市售生鲜鸡肉5种主要食源性致病菌污染检测及分布概率评估_蒲承君11_崔兴博1_杜

网络出版时间：2014-10-11 16:34

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2014-10-10

市售生鲜鸡肉5种主要食源性致病菌污

染检测及分布概率评估

蒲承君11,崔兴博1，杜兰兰1，雷娅1，张宏宇1，刘芳2 ，董庆利1，刘 箐1,*（1.上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海 200093；2.甘肃出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心，

兰州 730020）

摘要：采用PCR技术对上海市52个市场的208份鸡腿、鸡爪、鸡翅、鸡胗、鸡胸肉中出血性大肠杆菌O157:H7、

沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌五种食源性致病菌进行快速检测，以了解不同鸡肉食用

部位各种致病菌的分布规律，并根据β概率分布确立最具代表性的部位作为评估靶点。结果显示：在208

份样品中，大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌未检出；阪崎肠杆菌在鸡翅中检出1株；志贺氏菌检出2株，分

布于鸡翅、鸡胗；单增李斯特菌检出11株，检出率达5.29 %，且在鸡翅中检出率最高（4株），鸡腿（3

株）、鸡爪（3株）部位检出率相当，鸡胗检出率最低（1株）。本研究可为致病菌科学取样、流行病学调查

提供一定的理论依据。

关键词：PCR；致病菌；生鲜鸡肉；β概率分布；评估靶点

中图分类号:R155.5 文献标识码：A

Pollution Detection of Five Main Foodborne Pathogens and Distribution Probability

Assessment of Raw Chicken

PU Cheng-jun1, CUI Xing-bo1, DU Lan-lan1, LEI Ya1, ZHANG Hong-yu1, LIU-Fang2, DONG Qing-li1, LIU

Qing1,*

(1.College of Food Science & Medical Instrument,the University of Shanghai for Science and Technology,

Shanghai 200093, China；2.International Travel Health Care Center of Gansu Entry & Exit Inspection and

Quarantine Bureau, Lanzhou 730020, China)

Abstract：In order to know the distribution of pathogens in different parts in raw chicken, PCR is used to detect

Escherichia coli O157:H7, Salmonella, Shigella, Listeria monocytogenes and Enterobacter sakazakii that

distribute on drumstick, chicken toe, chicken wing, chicken breast and gizzard that aggregate 208 in 52 markets of

Shanghai. Then we establish evaluation of the target point according to beta probability distribution. The results

indicated that Escherichia coli O157:H7 and Salmonella were not detected, 1 strain of Enterobacter sakazakii was

detected in chicken wing, 2 strains of shigella were detected in chicken wing and gizzard, 11 strains of Listeria

monocytogenes were detected. The detection rate of Listeria monocytogenes in chicken wing was the highest (4

strains), drumstick (3 strains), chicken toe (3 strains) were considerable, but in gizzard (1 strain) was the lowest.

Our study can provide certain theoretical basis for survey of pathogen epidemiology and scientific sampling of

pathogens.

Key words: PCR; pathogens; raw chicken; beta probability distribution; evaluation of the target point

食源性致病菌如沙门氏菌、单增李斯特菌等是造成食源性疾病爆发的主要原因[1]。在我国，2000-2006年卫生部发布的食物中毒公告显示，微生物性危害导致的食物中毒人数占总中毒人数的

51.33%，大约是化学性危害导致中毒人数的212倍[2]。这些由致病菌所引发的急性食物中毒常出现恶

基金项目：大学生创新创业训练计划项目（XJ2013231），上海市科委重点支撑项目，项目编号：

作者简介：蒲承君（1992-），女，本科，研究方向为食品微生物，E-mail：chengjunpu@https://www.wendangku.net/doc/a26247249.html,

通信作者简介：刘箐（1970-），男，教授，博士，主要研究方向为食源性致病菌致病机理及快速检测技术

研究，E-mail：liuq@https://www.wendangku.net/doc/a26247249.html,

心、腹痛、腹泻、发烧等症状，重者威胁呼吸、循环、神经系统甚至留下后遗症[3-6]。

在食源性致病菌调查中，一般采取随机取样的方法，但对取样部位并没有明确的规定。一般随机以某种肉制品的某个部位作为整体的代表取样检测，进而对致病菌的污染状况进行评价。但按照致病菌侵染机理，动物组织携带细菌数量应该有所区别，目前这种对采样部位没有明确规定、随机抽样可能存在以偏概全，盲人摸象的弊端，不仅容易造成致病菌监测漏检 [7-8]，而且不能为食源性致病菌的风险评估和预警提供准确、科学的数据。高巍[9]等通过对生长猪胃肠道不同区段的益生菌分布数量及规律进行研究，发现乳酸菌、双歧杆菌、大肠杆菌在胃肠道不同区段的分布数量是不同的，但鸡肉不同食用部位致病菌分布有何特点，仍然缺乏基础研究数据。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）作为一种新的快速检测方法，被广泛应用于各种微生物的快速检测，具有快速、高效、定量、灵敏的特点[10]。本项目从上海市52个市场上采集了鸡翅、鸡腿、鸡爪、鸡胗、鸡胸肉共208份样品，利用出血性大肠杆菌O157：H7（Escherichia coli O157：H

） rfbE

斯特菌（

1

1.1

1.2

改良EC肉汤（mEC+n）、改良山梨醇麦康凯琼脂（CT-SMAC）、缓冲蛋白胨BPW、四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、沙门氏菌显色培养基、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、志贺氏菌增菌肉汤 - 新生霉素、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨（mLST）、万古霉素溶液、阪崎肠杆菌显色培养基、李氏增菌肉汤LB1，李氏增菌肉汤LB2，PALCAM 选择性培养基基础，PALCAM选择性添加剂，脑心浸液琼脂BHI购于北京陆桥技术有限责任公司；PCR的Buffer（10×），dNTP（2.5 mmol），Taq DNA Polymerase(5 U/μL)， MgCl2（25 mmol），loading buffer（6×），100 bp ladder DNA marker购自生工生物工程股份有限公司。

1.3仪器与设备

LRH-70生化培养箱上海一恒科技有限公司； G560E振荡器上海凡劲仪器设备有限公司；Gene Amp? PCR system 9700、凝胶成像系统美国基因有限公司。

1.4 引物

引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列如表2。

表2 PCR 引物

Table 2 PCR primers

目标基因 引物 引物序列（5’-3’） 片段大小/bp 引物序列来源 出血性大肠杆菌

O 157:H 7

rfbE 大肠1 大肠2 ATTGCGCTGAAGCCTTTG CGAGTACATTGGCATCGTG 499 SN/T 1869—2007[11] 沙门氏菌 invA invA1 invA2 GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA

CATCGCACCGTCAAAGGAAC

284 Rahn [12] 志贺氏菌 ipaH P1 GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC

629 SN/T 1869—2007[11]

buffer/(μL)

L) /(μL) 1+2/(μL)/(μL) 2L) 出血性大肠

杆菌O 157：H 7

5 2 1 2+2 5 30 3 95℃5min;95℃15s,55℃30s,72 ℃1min, 35个; 72 ℃5min;35个 沙门氏菌 5 4 0.5 2+2 5 28.5 3 95℃5min;95℃1min;58℃1min;

72℃2min;72℃10min;35个

志贺氏菌 5 2 1 2+2 5 30 3 95℃5min;95℃15s;60℃30s;

72℃30s;72℃5min;35个

单增李斯特

菌

5 2 0.5 3+3 5 28.5 3 95℃5min;95℃30s;55℃45s;62 ℃30s;72℃5min ；35个 阪崎肠杆菌 5 4 1 2+2 5 28 3 94℃5min;94℃30s;57℃30s;72

℃30s;72℃7min;35个

1.5.3 PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定

将PCR扩增后的产物用1.5 %（80 mL 0.5 × TAE中加1.2 g琼脂糖）的琼脂糖凝胶电泳分离，取10 μL PCR产物与2 μL 6 × loading buffer混合后点样，100 V电泳40 min，取出凝胶，在凝胶成像仪上观察。

1.5.4菌株冻存

目的菌经检出后，菌液与甘油以1：1混合存于经灭菌后的冻存管中，放-80℃保存。

1.5.5β概率分析

通过当前实际取样检测的数值推测上海市整体的致病菌分布的概率情况。一般来说，阳性率推测总体符合beta函数的概率分布，Beta (alpha1, alpha2) 表达式中β分布，具有形状参数α1和α2，一般对应着：

α1= s+1

α2 = n-S+1

其中n是当前取样数，s是阳性检出数。以@Risk软件定义β分布，即可得到95%置信区间的概率。

2结果与分析

2.1 选择性培养基分离结果

样品经分离至选择性培养基上所得菌落形态如图1。样品共计208份，出现出血性大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌可疑菌落的平板分别为126个、141个，出血性大肠杆菌O157:H7在山梨醇麦康凯琼脂平板上，典型菌落中心呈现较暗的灰褐色，边缘无色，沙门氏菌在亚硫酸铋琼脂平板上，典型菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色，但经PCR鉴定后均非目标菌（图1中未显示）；出现志贺氏菌可疑菌落的平板共计148个，其中1、2号平板分别为闵行欧尚超市的鸡胗、内江支路菜市场的鸡翅，3号平板为阳性对照，典型菌落呈粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐；出现阪崎肠杆菌可疑菌落的平板共计65个，其中4号平板为阳性对照，5号平板为龙江菜市场的鸡翅，典型菌落呈蓝绿色，不透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐；出现单增李斯特菌可疑菌落的平板共计78个，6号平板为阳性对照，7-17号平板为所测部分样品，典型菌落为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

11 12 13 14

15

16 17

1-3(XLD 平板分离)：志贺氏菌ATCC 9207，鸡胗（闵行欧尚超市），鸡翅（内江支路菜市场） 4-5（阪崎肠杆菌显色培养基分离）：

阪崎肠杆菌ATCC 29554，鸡翅（龙江菜市场） 6-17（PALCAM 平板分离）：单增李斯特菌ATCC 19116，鸡腿（周家嘴莲花超

市），鸡翅（引翔港菜市场），鸡腿（心诚农贸市场），鸡爪（凤城农贸市场），鸡翅（双辽菜市场），鸡爪（国太菜市场），鸡爪

（国京菜市场），鸡腿（国太菜市场），鸡翅（阜新菜市场），鸡腿（连阳菜市场），鸡翅（扬州路农贸市场）

图1 选择性培养基分离结果

Fig.1 Selective plate results

2.2 PCR 检测结果

对2.1中出现可疑菌落的平板进行PCR 鉴定，通过凝胶成像系统进行观察，最终检出2株志贺氏

菌，分别分布于欧尚超市鸡胗（如图2，3号泳道）、内江支路菜市场鸡翅（图3，6号泳道），大小为

629 bp ；阪崎肠杆菌检出1株，分布于龙江菜市场鸡翅（图4，5号泳道），大小为282 bp ；单增李

斯特菌检出11株，分别分布于凤城农贸市场鸡爪、双辽菜市场鸡翅、扬州路农贸市场鸡翅、引翔港

菜市场鸡翅、国太菜市场鸡爪、东安菜市场鸡爪、周家嘴莲花超市鸡腿、阜新菜市场鸡翅、国太菜市

场鸡腿、国京菜市场鸡爪、心诚农贸市场鸡胗（图5，2、3、5、6、8-14号泳道），大小为234 bp 。

综上，此次致病菌检出情况为：单增李斯特菌>志贺氏菌>阪崎肠杆菌>沙门氏菌=出血性大肠杆菌

O 157:H 7。

M:Marker; 1-16: 鸡翅 鸡腿 鸡胗 鸡胸（欧尚超市）鸡腿 鸡翅 鸡胸 鸡爪（沃尔玛超市）鸡胸 鸡胗 鸡腿 鸡翅（闵行易初莲花）

鸡翅 鸡爪 鸡胗 鸡腿（周家嘴易初莲花）17 阳性对照 ATCC 9207

图2 志贺氏菌PCR 检测结果

Fig.2 PCR results of Shigella

100bp 600bp

M:Marker; 1-9: 鸡腿 鸡爪 鸡翅（申象菜市场）鸡胗 鸡腿 鸡翅 鸡爪（内江支路菜市场）鸡爪（虬江菜市场）鸡腿（国年菜市场）10阳性对照ATCC 9207 11 鸡胗（国年菜市场）

图3 志贺氏菌PCR 检测结果

Fig.3 PCR results of Shigella

M: Marker; M: Marker; 1-15: ATCC 19116，鸡爪（凤城农贸市场），鸡翅（双辽菜市场），鸡腿（连阳菜市场），鸡翅（扬州路农贸市场），鸡

，鸡胗（国太菜市场），鸡爪（国太菜市场），鸡爪（东安菜市场），鸡腿（周家嘴莲花超市）2.3

表4 鸡肉各部位致病菌分布

Table 4 Pathogens distribution in chicken

样品总数 检出数 检出率% 鸡翅

52 6 11.54 鸡腿

52 3 5.77 鸡爪

52 3 5.77 鸡胗

48 2 4.17 鸡胸 4 0 0

100bp 600bp

300bp

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

2.4 通过Beta概率分布获得的总体推测平均值

表5为β概率分布结果, 志贺氏菌在鸡翅、鸡胗中95 %的置信区间上阳性检出可分别达到8.64 %、

9.32 %，单增李斯特菌在鸡翅、鸡腿、鸡爪、鸡胗中95 %的置信区间上阳性检出可分别达到16.44 %、

13.98 %、13.98 %、9.32 %，阪崎肠杆菌在鸡翅中95 %的置信区间上阳性检出为8.64 % 。

综上可知，在95%置信区间，单增李斯特菌在鸡翅中检出率最高，可作为原料鸡肉最具代表性的

食用部位，以此为致病菌的风险评估提供一定的理论依据。

表5 β概率分布结果

Table 5 Results of β probability distribution

50%

60%

90%

95%

80%

70%

5%

40%

10%

30%

20%

志贺氏菌/鸡翅0.00675 0.0101 0.0156 0.0207 0.0259 0.0315 0.0378 0.0454 0.0554 0.0714 0.0864

明[28]等通过对莱阳市四个鸡肉销售市场的鸡肉各部位（鸡脖、鸡翅、鸡腿、鸡爪、鸡肝）的致病菌（沙

门氏菌、亚利桑那菌、大肠杆菌）进行研究发现，大肠杆菌检出率最高，就检出部位而言，鸡爪受致

病菌污染最为严重，鸡翅污染最轻。王欢[29]等对合肥市4家超市的冰鲜鸡肉各部位（鸡翅、鸡爪、鸡

胸肉）的菌落总数进行测定，发现鸡翅受微生物污染最严重，和我们的结果一致，但对于微生物易分

布于鸡翅的机理，仍缺乏相关研究。本研究所调查五种致病菌在鸡翅中检出率最高，达11.54%，可

作为鸡肉中致病菌污染的评估靶点。按照国标规定致病菌不得检出，从此次实验结果来看，上海市市

售鸡肉常见部位均受到志贺氏菌、阪崎肠杆菌及单增李斯特菌的污染，存在一定的安全隐患。

参考文献

[1] SCHMELCHER M, LOESSNER M J. Application of bacteriophages for detection of foodborne pathogens[J]. Bacteriophage.

2014, 4:e28137.

[2] 刘秀梅. 我国食品卫生微生物学30年来的热点研究及主要进展[J]. 中国食品卫生杂志, 2009, 21（4）: 0289-0290

[3] PARRY C M, THOMPSON C, VINH H,et al. Risk factors for the development of severe typhoid fever in Vietnam[J]. BMC

Infectious Diseases, 2014, (14): 73

[4] 蒋小平, 邓思敏, 钟巍, 等.大肠埃希菌O157:H7致病因素的研究进展[J]. 安徽农业科学, 2012, 40（11）: 6531-6533

[5] ZHAI L G, KONG X H, LU Z X, et al. Detection of Salmonella enterica serovar Dublin by polymerase chainreaction in multiplex

format[J]. Journal of Microbiological Methods, 2014: 52-57

[6] 胡光春, 杨月莲, 刘辉, 等. 阪崎肠杆菌致病性及致病机理研究进展[J]. 中国病原生物学杂志, 2011, 6（8）: 626-628

[7] 袁宝君, 戴建华, 乔昕, 等. 2007 年江苏省食源性致病菌监测分析[J]. 中国食品卫生杂志, 2009, 21（2）: 114-116

[8] 王卓, 李德华, 周汉洪, 等. 2010 年达州市食源性致病菌监测[J]. 预防医学情报杂志, 2012, 28（8）: 631-634

[9] 高巍, 孟庆翔, 肖训军, 等. 生长猪胃肠道乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌的数量和分布规律[J]. 中国农业大学学报, 2001, 6

（5）: 81-86

[10] 封莉, 黄继超, 刘欣, 等. 食源性致病菌快速检测技术研究进展[J]. 食品科学, 2012, 33（21）: 332-339

[11] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. SN/T 1869—2007 食品中多种致病菌快速检测方法PCR法[S]. 北京: 中国标

准出版社, 2007.

[12] RAHN K., DEGRANDIS S A, CLARKE R C, et al. Amplification of an invA gene sequence of Salmonella Typhimurium by

polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella. Mol. Cell. 1992, 6(4): 271–279.

[13] 王海艳, 刘中学, 刘虹. 食品中单增李斯特菌快速、敏感、特异PCR检测方法的建立. 检验检疫科学, 2006, 1: 3-6.

[14] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. SN/T 1632.2—2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法[S]. 北京: 中国标准出版社,

2005.

[15] 中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会. GB/T 4789.36—2008 食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌

O157:H7NM 检验[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[16] 中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会. GB/T 4789.4—2010 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌

检验[S]. 北京: 中国标准出版社, 2010.

[17] 中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会. GB/T 4789.40—2010 食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠

杆菌检验[S]. 中国标准出版社, 2010.

[18] 中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会.GB/T 4789.30—2010 食品安全国家标准食品微生物学检验单核细

胞增生李斯特氏菌检验[S]. 中国标准出版社, 2010.

[19] 中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会.GB/T 4789.5—2012 食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌

检验[S]. 中国标准出版社, 2012.

[20] JONG H Y, SU P T, SANPONG P, et al. PCR-based Restriction Fragment Length Polymorphism for Subtyping of Salmonella

from chicken Isolates[J]. Nat.Sci, 2010, 44: 79-83.

[21] 王虎虎, 徐幸莲. 冰鲜鸡肉中致病菌三重PCR检测方法的建立[J]. 中国农业科学, 2010, 53（17）: 3608-3615

[22] VALERO A, Hernandez M, Cesare A D, et al. Probabilistic approach for determining Salmonella spp. and L. monocytogenes

concentration in pork meat from presence/absence microbiological data[J]. International Journal of Food Microbiology, 2014. [23] Vinoth Kumar R, Arunagiri K, Sivakumar T. Studies on pathogenic Listeria monocytogenes from marine food resources[J].

International J Curr Microbiol App Sci, 2013, 1(1): 86-93.

[24] 戴贤君, 杨宗照, 张富明. 猪肉生产过程中大肠杆菌O157:H7的分离、鉴定及生物学特性[J]. 中国食品学报, 2010, 10（5）:

237-241

[25] 冯莹颖, 张强, 黄兰红, 等. InlA 和InlB 介导单核细胞增生李斯特菌入侵宿主细胞分子机制的研究进展[J]. 微生物学通报,

2009, 36（12）: 1894-1900

[26] SEVEAU S, PIZARRO C J, COSSART P. Molecular mechanisms exploited by Listeria monocytogenes during host cell

invasion[J]. Microbes and Infection, 2007, 9(10): 1167-1175

[27] SASAKI Y, HARUNA M, MURAKAMI M, et al. Contamination of Poultry Products with Listeria monocytogenes at Poultry

Processing Plants[J]. Public Health, 2014, 76(1): 129-132

[28] 孙晓明, 张海妍, 张松山, 等. 市售鸡肉产品的食源性致病微生物检测的研究[J]. 肉类研究. 2010, (7): 50-53

[29] 王欢, 金洪年, 王志耕, 等. 合肥市售冰鲜鸡肉中沙门菌及微生物污染状况调查[J]. 中国卫生检验杂志, 2010, 23

（3）:720-722.