(完整版)Brdu细胞增殖检测实验
Brdu检测细胞增殖实验
实验操作:
1．铺细胞，每个3.5cm dish 10万个，在37℃、5%CO2孵箱中培养72h（细胞密度至50-60%左右）。
2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加入培养细胞中，1mg/ml，标记48h。(量：Brdu以铺满整个dish底面为准。)
3．固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min，在摇床上晃动清洗，4%PFA固定30min。4．变性：将固定好的细胞爬片用PBS洗3次，每次5min，2mol/L的HCl在37℃条件下变性5min，可放置于37℃恒温孵箱，应用封口膜把培养皿封好。（120r/m）
5．中和：0.1mol/L的硼酸钠（PH8.3）中和10min，PBS洗3次，每次5min。（50r/m）6．加入1ml的0.2%TritonX-100，10min。
7．吸出TritonX-100，用PBS洗3次，每次5min。
8．加入1ml 3%的BSA封闭，室温1h，可在摇床上晃动。
9．吸出BSA，用PBS洗3次，每次5min。
10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷Brdu（鼠单抗）1:200），用1%BSA稀释，4度过夜。11．将孵好一抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。
12．加二抗（羊抗鼠IgG/Alexa Fluor 594 1: 100），用1%BSA稀释，避光室温孵育1h。（60 r/min）13．将孵好二抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。
14．加DAPI染细胞核，储存浓度为1mg/ml，应将DAPI完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为1:1000（用PBS稀释），避光室温反应10min。
15．将DAPI染好的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。
16．中性树胶封片，荧光显微镜观察，200×镜下取5个视野，计数Brdu阳性细胞和蓝染的细胞核数目，然后进行统计分析。
试剂配制：
a. Brdu的溶解：室温下，将250mg粉末溶于2.5ml的DMSO中，储存浓度为100mg/ml分
装，每管120ul，-20℃保存。
b. 2 mol/L HCl：取8.333mL 12 mol/L HCl的浓HCl，加入DDW定容至50 mL。
c. 0.1 mol/L硼酸钠：称量1.907g硼砂（Na2B4·10H2O 381.36 g/mol），加入DDW定容至50
mL，调PH=8.3。
d. 0.2% Triton X-100：有0.5%的Triton-100（2.5 mL原液溶解于47.5 mL的PBS中），用
PBS稀释至0.2%。
e. 3% BSA：称量1.5g BSA，溶解于50 mL的PBS中。
f. 1% BSA：用PBS稀释3%BSA至1%。
g. 4%FPS：4%多聚甲醛。
我是用DDW配制的，后来我发现很难溶，磁力搅拌器加热搅拌，虽然温度控制在60℃以下，也总是担心多聚甲醛分解为甲醛，所以，我就总结为如下：提前配制。
4%多聚甲醛溶液（pH7.2）试剂：多聚甲醛（PFA） 4g DDW 至100ml
配制方法：称取4g多聚甲醛（粉末状），置于三角烧瓶中，加入80mlDDW，放入37恒温水浴箱，每隔1-2小时摇晃混匀，16-24小时PFA会完全溶解。补充DDW，调节PH值。
实验原理：
1.免疫染色实验的基本原理
利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。
2.BrdU标记原理
细胞增殖周期包括G1、S、G2、M 4个时期，其中S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半保留复制，各种构成DNA的原料掺入到DNA中。BrdU作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物（其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与5位C原子连接的甲基被溴代替），像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA中。当细胞处于DNA合成期（S期）而同时又有BrdU存在时, 就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU就在胞核的DNA中长期存留。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示。
BrdU抗体比较大，由于DNA双链结构的位阻，BrdU抗体无法直接与双链上的BrdU结合，必须先用使DNA部分变性，这样变性了的DNA单链上的BrdU才能与BrdU抗体结合，因此做BrdU细胞增殖实验一定要变性，当然变性的方法包括酸解，热解等，但是要注意变性的程度也很重要。建议采用EdU细胞增殖检测方法，无需变性，无需酶解，无需抗体，小分子染色，3小时完成实验。EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo?荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通快速、更灵敏、更准确。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。
该方法能对细胞周期进行迅速而稳定的测量, 而且标记BrdU的细胞只要不受到紫外线照射，对细胞本身没有功能损害。该技术可应用到跟踪检测移植细胞的存活、分化和功能状态。
3.DAPI染色原理
DAPI为4’，6二脒基-2-苯吲哚(4’，6—diamidino-2—phenylindole)，能与双链DNA 小槽，特别是AT碱基结合，也可插入少于3个连续AT碱基对的DNA序列中。当它与双链DNA结合时，荧光强度增强20倍，而与单链DNA结合则无荧光增强现象，因此是一种简易、快速和敏感地检测DNA的方法。DAPI的荧光强度虽较Hoechst低，但荧光稳定性优于Hoechst；其特异性较溴化乙啶(ethidlium bromide，EB)和碘化丙啶(propidium iodide，P1)高。DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。
ANAL YSIS OF CELL CYCLE
1. INTRODUCTION
Cell cycle and apoptosis are very important functional parameters to assess the cellular metabolism, physiology and pathology. Several techniques have been developed to quantitate these parameters utilizing the differential staining of fluorescent dyes. We are describing four different flow cytometric methods, two for the discrimination of cell cycle phases (A and B) and two for the simultaneous assessment of cell cycle and apoptosis (C and D).
A) Bromodeoxyuridine/Propidium Iodide
The classical method for the analysis of cell cycle distribution is the flow cytometric measurement of DNA content which can simultaneously determine the incorporation of Bromodeoxyuridine (BrdU). The procedure requires that DNA is partially denatured to expose incorporated BrdU to a specific antibody. Denaturation is necessary because antibodies developed so far bind only to BrdU in single-strand DNA. The remaining undenatured DNA is then stained with Propidium Iodide (PI). Green fluorescence from the fluorescein-conjugated antibody is a measure of BrdU incorporation. Red fluorescence from the PI is a measure of DNA. The protocol described here uses high-molarity HCl for the denaturation of DNA. Furthermore, this method may be utilized either for unfixed or for fixed cells in suspension.
B) Cyclins/Propidium Iodide
Cyclins are key components of the cell cycle progression machinery. In particular, the expression of cyclins D, E, A and B1 provides new cell cycle landmarks that can be used to subdivide cell cycle into several distinct subcompartments. In this procedure cyclins expression is detectable using specific monoclonal antibodies (mAbs), and is analysed in respect to DNA content.
Generally, the peak of expression of cyclin D1 can be detected in early G1, the peak of cyclin E is typical of G1/S transition, the peak of cyclin A can be detected during G2/M phases and cyclin B1 is typical of late G2/M. Using this method, compared to the above mentioned protocol, it is possible to distinguish G0 from G1 and G2 from M phases. However, it is necessary to keep in mind that not all cell types behave in the same manner (for example, cyclin D1 is detectable not only in G0/G1 but also in G2/M, even if in a very few cell types).
C) TUNEL/Propidium Iodide
One of the most used protocol for the determination of apoptosis in the different phases of cell cycle is the enzymatic in situ labeling of apoptosis-induced DNA strand breaks (TUNEL). Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) have been used for the incorporation of fluorescein-labeled nucleotides to DNA strands breaks in situ . DNA content is revealed by red fluorescence from PI. In order to have more details, see the Chapters related to TUNEL technique.
D) F-Actin/Propidium Iodide
The analysis of apoptotic cells and estimation of their cell cycle specificity is also possible using a recent method. This is based on identification of apoptotic cells which have modified their cytoskleton and their DNA content. In specific, paraformaldehyde (PFA) fixation followed by staining of F-actin with fluorescein-conjugated phalloidin and of DNA with PI, are used. Furthermore, this procedure may be utilized also for adherent cells.
A) BrdU/PI PROTOCOL
A.2.1 Materials
BrdU (A2), washing buffer (A1), HCl 4 M, Borax buffer (A1), anti-BrdU antibody (A2), goat-anti-mouse-FITC antibody (A2), PI buffer (A1). A.2.2. Methodology
1. Cells (1x106 /mL) are incubated with BrdU 10 m M at final concentration, for 30 min at 37 °C in controlled atmosphere.
2.Wash twice at 500 g for 1 min using the washing buffer.
3. Resuspend in 0.5 mL of washing buffer and 0.5 mL of HCl 4 M.
4. Mix accurately and incubate for 30 min at room temperature.
5. Wash once as in step 2.
6. Resuspend in 1 mL of Borax buffer.
7. As in step 5.
8. Resuspend in 200 m L of washing buffer and label with 5 m L of mAb ant-BrdU.
9. Incubate for 1 hour at 4 °C in the dark.
10. As in step 5.
11. Resuspend in 200 m L of washing buffer and label with 4 m L of goat-anti-mouse FITC-conjugated antibody.
12. Incubate for 30 min at 4 °C in the dark.
13. As in step 5.
14. Resuspend in 200 m L of washing buffer and 200 m L of PI buffer.
15. Incubate for 15-30 min at 4 °C in the dark.
16. Analyse with flow cytometer equipped with a 488 nm argon laser.
A.3. COMMENTARY
A.3.1 Background information
In this procedure fixed cells by 4% PFA in Phosphate Buffer Saline (PBS) can be utilized. In this case to wash cells once in PBS before to start at step 1 is necessary.
Moreover, both direct and indirect immunofluorescence can be used. The BrdU incorporation is more evident using the indirect method.
A.3.2 Anticipated results
It is recommanded to perform each experiment using a negative and a positive control sample. The negative sample, in order to have a correct setting of instrument, is assessed following all the steps except step 8. The positive sample, in order to make sure that the method works, is assessed by using a proliferating cell line (such as U937, K562, MOLT4, etc.) following all steps. A.3.3 Time considerations
The protocol is simply but it require a quite long time. Indeed, for few samples, more or less 4 hours are required. The duration of the method is obviously depending on the number of samples. A.3.4 Key references
1. Dolbeare, F., Gratzner, H:, Pallavicini, M., Gray, J.W. 1983. Proc. Natl. Accad. Sci. U.S.A .80: 5573.
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，
所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一
细胞增殖教学设计
《细胞的增殖》教学设计 巨鹿二中王耀华 一．教材分析： 细胞的增殖是必修一《分子与细胞》第六章第1节的内容。是学生在学习了细胞生命系统的物质组成、结构之后，来认识细胞这个系统的产生、发展和消亡的过程。细胞分裂的三种方式中，有丝分裂是最主要、同时也是最重要的方式。多细胞生物的生长发育过程中，体细胞的增多就是通过有丝分裂实现的。无论是单细胞真核生物还是多细胞生物他们各种形式的无性生殖也是通过有丝分裂完成的。有丝分裂还是学习减数分裂的基础，而减数分裂知识又是学习遗传变异规律的基础。由此可见有丝分裂是非常重要的基础知识。因此在教学过程中一定要讲透，要让学生真正掌握有关知识。 二、学情生分析： 高一的学生由于在初中基本上不学习生物学，对生物学中的一些基本概念不甚了解，而且缺乏一定的空间感，故对本节内容的学习比较困难。因此要借助多媒体或模型来帮助理解。三．教学方法： 本节课教学内容理论性强、抽象复杂，所以课前我指导学生做好预习，课堂上充分利用多媒体辅助教学，增强教学的直观性和形象性性通过上一节课的模拟探究使学生了解了细胞增殖的必要性，明白了生物体的生长还要靠细胞增殖增加细胞数量。可以通过不同方式，从不同的角度进行分析，要充分调动学生参与整个学习过程。通过学习使学生了解到认识和分析一个生命现象可以有多种不同的方法——除了一般的文字描述外，还可以用图形描述特点；用图解和表格突出重点；用曲线描述量的变化规律和趋势；通过实验观察、验证生物学知识等……。使学生在掌握知识的同时了解一些常用的生命科学研究的基本方法。在讲有丝分裂各时期的主要特点时，我采用了FLASH动画逐步演示有丝分裂各时期，很好地让学生感受细胞分裂过程的动态性和连续性。黑板粘贴模型克服了多媒体手段转瞬即逝的弊端，较好地化难为易，化抽象为形象。 四．教目学标： （一）知识目标： 1、了解真核细胞增殖的方式及意义。 2、理解细胞周期的概念。 3、准确描述细胞有丝分裂各阶段的重要特征。了解动、植物细胞有丝分裂过程的异同。 4、掌握有丝分裂的过程、特征和意义。尤其是DNA和染色体的规律性变化。 （二）能力目标： 1、学习用曲线图描述DNA和染色体数量的变化规律 2、通过学习有丝分裂过程培养学生分析图像、解读图像的能力。 3、通过实验培养学生制作临时装片的技能，培养学生的观察、分析能力以及识图和绘图能力。 （三）情感态度与价值观： 1、通过对细胞周期以及有丝分裂过程中DNA和染色体的规律性变化的学习，培养学生树立唯物主义的世界观。使学生对生命的运动性、对事物发展变化过程中由量变到质变的转化等哲学问题有正确的认识。 2、通过对实验思路的分析和对实验现象的观察培养学生实事求是的科学态度和严谨的科学工作作风。 五．教学重难点： 教学重点：1、细胞周期的概念。
Brdu细胞增殖检测实验
Brdu检测细胞增殖实验 实验操作: 孵箱中培养72h（细胞密1．铺细胞，每个3.5cm dish 10万个，在37℃、5%CO 2 度至50-60%左右）。 2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加入培养细胞中，1mg/ml，标记48h。(量：Brdu 以铺满整个dish底面为准。) 3．固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min，在摇床上晃动清洗，4%PFA固定30min。4．变性：将固定好的细胞爬片用PBS洗3次，每次5min，2mol/L的HCl在37℃条件下变性5min，可放置于37℃恒温孵箱，应用封口膜把培养皿封好。（120r/m）5．中和：0.1mol/L的硼酸钠（PH8.3）中和10min，PBS洗3次，每次5min。（50r/m）6．加入1ml的0.2%TritonX-100，10min。 7．吸出TritonX-100，用PBS洗3次，每次5min。 8．加入1ml 3%的BSA封闭，室温1h，可在摇床上晃动。 9．吸出BSA，用PBS洗3次，每次5min。 10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷Brdu（鼠单抗）1:200），用1%BSA稀释，4度过夜。11．将孵好一抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 12．加二抗（羊抗鼠IgG/Alexa Fluor 594 1: 100），用1%BSA稀释，避光室温孵育1h。（60 r/min） 13．将孵好二抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 14．加DAPI染细胞核，储存浓度为1mg/ml，应将DAPI完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为1:1000（用PBS稀释），避光室温反应10min。 15．将DAPI染好的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 16．中性树胶封片，荧光显微镜观察，200×镜下取5个视野，计数Brdu阳性细
CCK8法检测细胞增殖预实验
SRT-1720, EX527 —定要应用在白血病细胞株起作用的浓度方可比较对 293T细胞和白血病细胞株的不同影响，请重复实验。 实验日期：2015/08/22-2015/08/27 实验项目：CCK8法检测细胞增殖 实验地点：广西医科大学药基楼14楼生物靶向中心 实验人员：高宗燕、宁海萍、李登峰 实验目的：检测SRT-1720/EX527刺激293T细胞后对细胞增殖的影响 主要试剂：SRT-1720,EX527,CCK8试剂盒 主要仪器：酶标仪 实验步骤： 一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时） 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞至96孔板。 2、设置4个细胞浓度梯度：0, 2000，4000，8000,每组4个复孔。 3、接种后培养24小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养4小时后测定OD值，制作出一条以细胞数量为 横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。） 图一、标准曲线 二、细胞增殖检测 1、在96孔板中配置100卩泊勺细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（在37C, 5% CO2的条件下）。 2、向培养板加入10 ^L SRT-1720（终浓度3um）, EX527 （终浓度100um）。 3、将培养板在培养箱孵育约24h 4、每孔加入10卩L CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
5、将培养板在培养箱内孵育2小时。
6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 图二、3um SRT1720刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线呈S形，符合细胞正常生长情况。 图三、100um EX527刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线前部分呈S形，符合细胞正常生长情况，但 在进入对数期之后曲线有下滑，之后进入平台期。 分析： SRT1720为SIRT1特异性活化剂，在前期实验中对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，此次实验中SRT1720对正常细胞（293T）的生长无明显抑制作用。暗示SIRT1的活化对正常细胞的生长可能无明显影 响。 小剂量EX527为SIRT1特异性抑制剂，在前期实验中大剂量EX527对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，而小剂量EX527无此效应，此次实验中大剂量EX527对正常细胞（293T）的生长可能有轻度抑制作用。但不能以一次实验结果做出肯定的结论，该实验还需重复。
CFSE细胞增殖实验
准备： 1.20ml预冷5%FBS(HI)-PBS 2.50ml 预冷MACS buffer 3.70um滤网 4.2.5ml RBC lysis 5.LS column 6.50ml 37度预热PBS 7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat Inactivated FBS+10 mM HEPES+1 mMpenicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol) （一）CD3抗体包被 取96孔板每孔加入100ul 10ug/ml anti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。 （二）淋巴细胞获取 1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。 2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度5min离心后弃上清。 3.2.5ml RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。
4.500g 4度5min 离心后弃上清，10ml MACS buffer重悬，计数。留取105 个细胞进行FACS。 （三）磁珠分选na?ve CD8a+ T细胞 1.Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. 2.Resuspend cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells. 3.Add 100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells. 4.Mix well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (2?8 °C). 5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells. 6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells. 7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (2?8 °C). 8.Wash cells by adding 10ml of MACS bufferper 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. 9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS bu ffer. 10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.
细胞增殖实验(MTT法)的步骤及方法
细胞增殖实验（MTT法）的步骤及方法 一、技术简介 细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞；同时，多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。真核细胞的分裂方式有三种，即有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。 MTT是3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide的简称。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。然后采用二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值，反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 二、实验流程（以贴壁细胞为例） 1. 收集对数期细胞，调整浓度。 2. 将细胞种植于96孔板中，待细胞贴壁后（约4-12 h）加药。 3. 5% CO2，37 o C孵育一定时间。 4. 每孔中加入200 μL MTT溶液（配制成5 mg/ml），培养4 h。 5. 吸去孔内的培养液，加入150 μL DMSO，可继续孵育4 h，使结晶物充分溶 解。 6. 取出96孔板，将其置于酶联免疫检测仪上，震荡15 s，然后在570 nm下 测量吸光值。 7. 结果统计分析。
细胞增殖MTT检测经验总结
细胞增殖检测：MTT实验经验总结 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。 MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞 同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色 培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 4、比色 选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 二、注意事项 1、选择适当得细胞接种浓度。 2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！ 三、举例 各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：
细胞增殖毒性实验步骤cck8知识讲解
如有侵权请联系网站删除 细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、 15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶（0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1、倒去培养瓶内的培养液； 2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 3）加入胰酶500ul/0.5ml 2?10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 4）加入含10%FBS勺培养液1?1.5ml［培养液：胰酶=（2?3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 6）将单细胞悬液吸入10?15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清 液； 7）加入含10%FBS ffl胞培养液1?2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养 24-72 小时（37 C，5%CO2,使细胞贴壁； 10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物； 11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）； 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。 当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 12）向每孔加入10让（约10%）CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）； 13）将培养板在培养箱内孵育1?4小时（半小时测一次OD值）； 14）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 精品资料
细胞增殖实验(MTT assay)
MTT实验 一．实验原理 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制 将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。 三．实验步骤 1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清， 正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。 2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性 测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。） 3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基 稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含 0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结 晶的生成。 4.结晶的溶解及吸光值测定：结晶生成后，轻轻吸出原培养基，加150μLDMSO溶解， 室温轻轻震荡5min，以保证结晶完全溶解；迅速取出96孔板，在酶联免疫检测仪，选择波长490nm测定每孔的吸光值。 5.根据实验设置的需要，每隔一定时间重复测定细胞的活性，收集数据；同时进行重复 实验，以保证结果的准确性。
脾细胞增殖实验
淋巴细胞转化试验（Lymphocyte Transformation Test， LTT） [ 来源：点击数： 278 更新时间： 2009年08月26日 ][ 收藏本文 ] T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原（如植物血凝素 Phytohemagglutimin，PHA）或特异性抗原刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加并能进行分裂，成为淋巴母细胞，即为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体细胞免疫水平。因此可作为测定机体免疫功能的指标之 一、形态学检测法 【原理】 淋巴细胞在有丝分裂原（PHA或ConA）或特异性抗原刺激下发生转化，产生一系列变化如细胞变大、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由淋巴细胞转变成淋巴母细胞。通过母细胞转化率，了解机体的细胞免疫状态。 【材料】 Wright-Giemsa染液细胞培养液：多用RPMI1640。按说明书配制后抽滤除菌，临用前加入20%无菌NBS、PHA 50～200μg/ml、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml）。 肝素（400单位/ml，用Hanks液配制），0.5 ml可抗凝血5 ml。 2.5%碘酒、75%酒精。 载玻片、无菌棉签、无菌注射器5 ml及7号针头、试管毛细滴管、培养瓶、高压灭菌器、CO2孵箱或恒温培养箱、水平离心机、无菌过滤器、各种吸管、超净台。 【方法】 1．灭菌器材将注射器及针头、吸管、培养瓶等高压灭菌，0.103 Mpa（15磅/吋2）20 min。2．分装培养液于各培养瓶中，每瓶2 ml。 孵箱培养72 h，期间3．抽取静脉血0.2 ml，无菌操作注入培养瓶内，立即摇匀，置37℃、5%CO 2 每天旋转摇匀1次，使细胞充分混匀。 4．培养后，摇匀细胞，倒入离心管内，1000 r/min离心10 min。 5．由于大的细胞离心后居上层者较多，只吸上层细胞推片计数，结果易偏高。所以准确计数方法是在倒净上清后，残留与管壁的少量液体回流至管底后，用毛细滴管吹打将管内细胞打散，置1滴于玻片上，用毛细滴管前端刮片，均匀分布于全片，染色，按头、体、尾三段各1～2纵列（计数走向似城墙形）进行计数，以减少分布不均带来的误差，每片计数100～200个淋巴细胞。记录转化和未转化的淋巴细胞数，求出转化率。 【结果】 1．用形态学方法判断转化率，掌握淋巴细胞的形态学至关重要，应根据细胞的大小、核与浆的比例、胞浆的染色性、核结构和核仁的有无等特征进行判别。 ⑴成熟的小淋巴细胞：与未培养的小淋巴细胞一样为6～8μm，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。 ⑵过度型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，约10～20μm，核染色致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。 ⑶淋巴母细胞：细胞体积增大，约20～30μm，形态不整齐，常有小突起，核变大，核质染色疏散，有明显核仁1～2个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。 ⑷其它细胞：如中性粒细胞在培养72 h后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。 2．计算转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过度型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞，在正常情况下，PHA淋巴细胞转化率为60～80%，如为50～60%则偏低，50%以下则为降低。 问题： 1．T，B淋巴细胞在何种情况下能发生转化现象？何谓转化现象？
细胞cck 检测实验
细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞复苏、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1）从液氮中取出细胞株,37-40℃温水迅速复苏，常规培养于含10%FBS、80U/ml 青霉素及0.08mg/ml链霉素的培养基中，放入３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度的培养箱中培养，每２天换液１次。 2）倒去培养瓶内的培养液； 3）加入PBS2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 4）加入胰酶500ul/0.5ml2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 5）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；6）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 7）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm3分钟，倒去上清液； 8）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 9）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 10）在96孔板中，给每孔加100μL（约10000个细胞）的细胞悬液，每组设５个复孔，将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁；11）向培养板中加入100ul含药物培养基 12）将培养板在培养箱干预24、48、72ｈ后，每孔加入20ulCCK-8液，在培养箱继续培养0.5-２ｈ，酶标仪检测450nm处吸光值（A），计算抑制率 抑制率＝（阴性对照A值－二甲双胍各浓度A值）／阴性对照A值×100% 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 13）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下24小时内测定，吸光度不会发生变化。 CCK8对照组的设置及测定的注意事项
《细胞增殖》第1课时-细胞增殖实验
《细胞增殖》第1课时|细胞增殖实验 一、教材内容分析（一）教学内容的地位《细胞增殖》是高中生物必修教材第二章《生命活动的基本单位――细胞》中第二节内容，它是建立在已经学习第一节《细胞结构和功能》，掌握了细胞的基本结构及功能的基础之上来学习该节内容，同时，为学习第五章《生物的生殖、发育》中减数分裂和第六章《遗传和变异》中遗传的基本规律知识奠定基础，起到了承前启后的作用，并且是历年来高考的重要考点，在近五年的各地高考试卷中，总分达47分，具有十分重要的作用。（二）教学目标1、知识目标知道细胞增殖的方式、意义以及无丝分裂的过程和特点。识记有丝分裂细胞周期的概念；动植物细胞有丝分裂过程的异同点；有丝分裂的特征和意义。应用有丝分裂过程各时期的特点。2、能力目标1）凭借有丝分裂过程图、图文结合，培养学生的识图能力，形象思维能力。2）运用坐标曲线归纳出有丝分裂过程中染色体数目DNA含量变化，培养学生的分析能力。3）情感目标细胞分裂――运动是物质的根本属性，建立生命活动的唯物主义观点。（三）教学重点、难点1、教学重点真核细胞有丝分裂的细胞周期的概念和特点以及真核细胞有丝分裂的过程。2、教学难点真核细胞有丝分裂过程中，各个时期染色体的变化特点。 二、教学对象分析首先，作为高二的学生，已经具备了一定的阅读能力、自学能力，对于一些基础知识可由其自学；其次，生物这门学科是高二初开的一门学科，学生对其学习的方法和技巧欠缺，有关生物的基础知识积累少；第三，激发学生对于生物这门学科的学习兴趣也很重要。三、教学时间安排由于学生实际情况，加之本节内容知识点多，学生理解较为困难，因而教学时间安排为3课时（讲授2课时，实验1课时），本次说课内容仅限于第1课时（内容：细胞增殖方式、意义；有丝分裂细胞周期的概念，植物细胞有丝分裂过程）。四、教法和学法学生是教学的主体，让学生积极参与到探求知识的过程中，主动去获取知识，这是现代教学理念的基本观点，因而，在本课教
MTS细胞增殖检测方法
MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒 产品组成： 产品编号BB-4204-1 BB-4204-2 BB-4204-3 规格250 assays 500 assays 1000 assays MTS溶液 2.5ml 5ml 10ml 产品简介： BestBio贝博MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒是应用新型的水溶性甲臢化合物[3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），内盐；MTS]快速高灵敏度检测细胞增殖和细胞毒性的比色检测产品。 MTS被细胞生物还原成一种可溶于组织培养基的甲臢化合物，新陈代谢活跃的活细胞内的脱氢酶类将MTS转化成液态可溶的甲臢化合物，这种甲臢化合物在490nm的吸收值可以直接在96孔板上测量，而不需要另外作处理。由490nm测量的吸收值所表示的甲臢产物的数量与培养物中活性细胞的数量成正比。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数量呈线性关系。 活性测定使用方法： 1、收集细胞，加细胞悬液100ul（约5000-10000个细胞）到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填充）。每板设对照（加100 l培养基）。 2、置37℃，5% CO2孵育过夜，倒置显微镜下观察。 3、每孔加入10 ul 待检测药物溶液， 37℃孵育。 4、每孔加入10 ul MTS溶液，37℃孵育1-4 小时。 5、测定490 nm各孔的吸光值。 5、同时设置空白孔（培养基和MTS溶液，无细胞），对照孔（不加药培养基和MTS溶液，有细胞），每组设定3-5复孔。 结果分析 ： 细胞活力计算： 将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。 细胞活力% =（加药细胞OD-空白OD/对照细胞OD-空白OD）×100 数量测定使用方法： 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。 2、按比例(例如：1/2比例) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5 个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。 3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加MTS试剂培养一定时间后测定O.D值， 制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，O.D值为纵坐标(Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入MTS后的培养时间)。
细胞增殖实验word版
细胞增殖检测方法 细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。目前细胞增殖检测主要分为五类：DNA合成检测、代谢活性检测、细胞数量检测、细胞增殖相关抗原检测和ATP 浓度检测。在这些方法中作何选择，主要取决于所研究的细胞类型和研究方案。 1.DNA合成检测 这是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。该法是将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。该方法耗时长，而且有个明显的弊端就，即使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。不过，可以使用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。但这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。该方法的优点就是不再需要放射性物质。BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。 2.代谢活性检测 检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。 四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1。MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。因此，MTT 主要作为终点检测方法。其他三种盐与Alamar Blue一样，都是可溶且无毒。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子；WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色；Alamar Blue 的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞就能够检测到。四唑盐和Alamar Blue氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方便。它们适用的检测仪器包括：标准分光光度计、
细胞增殖的练习题及答案
< 细胞的增殖作业 一、选择题： 1、在一个细胞周期中，最可能发生在同一时期的是（） A．着丝点的分裂和细胞质的分裂 B．染色体数加倍和染色单体形成 C．细胞板的出现和纺锤体的出现D．染色体复制和中心粒复制 2．科学家用15N的硝酸盐作为标记物浸泡蚕豆幼苗，追踪蚕豆根尖细胞分裂情况，得到蚕豆根尖分生区细胞连续分裂数据如下，则下列叙述正确的是（） < A．高尔基体、线粒体、叶绿体在蚕豆根尖细胞分裂过程中活动旺盛 B．蚕豆根尖细胞的DNA分子结构稳定性最低的时期有0—2h、—、— C．基因重组可发生在— D．蚕豆根尖细胞分裂的一个细胞周期为 3．下列有关“观察植物细胞有丝分裂”实验现象的叙述，其中错误的是（）) A．分生区的细胞呈正方形 B．根尖的整体呈乳白色，尖端（根冠）略显淡黄 C．处于分裂前期的细胞均无核仁 D．向左下方略移动装片，图像向右上方移动 4．种子萌发时，在利用光能之前，不会发生下列哪种现象（） A．细胞分化B．细胞分裂 C．细胞呼吸D．利用无机物合成有机物 5．有关细胞分化的叙述，正确的是（） < A．分化只发生在人的胚胎时期 B．分化过程中，细胞器种类和数量不会发生改变 C．分化过程中遗传物质发生了改变 D．生物体生长发育过程是细胞发生分化的过程 6．癌细胞属于恶性分化的细胞，表现为（） A．细胞表面糖蛋白减少B．存在大量游离核糖体 C．细胞代谢速率下降D．细胞含水量急剧下降 7．下图中甲—丁为某动物（染色体数=2n）睾丸中细胞分裂不同时期的染色体数、染色单体数和DNA分子数的比例图，关于此图叙述中错误 ．．的是（） [
& A ．甲图可表示有丝分裂前期 B ．乙图可表示减数第二次分裂前期 C ．丙图可表示有丝分裂后期 D ．丁图可表示减数第二次分裂末期 8．用高倍显微镜观察洋葱根尖细胞的有丝分裂。下列叙述正确的是（ ） A ．处于分裂间期和中期的细胞数目大致相等 B ．视野中不同细胞的染色体数目可能不相等 " C ．观察处于分裂中期的细胞，可清晰的看到赤道板和染色体 D ．细胞是独力分裂的，因此可选一个细胞持续观察它的整个分裂过程 9．菠菜根的分生区细胞不断分裂，对该过程的叙述正确的是（ ） A ．细胞分裂间期，DNA 复制，DNA 和染色体的数目增加一倍 B ．细胞分裂前期，核膜和核仁逐渐消失，中心体发生星射线形成纺锤体 C ．细胞分裂中期，染色体形态固定、数目清晰，适于染色体计数和形态观察 D ．细胞分裂末期，在细胞中央赤道板的位置出现一个由薄细胞构成的细胞板 " 10．处于有丝分裂过程中的动物细胞，细胞内 的染色体（a ）数、染色单体（b ）数、DNA 分子（c ）数可表示为如图所示的关系，此 时细胞内可能发生 （ ） A ．中心粒发出星射线 B ．染色体的着丝点分裂 C ．细胞板形成 D ．DNA 的复制 ） 11．取生长健壮的小麦根尖，经过解离、漂洗、染色、制片过程，制成临时装片， 放在显微镜下观察。欲观察到细胞有丝分裂的前、中、后、末几个时期，则 （ ） A ．应该选一个处于间期的细胞，持续观察它从间期到末期的全过程 B ．如果在低倍镜下看不到细胞，可改用高倍镜继续观察 C ．如果在一个视野中不能看全各个时期，可移动装片从周围细胞中寻找 D ．如果视野过暗，可以转动细准焦螺旋增加视野亮度 12．下列表示四种植物细胞的细胞周期，如果从四种细胞中选择一种用来观察细 胞的有丝分裂，最好选用 （ ）
细胞增殖检测MTT法
细胞增殖检测：MTT法 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO 来溶解。 MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞 同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色 培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 4、比色
选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 二、注意事项 1、选择适当得细胞接种浓度。 2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！ 三、举例 各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式： Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*（3.1-（3-0.95-0.06）/4）=-3.6025 IC50=0.00025
细胞增殖毒性实验步骤cck8知识讲解
如有侵权请联系网站删除 细胞增殖■毒性实验步骤 1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖■毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、 15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶 （0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全 柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1、倒去培养瓶内的培养液； 2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 3）加入胰酶500ul/0.5ml 2?10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脫落）； 4）加入含10%FBS勺培养液1?1?5ml ［培养液：胰酶二（2?3） :1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 6）将单细胞悬液吸入10?15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清 液； 7）加入含10%FBSffl胞培养液1?2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 8）吸取20』细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养 24-72小时（37 C, 5%CO2,使细胞贴壁； 10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物； 11 ）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）； 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 12）向每孔加入10让（约10%） CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）；