报,2004,23(3):41 45.[5] 张玲华,唐晓俊.大豆多肽制备工艺的研究[J].食品与发酵工业,2001,27(3):37 39.[6] 俞伟辉,阳建辉.大豆蛋白酶法水解的研究进展[J].江西饲料,2008,5:7 9.

[7] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.Q B/T 22492 2008大豆肽粉[S].北京:中国标准出版社,2008.

Molecular Weight Distribution of Active Soybean

Peptide Hydrolyzed by Different Kinds of Protease

CH EN Xing, L I X iao lei, WU Qiong

Ke y La boratory of Ag ricultura l Pro ducts Pro cessing ,Chang chun Unive rsity ,Cha ngc hun Jilin 130022,China

Abstract:Soy protein isolate w as hydrolyzed w ith six kinds o f single enzym e and six kinds of multi en zyme,and the m olecular w eig ht distribution w as analyzed w ith hig h perform ance liquid chro matography (H PLC)to determine the effect of hydrolysis of different pro teases.T he results show ed g reat differences in molecular w eight distribution of pr oteins and peptides hydrolyzed by different kinds o f sing le protease and the optimum effect w as obtained w ith soy pr otein mo dification enzyme,the molecular w eight distr ibu tion being in the rang e of 6441-144Dalton,in ag reem ent w ith the standard fo r peptide.The com po nents hy dro lyzed by soy pr otein m odified enzy me w ith an M W 1000Dalton acco unted for 97 42%.T he range of molecular w eig ht o f proteins and peptides hydrolyzed by the multi enzymes varied greatly.T he optim um com bination w as soy protein m odificatio n enzym e and pro tein liquefaction agent.Its molecular w eight rang e w as betw een 4560-141Dalto n,and the components w ith an M W 1000Dalton accounted fo r 99 52%of the total.

Key words:protease;active soybean peptide;molecular weight distribution

责任编辑 汤振金

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